Gentier96全自动医用PCR分析系统检测HBV-DNA及HCV-RNA的性能验证

目的 对实验室新购入设备Gentier96全自动医用PCR分析系统使用HBV-DNA及HCV-RNA定量检测项目进行性能验证。方法 通过检测HBV-DNA及HCV-RNA定量检测项目,对精密度、正确度、线性范围及抗干扰能力进行验证和评价。结果 该系统检测低水平和高水平HBV-DNA的实验室变异系数(CV)分别为4.12%、1.27%。低水平和高水平HCV-RNA的实验室变异系数(CV)分别为4.75%、1.46%。HBV-DNA国家标准物质GBW(E)090137(浓度编号S5)靶值的对数值3.15、GBW(E)090139(浓度编号S2)靶值的对数值6.66。HCV-RNA国家标准物质GBW(E)090140(浓度编号S5)靶值的对数值3.34、GBW(E)090142(浓度编号S3)靶值的对数值5.64,实测值与靶值的差异均在±0.4对数值范围内。该分析系统HBV-DNA定量检测在4.69×10~2.04×109范围内呈线性,线性回归方程为Y=0.9884X+0.1452,R2=0.9994。HCV-RNA定量检测在3.47×10~2.33×107范围内呈线性,线性回归方程为Y=0.9548X+0.3302,R2=0.9997。干扰物质血红蛋白(Hb)样本与对照组样本偏倚<±7.5%,表明常见抗干扰物质血红蛋白(Hb)浓度≤2g/dL时对HBV-DNA和HCV-RNA定量检测结果无影响。结论 Gentier96全自动医用PCR分析系统检测HBV-DNA及HCV-RNA已达到相关标准要求,可用于样本检测。

HCV RNA RT-PCR测定室间质量评价的研究

目的 建立国内HCVRNART PCR测定的室间质量评价系统。方法 室间质量评价研究工作采用的质控血清盘由 10支冻干质控血清组成 ,其中包括 2份强阳性、 2份弱阳性、 2份阴性和一个 5倍倍比稀释系列 (4份 )。将血清盘寄发给各参评实验室并要求各个实验室按照规定时间检测、回报结果 ,然后对结果进行统计分析。结果 多数参评实验室存在不同程度的假阳性和假阴性的问题。 2份强阳性标本检出率均为 87 5 % ,弱阳性标本 (含量分别为 6 76× 10 4 和 3 81× 10 4 拷贝数 /ml)检出率分别为 45 83%和 2 5 0 0 % ;阴性样本的假阳性率分别为 12 5 0 %和 16 6 7% ,2份阴性标本测定均正确 37家 ,占77 0 8% ;稀释系列测定正确的有 16家实验室 ,占 33 33 % ,仅 2家实验室稀释系列测定完全正确 ,5家实验室既存在假阴性又存在假阳性问题。结论 许多临床实验室虽然建立了PCR检测方法 ,但却存在特异性和灵敏度问题 ,有必要定期进行室间质量评价 ,保证该项目的检测质量。

检测HCV RNA的PCR试剂质控试行参考品的建立

选慢性丙型肝炎病人中HCVRNA含量不等的阳性血清作为阳性标准，采用选自HCV基因5’端非编码区的不同引物来扩增病毒基因，扩增产物与分子量标准进行比较，部分产物用酶切初步分析进行确证。选国家HCV抗体诊断试剂盒临床验证参考品中的阴性样品作为阴性标准，经反复检测显示HCVRNA为阴性。选强阳性血清经5%小牛血清稀释作为灵敏度标准，检测范围为10－5～10－7。应用该参考品对北医肝病研究所的三批HCVRNA诊断试剂盒进行检测，阳性和阴性标准均符合要求，灵敏度为10-5～10-6。

RT-PCR检测HCV-RNA及基因分型的研究

目的研究HCV基因分型的临床意义。方法应用RT－PCR方法检测HCV－RNA。结果150例献血员中抗-HCV6例阳性占40％，应用RT－PCR方法检测HCV－RNA10例阳性占6．6％，对其进行基因分型，其中HCV－Ⅱ型占89％，HCV-Ⅲ型占11％。结论说明我国人群HCV感染以Ⅱ型为主。12例抗-HCV阳性母亲及新生儿的HCV基因分型同属Ⅱ型，证明HCV母婴垂直传播存在。基因分型诊断为选择药物治疗提供科学依据。

