用磁捕法快速分离HCV-mRNA

目的 :寻找一种操作简便、快速、敏感性高、重复性好且特异性强的RNA分离纯化方法。方法 :磁捕法是用亲和素包被的磁珠交联带有生物素标记的丙型肝炎病毒 (HCV)寡核苷酸探针 ,与血清HCV mRNA(以异硫氰酸胍作裂解液 )特异性结合 ,经洗涤分离纯化HCV mRNA模板 ,作逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR) ,用于检测HCV患者血清。并用蛋白酶K消化法作对照。结果 :磁捕法检测抗 HCV阳性肝病患者血清5 0例 ,HCV RNA阳性 34例 (6 8% ) ,对 34例阳性标本 ,用蛋白酶K消化法提取HCV mRNA检测HCV ,结果HCVRNA阳性仅 2 8例。结论 :磁捕法分离HCV mRNA具有操作简便、快速。

用mRNA差异显示方法筛选HIV/HCV合并感染者差异表达基因

目的建立信使RNA(messenger RNA,mRNA)差异显示技术平台,寻找艾滋病病毒/丙型肝炎病毒(HIV/HCV)合并感染者差异表达基因。方法分离正常人、HIV感染者、HCV感染者及HIV/HCV合并感染者的外周血单核细胞,提取RNA,定量后利用锚定引物进行逆转录合成cDNA,然后利用10对随机引物及锚定引物进行PCR扩增。行6%变性PAGE凝胶电脉,银染后分析结果,回收差异条带测序。通过SYBRgreen实时荧光定量PCR以β-actin为内参,进行大量人群样本的定量分析鉴定。结果共筛选出107条差异表达条带,其中大部分是感染者与正常人之间的差异显示条带。已鉴定6个序列,其中2个序列是未知功能基因,3个序列为锌指蛋白141 (RNF141),1个序列为环磷酸腺苷磷酸化蛋白(ARPP-19)基因。经过对超过10份病人血样RNF141荧光定量PCR初步鉴定,在HIV/HCV合并感染者、HCV感染者中,RNF141的表达水平高于正常人。结论RNF141与HIV/HCV合并感染及HCV感染可能存在一定相关性。同时证明,利用mRNA差异显示方法可以筛选出与HIV/ HCV合并感染或单独感染相关的差异表达基因。