广州无偿献血人群中丙型肝炎抗体阳性者HCV基因型与病毒载量的关系

目的:了解最新广州地区无偿献血人群丙型肝炎病毒(HCV)基因型与病毒载量的关联性。方法:收集2008～2011年广州地区无偿献血人群中抗-HCV阳性标本605份,采用荧光定量PCR(Q-PCR)的方法对其进行核酸及病毒载量检测,阳性标本作NS5B基因扩增;核苷酸序列测定后运用DNASTAR、BioEdit和Mega4.0等软件作序列分析和基因分型,采用SPSS16.0软件对病毒载量与基因型(亚型)的关联性进行分析。结果:337份HCV RNA阳性的标本扩增出NS5B基因320份,HCV 1b、6a、3a、2a、3b、1a、6n比例依次为45.00%、33.44%、8.75%、7.81%、4.38%、0.31%和0.31%。HCV1b与2a、3a、6a、6a与2a、3a之间病毒载量存在显著差异:HCVba病毒载量高于2a、3a和6a,HCV6a病毒载量高于2a和3a。结论:广州地区无偿献血人群中HCV1b和6a为主要亚型且其病毒载量高于其他亚型。

广州地区无偿献血人群HCVE1和NS5B基因的测序和分型

目的了解广州地区无偿献血人群丙型肝炎病毒部分基因的核苷酸序列和基因型分布。方法收集广州地区无偿献血人群中抗-HCV阳性标本201份,采用荧光定量PCR(Q-PCR)的方法对其进行核酸检测,阳性标本同时作HCVE1和NS5B基因扩增;核苷酸序列测定后运用DNASTAR,B ioEd it,M ega4.0等软件作序列分析和基因分型。结果 201份抗-HCV阳性标本的HCV RNA阳性率为54.23%(109/201),其中男性的HCV RNA阳性率为63.19%(91/144)、女性为31.58%(18/57)(P<0.05)。109份HCV RNA阳性的标本全部扩增出E1和NS5B基因,基因分型显示其HCV基因型比例依次为1b(46.79%)、6 a(33.03%)、3 a(10.09%)、2 a(5.50%)、3b(3.67%)、1 a(0.92%)。结论广州地区抗-HCV阳性的无偿献血人群HCV RNA阳性率男性高于女性,HCV毒株以1b和6 a亚型最多见。

应用限制性显示技术制备HCVcDNA诊断基因芯片的初步研究

制备丙型肝炎病毒 (HCV)检测芯片并进行验证、初步检测质量评价。采用限制性显示 (Restrictiondisplay ,RD)技术制备芯片探针 ,从载体pCV_J4L6S中切出HCV全长cDNA ,Sau3AⅠ酶消化 ,所得的限制性片段进行RD_PCR扩增 ,经聚丙烯酰胺电泳 (PAGE)结合银染法进行分离。切胶回收后作 3次PCR ,得到较纯净的HCVcDNA限制性片段。扩增后的产物克隆至pMD18_T载体进行快速鉴定。将筛选出的限制性片段打印在氨基修饰的玻片上制备成检测芯片进行杂交验证分析 ,对芯片检测进行优化、初步的质量评估。运用RD技术 ,得到 2 4个 2 0 0～ 80 0bp、大小均一的基因片段 ,序列分析表明 ,均属于HCV特异基因 ,可以作为诊断芯片探针 ;杂交、测序结果显示 ,芯片检测的敏感性、特异性、准确度、重复性、线性等指标均佳。利用RD技术制备基因芯片探针是一种快速、简便的实用方法 ;制备的诊断芯片可以用于检测HCVRNA ,具有敏感、检测结果较为可靠的优点。