荧光定量PCR技术在检测HCV-RNA中的应用

目的 评价荧光定量ＰＣＲ技术测定ＨＣＶ－ＲＮＡ水平的价值，探讨ＰＢＭＣ中检出ＨＣＶ－ＲＮＡ的意义。方法 采用荧光定量ＫＲ及ＲＴ－ＰＣＲ技术同时检测８７例血液透析患者的血清和淋巴细胞中ＨＣＶ－ＲＮＡ。结果血清、淋巴细胞中ＨＣＶ－ＲＮＡ的荧光定量ＰＣＲ检出率（４９．４％、６９．０％），分别高于相应标本中ＨＣＶ－ＲＮＡ的ＲＴ－ＰＣＲ阳性率（３３．３％、３５．６％）（Ｐ ＜０．０５）。血清、淋巴细胞中同时检出ＨＣＶ－ＲＮＡ的一致率，荧光定量ＰＣＲ法（３１．０％）显著高于ＲＴ－ＰＣＲ定性法（６．９％）（Ｐ＜０．００１）． 荧光定量ＰＣＲ法，淋巴细胞中ＨＣＶ－ＲＮＡ检出率高于血清（Ｐ＜０．０１）。结论 与 ＲＴ－ＰＣＲ相比，荧光定量ＰＣＲ技术检测 ＨＣＶ－ＲＮＡ敏感性较高，对ＰＢＭＣ内ＨＣＶ－ＲＮＡ检测有利于提高ＨＣＶ检测的阳性率。

一步短片段RT-PCR方法检测HCV RNA

目的 为了简化传统RT PCR操作步骤。方法 利用TaqDNA聚合酶具有一定的反转录酶活性的特点 ,对HCVRNA短序列进行反转录 ,并对合成的cDNA进行PCR扩增。结果 本法简化了传统RT PCR操作步骤 ,提高了结果的稳定性。结论 本法可用于HCVRNA以及其它RNA的临床诊断。

不同浓度HBV DNA和HIV-1 RNA对多重PCR检测HCV RNA的干扰验证分析

目的探讨多重聚合酶链式反应(PCR)技术在献血者血液标本中不同浓度HBV DNA和(或)HIV-1 RNA对低浓度HCV RNA检测结果的影响。方法采用阴性血浆对HCV RNA标准物质、已定量的HBV DNA和HIV-1 RNA血浆进行稀释,配制成2种病毒或3种病毒的混合液,HCV RNA浓度稳定在20.4 IU/mL[该PCR检测系统95%平均检测下限(LoD)的3倍],HBV DNA浓度为20 IU/mL、200 IU/mL、2000 IU/mL和(或)HIV-1 RNA浓度为50 copies/mL、500 copies/mL、5000 copies/mL的混合液,同时设置对照组(只有3×LoD的HCV RNA溶液),模拟献血者血液样本,分别在Roche Cobas s201核酸检测系统进行单检模式和混样模式(与5个阴性标本混合)至少检测20次,统计分析不同浓度病毒核酸检测Ct值差异以及单检模式与混检模式的漏检率。结果不同浓度HIV-1 RNA和(或)HBV DNA在单检模式下对HCV RNA检测的Ct值差异无统计学意义(P>0.05);HCV RNA在单检模式下的Ct值中位数36.60(36.20,37.10)明显低于混检模式的Ct值39.30(38.60,40.00)(P<0.05),10个分组中HCV RNA在单检模式的漏检率均为0%,而在混检模式的平均漏检率为12.62%,差异有统计学意义(P<0.05);此外,浓度20 IU/mL的HBV DNA进行单检的漏检率为7.55%,进行混检的漏检率为81.4%;50 copies/mL的HIV-1 RNA和20.4 IU/mL的HCV RNA在单检时漏检率为0%,而混检漏检率分别为28.57%和12.62%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论不同浓度HBV DNA和HIV-1 RNA对多重PCR检测HCV RNA结果无影响,但弱阳性HCV RNA、HBV DNA和HIV-1 RNA标本在单检模式下的漏检率低于混检模式,为提高血液安全,血液核酸检测应尽可能采用单检模式。

