人冠状病毒HCoV-NL63和HCoV-HKU1常规RT-PCR与实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用比较

分别设计HCoV-NL63和HCoV-HKU1特异的引物与荧光标记探针,并合成含靶基因的模板RNA,建立常规RT-PCR方法与实时荧光定量RT-PCR方法,对其灵敏性、特异性和可重复性以及用于临床样本的适用性等进行平行比较评价。结果表明:这两种方法皆可对HCoV-NL63或HCoV-HKU1进行特异性诊断,其中荧光定量RT-PCR方法检测灵敏度均可达10拷贝/25μL反应体积,不同批次重复检测结果间的变异系数均小于5%。上述方法应用于158份临床鼻咽拭子标本,其中荧光定量RT-PCR方法检出6份HCoV-NL63阳性标本,5份HCoV-HKU1阳性标本,而常规RT-PCR方法则分别检出HCoV-NL63阳性与HCoV-HKU1阳性各3份。对常规RT-PCR方法获得的阳性样品进行序列分析证实上述方法的可靠性。本实验成功建立了可用于临床标本检测的人冠状病毒HCoV-NL63和HCoV-HKU1常规RT-PCR方法与实时荧光定量RT-PCR检测方法,并初步证实荧光定量RT-PCR检测方法检出率明显高于常规RT-PCR方法,这为开展HCoV-NL63和HCoV-HKU1的流行监测及临床早期诊断提供了有效技术手段。

北京地区成人呼吸道感染患者中HCoV-HKU1感染的初步分析与基因型确定

目的：对北京地区成人呼吸道感染患者中人冠状病毒（HCoV）HKUl的感染状况进行初步分析，了解其流行分布、临床特点，并确定流行株的基因型别。方法：2011年1月～2012年1月从北京地区成人呼吸道感染患者中收集鼻咽拭子标本559份，利用靶向棘突蛋白S与核心蛋白N的2种巢式PCR方法进行HCoV—HKUl筛查，并对阳性片段进行序列测定，以确定其基因型别；同时，对阳性标本进行常见呼吸道病毒的共感染筛查，进而分析HCoV—HKUl感染的临床表现和流行病学特点。结果：559份鼻咽拭子标本中检出HCoV—HKUl阳性9例（1．61％），其中3例合并HCoV-0C43感染；感染患者临床表现为急性呼吸道症状，以发热（88．9％）、咽痛（66．7％）、寒颤（68％）、流涕（55．6％）和咳嗽（44_4％）为主，其中1例有系统性红斑狼疮史；阳性基因片段系统进化分析发现这9例感染均为HCoV—I-IKUlB型。结论：北京地区近年成人呼吸道感染患者中HCoV—HKUl感染率较低（1．61％）。其流行株基因型为B型。

中国内陆发现HCoV-HKU1感染及N和S蛋白基因序列及进化分析

了解冠状病毒HKU1在我国大陆地区的感染情况及N基因和S基因的编码特征。采用RT-PCR的方法对2005年10月～2006年1月收集的260例急性呼吸道感染的住院儿童鼻咽抽吸物（NPA）进行了冠状病毒HKU1基因检测。将PCR阳性产物测序，并将所测序列在GenBank中进行比较分析。260份样本中共检测到2份冠状病毒HKU1阳性，阳性率为0．77％（2／260），且该2例冠状病毒HKU1阳性患者临床均表现为肺炎症状。扩增其中一株病毒N和S全基因，并进行测序，与GenBank中的冠状病毒HKU1参考株及冠状病毒科其它成员进行序列同源性和进化树分析，并对N和S蛋白的结构与功能进行了初步的预测分析。由此表明我国大陆地区存在冠状病毒HKU1感染，且可能与儿童下呼吸道感染存在相关性。