广州地区献血人群中HCV感染者HCV基因分型及感染途径研究

目的了解广州地区献血人群中HCV感染者的感染途径及其HCV基因型/亚型。方法收集2009年10月-2013年7月在广州献血并成功随访到的抗-HCV ELISA呈反应性的献血者标本296(人)份,以转录介导的扩增(TMA)方法检测其HCV RNA;对HCV RNA阴性标本采用RIBA法确证,对HCV RNA阳性标本,膜吸附法提取HCV RNA经RT-PCR扩增E1和NS5B基因后进行sanger核苷酸序列测定。运用DNASTAR,Bio Edit,Mega5.0等软件作序列分析和基因分型。对献血者HCV感染途径的调查采用问卷调查的方法。结果 296名HCV感染者中,有197人(157例RNA阳性+40例RIBA阳性)确证为HCV感染者,按照HCV感染途径分为4组:静脉吸毒组8.63%(17/197)、输血或者血制品组17.26%(34/197)、其他途径组(除静脉吸毒和输血或血制品以外的传播途径,如手术、纹身等)13.71%(27/197)和感染途径不明组60.40%(119/197)。感染者不同年龄的比例为:18岁-<25岁32.49%(64/197),25岁-<35岁26.39%(52/197),35岁-<45岁29.95%(59/197),45岁-54岁11.17%(22/197),不同感染途径中不同年龄的分布总体比较具有明显差异(P<0.05)。HCV RNA阳性者157例,其中153人成功获得HCV基因分型:HCV-1b、2a、3a、3b和6a,分别占58.17%(89/153)、4.58%(7/153)、7.84%(12/153)、3.27%(5/153)和26.14%(40/153);静脉吸毒和输血或者血制品2组间HCV基因型分布有明显差异(P<0.01):静脉吸毒组中HCV-6a占58.82%(10/17),输血或血液制品组中HCV-1b占54.16%(13/24)。结论目前广州献血人群中HCV感染者的感染途径多数尚不明确;HCV毒株以HCV-1b和6a亚型最多见,静脉吸毒者中6a的流行率较高,有输血或血制品史的献血者中1b亚型的比例较高。

cDNA文库法在HCV-1b检测芯片研制中的应用

制备丙型肝炎病毒(HCV) 1b亚型诊断芯片并进行初步验证评价.采用cDNA文库法制备探针,用限制性内切酶Sau3AⅠ消化HCV 1b全长cDNA ,所得的酶切片段72℃补平加A ,AT克隆,PCR初步鉴定,并测序.将筛选出的片段打印在氨基修饰的玻片上制备成检测芯片并进行杂交验证分析.运用cDNA文库法,得到2 2个大小相对一致(2 5 0～75 0bp)的基因片段.序列分析表明,均属于HCV 1b基因,可以作为诊断芯片探针;样品标记采用限制性显示(restrictiondisplay ,RD)技术,标记后进行杂交.杂交结果显示,样品和诊断基因芯片杂交的敏感性和特异性均佳.批内和批间精密度CV值分别为5 4 %和6 8% ,表明用cDNA文库法收集片段是一种快速、简便制备芯片探针的实用方法.

剪切HCV RNA的HDV核酶的设计及活性测定

目的 探讨丁型肝炎病毒 (HepatitisDvirus ,HDV)核酶用于抗丙型肝炎病毒 (HepatitisCvirus ,HCV)基因治疗的可能性。方法 以HDV基因组核酶的假结样结构为基础 ,优化其茎Ⅳ区 ,改建其底物结合区 ,获得 3种针对HCVRNA的HDV核酶RzC1、RzC2 和RzC3 。体外转录获取含HCVRNA 5’ 非编码区 ( 5’ noncodingregion ,5’ NCR)及部分C区在内的底物RNA(HCVRNA 5’ NCR C) ,并进行 5’端放射性标记。在pH 7.5、37℃、Mg2 + 2 0mmol/L和去离子甲酰胺 2 .5mol/L等条件下 ,将核酶和底物按摩尔比 1 0 0∶1混合 ,在不同的时间点观察剪切百分率。结果 RzC1、RzC2 对底物的剪切百分率随时间延长而递增 ,90min时分别达 2 4.9%、2 0 .3% ;未观察到RzC3 有剪切活性。

HCVNS3基因片段酵母展示文库的构建和鉴定

HCV NS3特异的 CD4+T细胞反应与 HCV感染的良性转归相关 .为了筛选其 CD4+T细胞表位 ,构建了 HCV NS3基因片段酵母展示文库 .首先 DNase 不完全酶切 HCV NS3基因产生长度为 1 0 0～ 30 0 bp的随机片段 ,然后在它们两端加上含限制性内切酶 Bam H 作用位点的接头 ,再以接头序列作引物进行 PCR扩增 .最后扩增产物用 Bam H 酶切后与 Bam H 线性化的穿梭载体 p YD1连接 ,转化大肠杆菌 (E.coli) DH5α,共得到 2× 1 0 6个转化子 .转化菌落的 PCR扩增结果表明 ,约 50 %转化子含插入片段 .随机选择 5个插入片段测序 ,然后与 DNA序列数据库中的序列比较 .结果显示它们分别与 HCV NS3序列有 96%～ 99%的同源性 .用从转化菌落中提取的质粒转化酵母 (S.cerevisiae)菌株 EBY1 0 0 ,得到含 2× 1 0 5个插入片段的 HCV NS3基因片段酵母展示文库 .半乳糖诱导的酵母细胞通过和 FITC标记的抗体结合 ,用 FACS可以在 2 0 %的细胞表面检测到融合蛋白的表达 .