化学发光法检测抗-HCV-IgG与荧光定量PCR检测HCV-RNA在丙型肝炎诊断中的临床评价

目的:探讨化学发光法(CLIA)检测抗-HCV-IgG与荧光定量PCR检测HCV-RNA在丙型肝炎(HCV)诊断中的临床价值。方法对106例HCV待查者血清标本,同时采用CLIA法检测抗-HCV-IgG抗体和荧光定量PCR检测HCV-RNA载量。结果106份标本中HCV-RNA阳性率为27.4%(29/106),抗-HCV-IgG阳性率为25.5%(27/106),符合率为82.8%(24/29),经χ2检验,两种方法的阳性率差异无统计学意义(P>0.05),抗-HCV-IgG阳性检出率随着HCV-RNA病毒载量的增高而升高。结论 CLIA法检测抗-HCV-IgG抗体与荧光定量PCR检测HCV-RNA在丙型肝炎诊断中无显著差异,但两者均存在一定的局限性,联合运用能有效降低单独使用的漏检风险,提高检出率,为临床诊断HCV感染提供可靠性依据。

用PCR分析HCV－RNA NS5部分序列变异

用ＰＣＲ分析ＨＣＶ－ＲＮＡＮＳ５部分序列变异魏来，王宇，陈红松，陶其敏（北京医科大学人民医院肝病研究所，北京１０００４４）对丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ｃＤＮＡ的序列分析是验证ＨＣＶ基因分型，确定新的型与亚型的基础￣［１］．经典的序列分析方法需经繁琐的分子...

荧光定量巢式逆转录PCR(FQ-nRT-PCR)在检测HCV-RNA中的意义

目的:采用荧光定量巢式逆转录聚合酶链反应(FQ-nRT-PCR)检测丙型肝炎患者外周血清HCV-RNA,探讨HCV-RNA的临床应用价值。方法:用FQ-nRT-PCR和酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测192例HCV感染患者血清,比较HCV-RNA和抗-HCV的临床意义。结果:192例丙型肝炎患者血清标本中,HCV-RNA检出率为75.53%(145/192),抗-HCV检出率为91.66%(176/192)。急性丙型肝炎患者HCV-RNA定量均值达5.21×106拷贝/ml,慢性肝炎次之,肝硬化相对偏低,为5.14×103拷贝/ml。结论:192例丙型肝炎患者抗-HCV检出率高于HCV-RNA检出率,但HCV-RNA对丙型肝炎的早期诊断具有灵敏度高、定量准、假阳性率低等优点,此外在病毒复制水平及抗病毒治疗的疗效评估方面具有重要的临床价值。

国产高敏HCV-RNA定量试剂与国产普敏及进口高敏试剂一致性分析

目的分析国产高敏HCV-RNA核酸检测试剂与国产普敏、进口高敏HCV-RNA核酸检测试剂的一致性。方法选取2021年1月至9月中国科学技术大学附属第一医院感染病医院检验科收录的丙肝患者临床样本165例,分别采用国产高敏HCV-RNA核酸检测试剂A与国产普敏HCV-RNA核酸检测试剂B进行HCV-RNA定量检测,对两种HCV-RNA定量检测试剂定量结果均为阳性的样本(≥500 IU/mL,87例)进行Bland-Altman一致性分析;选择稀释样本(15~500 IU/mL,60例),采用国产高敏HCV-RNA核酸检测试剂A与进口高敏HCV-RNA核酸检测试剂C进行HCV-RNA平行定量检测,对两种HCV-RNA定量检测试剂定量结果进行Bland-Altman一致性分析。结果Bland-Altman分析显示试剂A与试剂B定量值差值均值为(-0.0326)log_(10)IU/mL,95%置信区间为(-0.4626~0.3974)log_(10)IU/mL,95.4%(83/87)的样本检测值在95%置信区间内。试剂A与试剂C定量值差值均值为0.1800 log_(10)IU/mL,95%可信区间为(-0.0907~0.4506)log_(10)IU/mL,96.67%(58/60)的样本检测值在95%置信区间内。结论国产高敏定量试剂A与国产普敏定量试剂B在≥500 IU/mL检测结果具有一致性,国产高敏定量试剂A与进口高敏定量试剂C在15~500 IU/mL具有检测结果高度一致性。

混合血浆荧光定量PCR法筛查献血者HCV RNA的初步研究

目的 研究用荧光定量PCR方法检测混合血浆中的HCV RNA。方法 用12人份混合血浆为基本单元提取HCV RNA,逆转录,四份逆转录产物混合上样于HCV PCR扩增反应体系,用PE5700荧光定量PCR仪检测。HCV RNA质控品检测灵敏度。结果 检测4 128份标本中1例HCV RNA阳性,HCV RNA冻干质控品检测灵敏度为105 IU/ml。结论 48人份混合血浆荧光定量PCR法可用于血液筛查。

