HCV p7蛋白反式调节基因p7TP2的克隆化及生物信息学分析

目的:克隆HCV p7蛋白反式调节未知功能新基因p7TP2,构建其真核表达载体,并应用生物信息学初步探讨其结构及功能．方法:应用PCR技术从HepG2细胞提取的 cDNA扩增p7TP2基因,选用pGEM-T载体进行TA克隆,通过PCR,限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到真核表达载体 pcDNATM3．1／myc-His A,通过PCR,限制酶切分析进行鉴定,并应用生物信息学初步分析其物理化学性质、蛋白质结构域、功能及染色体定位．结果:成功从HepG2细胞提取的cDNA中扩增出p7TP2基因,编码区为495核苷酸(nt),编码产物为164氨基酸残基(aa),经核苷酸序列数据库(GenBank)同源序列的搜寻,与已知基因序列和蛋白序列之间没有显著同源性,属于未知功能新基因,并成功进行TA克隆,酶切、测序均正确,并进一步亚克隆至pcDNATM3．1／ myc-His A真核表达载体,生物信息学分析此基因位于8q24．3,Mr17 146．5,理论pI:9．26,半衰期为30 h(体外哺乳类网状细胞),属于不稳定蛋白,疏水指数较高,含有潜在的三个螺旋区域,四个β折叠,四个蛋白激酶C磷酸化位点, 一个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,5个N-肉豆蔻酰位点,预测可能为具有不紧密的球蛋白结构,具有信号肽及两个跨膜结构域．结论:发现了HCV p7反式调节新的靶基因, 构建了pcDNATM3．1／myc-HisA真核表达载体．

丙型肝炎病毒P7蛋白体外原核表达状况的研究

目的:扩增丙型肝炎病毒(Hepatitis Cvirus,HCV)P7蛋白基因,克隆到多个原核表达系统,观察P7蛋白在体外表达的情况,获取具有生物学活性的HCVP7重组蛋白。方法:设计扩增全长HCVP7基因片段的特异引物,以H/FL质粒DNA(含HCV1acDNA全长序列)为模板,通过PCR扩增全长HCV P7基因,定向克隆到pQE30、pGEX 4T-2、pET32a(+)3种不同类型的原核表达载体中。将重组后包含HCVP7基因的原核表达载体转化表达型大肠杆菌BL21(DE3)pLysS或SG13009(PREP4),并做异丙基硫化-β-D-半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定HCV P7蛋白原核表达的情况。结论:获得可溶性的重组蛋白GST-HCVP7和Trx-HCVP7,为进一步研究P7蛋白的生物学功能奠定基础。