云南和山西无偿献血人群HCV部分基因的核苷酸序列测定及基因分型

目的了解云南和山西2地无偿献血人群丙型肝炎病毒(HCV)的基因型分布及其差异。方法采用荧光定量PCR(Q-PCR),对所收集的203份ELISA检测抗-HCV阳性的无偿献血者标本(云南102份,山西101份)做核酸检测,对核酸阳性的标本做E1基因扩增和测序;E1基因阴性者,进一步做NS5B基因扩增;采用DNASTAR、Bi-oedit和Mega4等软件对E1、NS5B基因进行分析及分子进化研究。结果203份ELISA检测抗-HCV阳性的无偿献血者标本中,云南102份标本经Q-PCR检测出核酸阳性55份,从中扩增出E1基因43份,补做NS5B基因扩增获得阳性结果8份;山西省101份标本经Q-PCR检测出阳性46份,从中扩增出E1基因33份,补做NS5B基因扩增获得阳性结果6份。云南省献血者HCV基因型(亚型)可分为7种:1b[7.84%(4/51)]、2a[13.73%(7/51)]、3a[17.65%(9/51)]、3b[41.18%(21/51)]、6a[7.84%(4/51)]、6n[9.80%(5/51)]和6v[1.96%(1/51)];山西省献血者HCV基因型(亚型)较简单,可分为3种:1b[89.74%(35/39)]、2a[7.69%(3/39)]和3b[2.56%(1/39)]。结论我国云南和山西2地无偿献血人群中的HCV基因型(亚型)的分布存在明显的差异。

绿色荧光蛋白与 HCV 核心蛋白的融合及在大肠杆菌中的高效表达

利用基因工程重组技术获得了绿色荧光蛋白（ｇｆｐ）基因与ＨＣＶ核心蛋白（ｃｏｒｅ）基因的嵌合体，并在大肠杆菌中高效表达了４８ｋＤａ的融合蛋白，经ＤｏｔＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ免疫活性分析证实，融合蛋白仍具有ｃｏｒｅ抗原的三个免疫活性部位，同时用荧光显微镜观察并用荧光光度计测定了大肠杆菌表达的融合蛋白的荧光光谱，结果证实，我们在大肠杆菌中表达的ＧＦＰｃｏｒｅ融合蛋白既能发射易于检测的绿色荧光，又具有ＨＣＶ核心蛋白的抗原活性，实现了用绿色荧光蛋白等分子标记抗原，为免疫诊断新方法的建立，打下了理论基础。

HCVcore真核表达质粒pcDNA3.1(-)/core的构建

目的构建HCVcore基因真核表达质粒,为进一步研究和解析HCV诱发人不死化肝细胞癌化的机制,HCV感染的检测及疫苗和药物研发做好前期基础。方法将含HCV全长基因的pBRTM/HCV1 -3011质粒于大肠杆菌JM109内扩增;提取pBRTM/HCV1-3011质粒;从pBRTM/HCV1-3011质粒中PCR扩增出HCVcore片段并将其插入pGEM-T克隆载体;再与表达载体pcDNA3. 1( -)重组,以得到重组的真核表达载体pcDNA3. 1 ( -) /core;最后限制性酶切鉴定HCVcore表达载体。结果从pBRTM/HCV1-3011质粒中扩增出的HCVcore片段大小正确,经测序证明其碱基序列为编码目的基因的正确序列;凝胶电泳结果证明已将此片段克隆到pcDNA3. 1 /core内。结论 成功的构建了HCVcore基因的真核表达载体pcDNA3. 1( -) /core。

HCV C区基因片段的克隆、表达及纯化

目的研究 ＨＣＶ Ｃ区片段在大肠杆菌中的表达及纯化工艺。方法采用 ＲＴ－ＰＣＲ技术，从ＨＣＶ感 染者血清中克隆Ｃ区基因片段，插入ｐＥＴ２８ａ（＋）质粒中，并在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中表达。采用亲和层析或 Ｓａｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－２００柱层析纯化抗原。结果两种纯化工艺的收率分别为５８ｍｇ／Ｌ和９５ｍｇ／Ｌ发酵液。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示纯 度分别为９８％和９０％。ＥＬＩＳＡ检测纯化抗原具有较好的抗原性和特异性。结论两种纯化工艺简便，重组蛋白纯 度高，可用于ＥＬＩＳＡ试验。

