丙肝病毒(HCV)及乙肝病毒(HBV)双表达载体的构建及表达

目的 :为探索HCV/HBV高效联合基因免疫策略 ,构建具有 2套独立表达单元的HCV/HBV真核表达载体。方法 :分别将与HCV核心区基因互补的cDNA和HBV核心区基因克隆于具有 2套独立表达单元的真核表达载体pRSC的巨细胞病毒启动子和RSV启动子下游 ,称为pRSC HBV/HCV ,转染SP2 / 0细胞 ,通过免疫荧光和Western印迹法观测蛋白的表达 ,免疫Balb/c小鼠 ,用酶联免疫小鼠体液免疫应答。结果 :pRSC HBV/HCV转染SP2 / 0细胞可见HBcAg及HCV核蛋白染色阳性荧光细胞 ,SDS Page电泳显示在 14kD及 2 1kD处均可见蛋白条带 ,与HBcAg及HCV核蛋白的的理论预期值一致 ,Western印迹分析显示在 14kD及 2 1kD处可见特异性的蛋白条带。 5只免疫鼠中全部出现抗 HCV及抗 HBV抗体 ,而对照组全阴性。结论 :pRSC HBV/HCV可分别表达HBcAg及HCV核蛋白 ,免疫Balb/c小鼠后可诱导其体液免疫应答 ,为进一步开展HCV/HBV联合基因免疫奠定了实验基础。

构建不同筛选特性的HBV X基因真核表达载体

目的:构建不同筛选特性的两个HBV X基因真核表达载体。方法:从质粒pEcob6中PCR扩增HBV X全基因,利用pCEP4和pcDNA3.1(+)两者多克隆位点的特点,选用pGEMR○-T Easy Vector构建中间载体pEasy-X,分别酶切后连接特异性片段构建载体pCEP4-X和pcDNA3.1(+)-X。结果:从质粒pEcob6成功PCR扩增出HBV X全基因并克隆至质粒pEasy-X,酶切、PCR及测序均证实真核表达载体质粒pCEP4-X和pcDNA3.1(+)-X构建成功。结论:具有不同筛选特性的两个HBV X基因真核表达载体业已成功构建。

HCV E1/E2-Fc融合基因真核载体的构建及表达产物的鉴定

目的 构建表达HCV包膜糖蛋白 E1+E2661及E2661与人IgG Fc融合蛋白的真核表达载体并在COS-7中表达E1+E2661及E2661与人IgG Fc的融合蛋白,为研究HCV包膜糖蛋白的功能及其与细胞表面受体相互作用奠定基础。方法 利用PCR 方法从HCV基因组序列中扩增出编码HCV包膜糖蛋白El+E2661及E2661的基因,再将两段基因片段亚克隆到含有人IgG Fc基因的Pblue-scriptⅡSK-hc γ1载体中,获取El+E2661及E2661与hc γ1的融合基因并插入真核表达载体pEF BOSneo,构建表达HCV E1+E2661及E2661与 hc γ1的融合蛋白的真核表达载体;用脂质体介导转染COS-7细胞;RT-PCR检测COS-7细胞内融合基因,直接免疫荧光、ELISA、Western blot检测COS-7细胞培养上清及细胞内融合蛋白的表达。结果DNA测序结果证实插入片段即是HCV E1+E2661及E2661与HC γ1的融合基因;直接免疫荧光、ELISA、Western blot均检测到融合蛋白的表达。结论 pEF BOSHCV E1+E2661/Fc pEF—BOSHCV E2661/Fc真核表达载体构建成功,并能够在COS-7细胞中表达分泌性有活性的融合蛋白。