丙型肝炎病毒NS3蛋白酶在酵母系统中的可溶性表达

利用毕赤酵母系统表达具有催化活性的丙型肝炎病毒 (HCV)NS3蛋白酶 .将PCR直接扩增的病毒NS3丝氨酸蛋白酶基因和重组的带有辅酶的单链NS3 NS4A蛋白酶基因 ,分别插入表达载体pPICZαA的EcoRⅠ和XbaⅠ克隆位点 ,转化毕赤酵母GS115 ,可溶性表达NS3蛋白酶和单链NS3 4A蛋白酶 ;ELISA法测定表达蛋白酶的抗原性 ;原核高效表达载体pBVIL1表达酶切底物NS5A B片段 ,体外与蛋白酶共同温育 ,SDS PAGE鉴定蛋白酶催化活性 .载体测序结果表明 ,重组载体pPICZαA NS3和pPICZαA NS3 4A中的目的基因序列插入正确 ;SDS PAGE结果显示 ,培养物上清中存在分泌型目的蛋白带 ;ELISA结果证实 ,表达蛋白与HCV阳性血清有结合活性 ;蛋白酶与底物NS5A B片段不同作用时间的SDS PAGE ,看到约 2 4kD处底物条带的分解 .说明用毕赤酵母表达系统成功地表达了可溶性HCVNS3和单链NS3 4A蛋白酶 ;两种结构形式的蛋白酶在体外系统中都有催化活性 ,同时也都具有抗原性 .该研究为大量和方便地获得有催化活性的HCVNS3蛋白酶提供了有效途径 .

纤细齿梗孢丝氨酸蛋白酶cDNA克隆及其序列分析和表达

纤细齿梗孢Olpitrichum tenellum是一种寄生在轮枝镰孢菌Fusarium verticillioides上的活体营养菌寄生真菌。丝氨酸蛋白酶在菌寄生过程可能起到重要作用。根据丝状真菌丝氨酸蛋白酶的同源保守序列设计简并引物,通过RT-PCR及RACE的方法,克隆得到1845bp的全长cDNA片段。其可读框为1554bp(GenBank登录号为EU368754),编码517个氨基酸的蛋白质。比对分析发现该蛋白是一种分泌型的丝氨酸蛋白酶,属于丝氨酸蛋白酶S8家族的枯草杆菌蛋白酶subtilisin,具有典型的信号肽-前肽-成熟肽的结构。将该基因可读框除去信号肽插入酵母表达载体pPIC9K,转化毕赤酵母Pichia pastoris GS115,在甲醇诱导下成功分泌出具有生物活性的重组蛋白酶,诱导120h后酶活性可达153U/ml。重组蛋白酶经DEAE-Sepharose层析进行纯化,SDS-PAGE分析其分子量为39kD。其反应的最适温度为60℃,最适pH为8。