HCV C-Fc基因转染的小鼠树突状细胞促进混合淋巴细胞反应的作用

目的 :观察HCVC Fc基因电穿孔法转染的小鼠树突状细胞(DC)功能的改变。方法 :分离小鼠骨髓单个核细胞与rmGM CSF和rmIL 4培养 1wk,对培养的细胞进行形态学观察 ,并用FACS检测细胞表面DEC2 0 5的表达。以通过质粒pcD NA3HCVC Fc电穿孔法转染培养的DC ,用间接免疫荧光染色测定转染细胞中HCVC Fc的水平 ;用混合淋巴细胞反应检测电穿孔法转染细胞的功能。结果 :培养 1wk后 ,得到具有典型DC形态的细胞 ,以质粒pcDNA3HCVC Fc为载体电穿孔法转染DC后 ,转染细胞中可检测到较高水平的HCVC Fc。与对照组相比较以电穿孔法转染的细胞能明显刺激混合淋巴细胞反应。结论 :小鼠骨髓单个核细胞加GM CSF和IL 4培养 1wk ,可生成大量的DC。质粒pcDNA3HCVC Fc转染培养的DC对T细胞刺激作用显著增强。

用连续长片段RT-PCR扩增HCV结构基因

目的与方法 :使用连续长片段 RT- PCR,扩增 HCV的结构基因。 结果 :利用连续长片段 RT- PCR技术 ,结合热启动和两段 PCR一次扩增出长 2 .3kb的 HCV结构基因和部分调控序列 ,并用测量分子质量和限制性酶切的方法进行了鉴定。 结论 :利用长片段 RT- PCR可一次扩增出 C、E1、E2基因和部分 5 - N TR。

严密型四环素调控系统调控的表达HCV-C基因双转基因小鼠模型的建立

目的制备严密型四环素调控系统调控下表达丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV-C)基因的双转基因小鼠,为进一步阐明核心蛋白Core与HCV感染所致的疾病以及与肝细胞癌发生的关系奠定基础。方法严密型四环素调控部分(ApoE-rtTA-tTS)转基因阳性鼠和反应部分(TRE-HCV-C)转基因阳性鼠交配产生仔鼠,经PCR和Southern blot分析筛选出阳性鼠,免疫组织化学检测HCV-C蛋白双转基因小鼠肝组织内表达情况及其肝脏的病理变化。结果得到了2只携带有两种基因(tTS和HCV-C)的双转基因小鼠,成功制备了严密型四环素调控系统的HCV-C双转基因小鼠。结论结果表明,所建立的严密型四环素调控系统在动物模型中是可行的和有效的,它消除了普通四环素调控系统存在的本底泄漏表达的缺点,是HCV-C基因功能研究及与肝细胞癌的关系的机制研究的一个有用工具。

徐州地区抗-HCV阳性献血者HCV基因检测分析

目的 通过对献血员抗HCV阳性标本的HCV RNA基因测序及荧光定量检测,分析献血员丙型肝炎病毒的基因分型及分布情况.方法 留取徐州地区无偿献血人群中抗HCV阳性标本100份样本（2011年9月～2012年1月）,进行HCV RNA基因扩增测序,通过PCR扩增有代表性的基因片段5NTR区,C区,NS5B区,再进行核苷酸序列测定.HCVRNA定量检测采用荧光定量聚合酶链反应（FQ PCR）.结果 100份标本中,HCV RNA阳性92例,90例HCV RNA分出亚型,亚型1b,2a,2b,3a,3b和6a比率依次为67.78％,26.67％,1.11％,1.11％,1.11％和2.22％.HCV RNA含量分布在102～108 copies/ml范围内.结论 徐州地区无偿献血人群中HCV RNA基因以1b和2a为主要亚型,分型率高于其他亚型;HCV RNA基因分型在性别之间无显著性差异;HCV RNA基因（亚）型与云南地区比较差异有统计学意义,1b（X2=41.67,P＜0.01）,3a（X2=12.97,P＜0.01）,3b（X2=45.64,P＜0.01）.