荧光定量PCR检测HCVRNA的测量不确定度评定与应用分析

目的:分析研究荧光定量PCR(FQ-PCR)测定HCV RNA的测定不确定度,并进行评定及应用分析。方法:FQ-PCR分析仪选取2个RNA结果呈现阳性的临床样本,分别重复测定10次,对测定HCV RNA测量整个过程分析,确定以及简化测定不确定度的来源,采取不确定度A类评定法和B类评定法,确定合成以及扩展不确定度。结果:其来源包括有批内重复性、湿度时间、方法偏倚、批间重复性以及消毒之前和以后等相关原因。其各个分量当中,由湿度时间造成不确定比例最大,然而批间重复性试验最小。结论:利用FQ-PCR测定HCV RNA测量不确定度的临床研究,对各个实验室检查结果表现趋于一致具有重要意义,能够使来自不同临床实验室的检查结果具有可比性。

实时荧光定量PCR检测特殊人群中HCV-RNA的研究

[目的]探讨HCV在特殊人群中的流行和干扰素治疗效果对HCV-RNA含量的影响。[方法]收集223份抗-HCV阳性血清并跟踪观察和用荧光定量实时荧光定量PCR法检测HCV-RNA的含量。[结果]在141份抗-HCV阳性血清中,58份实时荧光定量PCR阳性,阳性符合率为41.13%,在86份有输血史患者中39份实时荧光定量PCR阳性,阳性率为45.35%,17份有家族遗传史患者中11份实时荧光定量PCR阳性符合率为64.70%。在38例不明原因感染者中有8份实时荧光定量PCR阳性,阳性率为21.05%(2χ=16.21Р=0.000)。58例实时荧光定量PCR阳性的病人经治疗两年后,39份有输血史患者,转阴24例,转阴率61.53%。11份有家族遗传史患者中6例转阴,转阴率54.54%。在8例不明原因感染者中有5例转阴,转阴率62.24%。[结论]不同的传染途径在RNA的含量和治疗的预后有差异。

ELISA法抗-HCV与荧光定量PCR HCV-RNA检测结果对比分析

目的:探讨丙型肝炎酶联免疫吸附试验(ELISA)法和荧光定量PCR HCV-RNA检测血清中抗-HCV与HCV-RNA的结果。方法:采集102例慢性丙肝患者的血清,用ELISA法和荧光定量PCR HCV-RNA法进行检测。结果:102例患者中,抗-HCV(+)组74例,检出率72.5%(74/102),抗-HCV(-)组28例,检出率27.5%(28/102),在HCV-RNA检测,74例中54例病毒含量≥104 IU/mL,检出率73.0%(54/74),28例中3例病毒含量≥104 IU/mL,检出率10.7%(3/28),两组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:联合检测抗-HCV与HCV-RNA可提高丙肝患者的检出率,通过测定结果的对比,抗-HCV诊断丙肝患者有漏诊现象,荧光定量PCR HCV-RNA的特异性高,敏感度强,是临床诊断丙型肝炎的重要依据。

HCV RNA载量与肝脏组织损伤的关系

目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)RNA复制水平与肝功能丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)之间的相互关系。方法收集1182例疑似丙肝病人血清标本,采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测HCV RNA,利用酶动力法测定ALT、AST,采用ELISA测定抗HCV抗体。数据采用SPSS16.0统计软件处理。结果病人血清样本中,HCV RNA阳性801例(64.8%),其中抗HCV阳性766例(95.6%);HCV RNA阴性381例(32.2%),其中抗HCV阳性100例(26.2%)。HCV RNA阳性样本中同时抗-HCV阳性者ALT,AST异常率分别为59.0%和60.8%;抗-HCV阴性者为31.4%和34.2%。HCV RNA阴性样本中同时抗-HCV阳性者ALT,AST异常率分别为24.0%和15.0%,抗-HCV阴性者为13.9%和12.1%。HCV RNA含量与ALT、AST水平明显成正相关,r=0.62,P<0.05。结论 HCV RNA含量与肝组织损伤程度成正相关。