新型人冠状病毒HCoV-NL63和HCoV-HKU1的研究进展

多年来,人们公认的人冠状病毒包括HCoV-229E和HCoV-OC43等2株。但2002—2003年,由一种新型人冠状病毒SARS-CoV所引发的全球范围的严重急性呼吸综合征(SARS)的流行,使多国蒙受巨大损失,由此,冠状病毒又成为研究的焦点。随着分子生物学技术的发展,2004—2005年,又发现了2种新型人冠状病毒HCoV-NL63和HCoV-HKU1。在此,就这2种病毒的发现、流行情况,及其与疾病的相关性做一简要综述。

人冠状病毒HKU1 N和S蛋白基因序列及进化分析

目的了解人冠状病毒HCoV-HKU1在我国福州急性重症下呼吸道感染患儿中的感染情况以及病毒N基因和S基因的系统进化特征。方法通过RT-PCR法对2007年11月至2015年1月因呼吸道感染住进医院儿科重症监护病房的266例小儿鼻咽抽取物标本进行4种人冠状病毒的检测和人冠状病毒HCoV-HKU1的确认检测,测序并BLAST比对分析8份人冠状病毒阳性产物。结果在266例标本中检出2例HCoV-HKU1感染阳性病例,检出率为0.75%(2/266)。这两例患儿一例诊断为支气管炎、一例诊断为急性重症肺炎。通过检测都发现混合感染了人副流感病毒3型(HPIV-3)。对这两株病毒FZ90和FZ96的N和S蛋白基因进行序列测定、拼接和系统进化分析;结果表明这2株HCoV-HKU1都属于HKU1基因型A。结论人冠状病毒HCoV-HKU1可能是儿童下呼吸道感染中较为重要的一种病原,混合感染导致儿童病情加重。

新型人类冠状病毒HKU1的研究进展

在高发病率和高致死率的严重急性呼吸综合征(SARS)的启发下,许多学者开始致力于冠状病毒的研究。2004年以及2005年初就发现了两种新的主要与呼吸道疾病相关的人类冠状病毒,其中HCoV-HKU1(Human coronavirus HKU1)由中国香港学者2005年发现,其感染多发生在有基础疾病的患者,目前该病毒的检测基础方法主要是逆转录-聚合酶链反应,其在全球的分布和流行情况还不太明确。现就人类冠状病毒的发现历史,HCoV-HKU1毒粒的形态结构及其基因组结构特征、遗传变异等方面做一综述。

人冠状病毒HCoV-HKU1环介导等温扩增检测技术的研究

目的建立一种快速、灵敏、高效的人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)LAMP扩增检测方法。方法应用生物信息学软件设计5套LAMP扩增引物,以合成的HCoV-HKU1质粒为模板,通过实时浊度法进行最佳引物组的筛选,并分析该方法的特异性和灵敏度。结果 HCoV-HKU1 LAMP扩增方法针对其他病原微生物及人类基因组无反应信号。该方法可以检测到1拷贝/μl的HCoV-HKU1质粒。结论 HCoV-HKU1 LAMP扩增方法特异性好、灵敏度高,在临床鉴别诊断和口岸冠状病毒的检测中具有很好的应用前景。

人冠状病毒HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光RT-PCR检测方法的研究

目的建立一种快速、灵敏、高效的人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)和NL63(HCoV-NL63)双重实时荧光RTPCR检测方法。方法根据GENBANK数据库中HCoV-HKU1和HCoV-NL63的基因序列,利用BIOEDIT5.0软件进行序列比对分析,选择基因组的保守序列,并借助引物设计生物信息学软件,设计筛选出一套针对HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光PCR扩增的引物。从特异性、最低检测限、重复性等方面进行评估,建立了HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光PCR检测方法。结果分别以HCoV-HKU1和HCoV-NL63质粒为模板,HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光PCR方法的最低检测量分别为4.96×102 copies/ml和4.96×102 copies/ml。该方法针对其他病原微生物及人类基因组无反应信号,特异性好。4个梯度稀释质粒样本的4次重复检测Ct值变异系数均<5%,重复性好。结论 HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光RT-PCR方法准确性好、灵敏度高、稳定性好,在临床鉴别诊断和口岸冠状病毒的监测中具有很好的应用前景。