利用RD技术对HCV-1b基因片段的克隆与分析

目的 :利用限制性显示 (RD)技术对丙型肝炎病毒 1b亚型 (HCV 1b)基因片段进行克隆与分析。方法 :用限制性内切酶Sau3AⅠ消化HCV 1bcDNA ,所得的限制性内切酶片段物进行RD PCR扩增 ,扩增后的产物克隆至 pMD18 T载体并进行快速鉴定。 结果 :得到 2 0个大小均一 (2 0 0～ 10 0 0bp)的限制性片段 ,测序结果表明 ,属于HCV 1b基因。结论 :RD技术能快速收集大量长度适宜、大小相对均一的病毒基因片段 。

丙型肝炎病毒(HCV)膜区基因在系列血清中的变异研究

目的 研究HCV基因随时间推移产生的变化。方法 利用不同HCVE2区引物对 4例病人系列血清标本进行序列测定和比较 ,并用不同方法确定HCV基因型别。结果 用不同引物扩增、测序表明 4例病人基因均为 1b和 2a型基因 ,随时间推移发生型别转换 ,推测与混合感染有关 ,在 2型转换期有 1b/ 2a混合感染现象。同一病人同型HCV膜区基因随时间推移有核苷酸和氨基酸改变 ,但变异程度相对较小 ,但有一定规律性 ,表现为在膜区高变区有些氨基酸位点较保守 ,所测的两型HCV保守位点相同 ,在同一位点的氨基酸变化趋于相同。结论 本研究结果提示HCV基因变化是多层次的 ,首先是不同基因型变化 ,其次是基因本身序列变化 ,且变化具有一定规律性。

基于四环素调控系统的ApoE-rtTA/TRE-HCV-C双转基因小鼠的制备

目的为了丰富现有的四环素调控系统的小鼠资源库,同时也为更好地研究目的基因HCV-C的作用机制提供一个活体的动物模型,制备基于四环素调控系统原理的调控部分ApoE-rtTA的转基因小鼠,与反应部分TRE-HCV-C转基因小鼠,相互交配制作出双转基因小鼠。方法应用显微注射法将构建好的两种基因片段ApoE-rtTA及TRE-HCV-C分别注入超排的昆明母鼠的受精卵,再植入假母输卵管,出生动物及其后代经PCR初步筛选出阳性,将两者及阳性后代交配产生携带5只转基因鼠再经Western blot和RT-PCR在RNA和蛋白水平上进一步鉴定。结果产生了3只整合有ApoE-rtTA基因的首见鼠和125只阳性子代,以及产生了5只整合有TRE-HCV-C基因的首见鼠和16只阳性子代。PCR及Southern Blot证实上述阳性鼠确有转基因整合。将两者交配产生携带5只双转基因鼠。结论成功制备了携带有ApoE-rtTA及TRE-HCV-C转基因小鼠,建立了分别携带有这两种基因的鼠群,以及同时携带有两种基因的双转基因小鼠,为四环素调控系统提供了一个良好的通用型的调控动物模型,同时也可利用四环素调控系统来研究HCV中的C基因对小鼠的作用,也是HCV-C基因功能研究及与肝细胞癌的关系的机制研究的一个有用工具。

HCV E2蛋白诱导的体液免疫及CTL应答研究

应用PCR方法扩增出HCVE2基因编码417a.a～750a.a的DNA片段,克隆到原核表达载体pQE30 LacZ启动子下游,转化JM109菌株。在JM109菌株中诱导表达出N端含6个组氨酸的E2融合蛋白,用Ni-NTA-Superflow亲和层析柱纯化作为抗原免疫实验兔和BALB/c鼠。定期取免血,采用间接ELISA方法检测兔子体内针对E2的抗体水平和维持规律。结果显示,距初次免疫14d兔子体内已有抗体产生,直至免疫第55d抗体水平持续上升,之后抗体水平保持稳定,抗体滴度达到1:3200。六周后,取鼠脾脏制备淋巴细胞,定向刺激扩增后与经过重组真核表达质粒pCE2转染的P815细胞作用,利用LDH释放试验检测作用效果。在E:T=200:1的情况下,杀伤率超过30％。这些结果表明工程菌株表达的HCV E2蛋白具有良好的免疫原性,可以诱发免疫实验动物机体产生较高滴度的抗体及特异性CTL应答。由此我们认为E2蛋白是发展HCV预防工程蛋白疫苗的合适候选者。