Eu标记RT-PCR检测丙型肝炎病毒RNA

目的 采用一种新的铕螯合物BHHCT ,制备高灵敏度荧光标记物 ,建立检测丙型肝炎病毒 (HCV)RNA的方法。方法 采用柱层析纯化的方法抽提血清中HCVRNA。以 5′端带有生物素的引物进行RT PCRTth酶一步法扩增 ,通过固定于微孔板上的捕获探针与带有生物素的PCR扩增产物杂交后 ,利用标记有铕的链霉亲合素与生物素的特异性结合 ,将铕连接到待测核酸上 ,在特定波长的激发光激发下发出荧光 ,进行检测。结果 铕标记检测法与酶标法的变异系数、敏感性、特异性分别为10 .43%、10 0 %,10 0 %与 16 .2 5 %,94%,10 0 %。结论 Eu标记RT PCRTth酶一步法检测HCVRNA ,具有敏感、特异、快速、重复性好、不受环境因素影响和无溴乙锭污染等优点 ,可望取代酶标法及电泳法。

丙型肝炎病毒RNA含量与抗-HCV及ALT的关系探讨

目的了解丙型肝炎病毒核糖核酸(HCV RNA)与抗丙肝病毒抗体(抗-HCV)及丙氨酸氨基转移酶(ALT)的关系。方法83份确诊为丙肝的住院患者样本作观察组,95份健康体检人群样本作对照组,用荧光定量逆转录聚合酶反应(FQ-RT-PCR)检测这两组样本的HCV RNA含量,并同时采用ELISA法检测抗-HCV,用全自动生化检测仪测定ALT水平。结果观察组HCV RNA含量高于80 copy／ml者67份,抗-HCV阳性者64份,经进一步相关性分析,两者有很好的相关性(r=0．587,P=0．002);83份病例中有58份ALT异常,其异常率随HCV RNA含量的升高而增加。经统计学分析,ALT异常例数和正常例数差异有显著性(P<0．01);ALT水平和HCV RNA含量无相关性(r=0．175,P=0．095);而ALT异常率与HCV RNA含量呈正相关(r=0．903,P=0．036)。结论HCV RNA含量与抗-HCV同时检测可提高临床对丙型肝炎的诊断。HCV RNA是反映HCV复制的可靠指标,结合ALT的结果可帮助临床了解HCV在体内的复制状况及肝脏的炎症状态。FQ-RT-PCR法检测HCV RNA具有非常好的临床应用价值。

实时荧光定量检测HCV RNA含量的临床意义

目的:建立实时荧光定量RT-PCR(RFQ-RT-PCR)检测HCV RNA含量的方法,初步探讨HCV RNA含量变化与病情的相关性. 方法:HCV抗体阳性样本80例,包括慢性肝炎(CH) 39例,肝硬化(LC)23例,肝癌(HCC)18例,献血员样本40例为正常对照.在HCV基因组5’非编码区(5’UTR)设计特异性引物和一对杂交探针,构建相应基因片段载体,体外转录RNA作为标准品,根据其建立的标准曲线对血清HCV RNA进行定量,同时用传统的套式RT-PCR进行定性分析. 结果:本法检测HCV RNA含量的线性范围为1012-104copies/L,批内和批间重复性测定的v分别为1.68-5.97%和6.40-10.58%.在HCV抗体阳性患者中, 肝硬化和肝癌患者的HCV RNA含量显著高于慢性肝炎患者(7.75±0.29,7.86±0.32 vs 4.67±0.41,P<0.05), 而且HCV RNA含量与ALT水平呈正相关(r=0.89, t=8.29,P<0.05). 结论:RFQ-RT-PCR检测HCV RNA含量具有较好的灵敏度和特异性,其含量与丙型肝炎患者的病情变化及严重程度有一定相关性.

肝炎患者血清HCV-RNA与抗-HCV检测的相关性研究

目的:探讨抗-HCV与HCV-RNA及ALT的相关性及临床应用价值。方法:ELISA方法检测抗-HCV,实时荧光定量PCR检测HCV-RNA。结果:检测可疑HCV感染者200例,其中152例抗-HCV阳性,124例HCV-RNA阳性。HCV-RNA阳性患者中抗-HCV的阳性率显著高于抗-HCV阳性患者中HCV-RNA的阳性率(P<0.05)。ALT水平与HCV病毒载量呈正相关(r=0.996,P<0.01)。结论:同时检测抗-HCV和HCV-RNA可提高HCV感染诊断的阳性率,检测HCV-RNA及ALT对抗病毒治疗的疗效评价及治疗时间有重要意义。