福州地区重症呼吸道感染患儿中4种人冠状病毒的检测与分析

目的 了解4种人冠状病毒（HCoV-HKU1、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E）在福州急性重症下呼吸道感染患儿中的感染状况及临床意义.方法 收集2007年11月至2015年1月因呼吸道感染住进医院儿科重症监护病房的小儿鼻咽抽取物标本,共计266份.通过RT-PCR法先用一对通用引物对人冠状病毒pol基因片段进行检测.测序并BLAST比对分析8份阳性产物.对用HCoV通用引物检测阳性的标本,再分别用两种人新型冠状病毒HCoV-HKU1和HCoV-NL63的特异性引物进行扩增检测.对这8株病毒进行系统进化分析.结果 检出8例HCoV感染阳性病例,检出率3.0％.其中2例感染HCoV-HKU1,1例感染HCoV-NL63,1例感染HCoV-229E,4例感染HCoV-OC43.在这266例住院患儿中HCoV-HKU1感染的检出率约为0.75％;HCoV-NL63和HCoV-229E感染的检出率约为0.38％;HCoV-OC43感染的检出率约为1.50％.检测出两例HCoV-HKU1与人副流感病毒3型（HPIV-3）的混合感染.系统进化分析表明这8株HCoV分成4簇,2株HCoV-HKU1属于HKU1基因型A.结论 4种人冠状病毒可能是儿童下呼吸道感染中较为重要的病原.

重庆地区儿童中人冠状病毒流行情况分析

目的了解重庆地区住院患儿所患急性呼吸道感染与人冠状病毒(Human coronavirus,HCoV)HCoV-HKU1、HCoV-NL63、HCoV-OC43和HCoV-229E的相关性,并分析这4种HCoV的流行特征。方法采集2007年4月～2009年3月于重庆医科大学附属儿童医院因急性呼吸道感染住院的996份患儿的鼻咽部分泌物,经RT-PCR检测排除呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)和人偏肺病毒(Human metapneumovirus,hMPV)阳性标本460份,采用RT-PCR法对536份RSV和hMPV阴性标本进行HCoV检测。结果 536份标本中共检出HCoV阳性10份,阳性率为1.86%,其中HCoV-HKU1 3份(0.56%),HCoV-NL63 4份(0.74%),HCoV-OC43 3份(0.56%),HCoV-229E 0份;10例患儿中男性9例,女性1例,年龄分布为0～5个月6例(60%),6～11个月2例(20%),12～23个月1例(10%),2～3岁1例(10%);3岁以上的未发现。HCoV感染呈全年散发,其中HCoV-HKU1感染集中在冬春季,HCoV-NL63和HCoV-OC43感染集中在夏秋季。HCoV感染的临床症状表现为发热、咳嗽、痰、喘息、呕吐和腹泻;临床诊断为支气管肺炎4例,间质性肺炎3例,迁延性肺炎1例,毛细支气管炎1例、急性喉气管支气管炎1例,其中有6例合并症状性腹泻。结论重庆地区因急性呼吸道感染住院的患儿中HCoV感染率较低,HCoV可引起下呼吸道感染和消化道感染。

β属人冠状病毒感染研究进展

β属人冠状病毒(human coronavirus,HCoV)包括HCoV-OC43、HCoV-HKU1、严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)和2019新型冠状病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV),其中SARS-CoV、MERS-CoV和2019-nCoV为高致病性HCoV,其跨种传播和流行对人类造成重大危害,对全球公共卫生及经济造成巨大损失,但相对于成人病例,儿童感染病例较少、临床表现较轻、预后较好,原因尚不清楚。本文对5种β属HCoV感染特点进行综述,比较儿童与成人病例的异同点并探讨其可能原因,以期为全面认识β属HCoV感染提供参考信息。