人冠状病毒HCoV—NL63的研究进展

类冠状病毒NL63（human coronavirus NL63，HCoV—NL63）是2004年荷兰学者首先发现报道的一种与呼吸道疾病有关的新型人冠状病毒。感染后可以引起上、下呼吸道感染，在儿童及免疫力低下的人群中的感染率较高。该文对HCoV—NL63的病毒学、流行病学、临床特征、细胞受体、病原学检测和可能的抗病毒治疗作一综述。

人冠状病毒HCoV-NL63和HCoV-HKU1常规RT-PCR与实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用比较

分别设计HCoV-NL63和HCoV-HKU1特异的引物与荧光标记探针,并合成含靶基因的模板RNA,建立常规RT-PCR方法与实时荧光定量RT-PCR方法,对其灵敏性、特异性和可重复性以及用于临床样本的适用性等进行平行比较评价。结果表明:这两种方法皆可对HCoV-NL63或HCoV-HKU1进行特异性诊断,其中荧光定量RT-PCR方法检测灵敏度均可达10拷贝/25μL反应体积,不同批次重复检测结果间的变异系数均小于5%。上述方法应用于158份临床鼻咽拭子标本,其中荧光定量RT-PCR方法检出6份HCoV-NL63阳性标本,5份HCoV-HKU1阳性标本,而常规RT-PCR方法则分别检出HCoV-NL63阳性与HCoV-HKU1阳性各3份。对常规RT-PCR方法获得的阳性样品进行序列分析证实上述方法的可靠性。本实验成功建立了可用于临床标本检测的人冠状病毒HCoV-NL63和HCoV-HKU1常规RT-PCR方法与实时荧光定量RT-PCR检测方法,并初步证实荧光定量RT-PCR检测方法检出率明显高于常规RT-PCR方法,这为开展HCoV-NL63和HCoV-HKU1的流行监测及临床早期诊断提供了有效技术手段。

新型人冠状病毒HCoV-NL63和HCoV-HKU1的研究进展

多年来,人们公认的人冠状病毒包括HCoV-229E和HCoV-OC43等2株。但2002—2003年,由一种新型人冠状病毒SARS-CoV所引发的全球范围的严重急性呼吸综合征(SARS)的流行,使多国蒙受巨大损失,由此,冠状病毒又成为研究的焦点。随着分子生物学技术的发展,2004—2005年,又发现了2种新型人冠状病毒HCoV-NL63和HCoV-HKU1。在此,就这2种病毒的发现、流行情况,及其与疾病的相关性做一简要综述。

2020年深圳地区4株冠状病毒HCoV-NL63基因组特征分析

目的了解2020年深圳市冠状病毒HCoV-NL63全基因组序列的遗传特征和变异。方法对HCoV-NL63核酸检测阳性的咽拭子标本进行全基因组测序、系统发生树重建和生物信息学分析。结果获得4株HCoV-NL63全基因组序列,均属于B基因型B2亚型,株间核苷酸(氨基酸)同源性为99.80%~99.98%(99.64%~99.93%),在进化树上处于同一分支,与广州2018年肺炎病人中获得的MK334046.1毒株距离最近。氨基酸变异分析表明结构蛋白中S、M蛋白变异性较大。与B基因型参考株对比发现,S蛋白中发现2处氨基酸位点变异:位于散发疫情毒株S1蛋白NTR区L196F和位于聚集性疫情毒株S2蛋白A946S。N-糖基化位点预测发现S蛋白N-糖基化位点有10个,M蛋白N-糖基化位点有2个。结论本研究中的4株冠状病毒源自广州毒株的可能性大,在一定程度上可为HCoV-NL63防控工作提供生物学溯源依据。

福州地区儿童急性呼吸道感染与人类冠状病毒NL63

目的探讨福州地区小儿急性呼吸道感染是否与人类冠状病毒NL63(HCoV-NL63)相关。方法收集211份急性呼吸道感染(ARTI)患儿鼻咽分泌物,RT-PCR法对HCoV-NL631b基因进行筛查,阳性者再对HCoV-NL631a基因进行扩增并与GenBank中相关序列进行比较。结果HCoV-NL631b基因阳性标本3份(1.4%),用HCoV-NL631a基因扩增也得到阳性结果,PCR产物测序后与基因库中多株HCoV-NL63Ⅰa基因比较,同源性98%～99%。结论福州地区部分儿童急性呼吸道感染与HCoV-NL63有关。

人冠状病毒NL63棘突蛋白的研究进展

20世纪60年代以前,人们普遍认为只有2种人冠状病毒(HCoV)HCoV-229E和HCoV-OC43感染人类,2002～2003年出现的由SARS-CoV引发的严重急性呼吸综合征(SARS)的流行使人冠状病毒又一次成为研究的焦点,2004年又发现了一种新的人冠状病毒HCoV-NL63。在此,主要就HCoV-NL63,特别是其主要结构蛋白——棘突蛋白的研究进展做一简要综述。

北京地区人冠状病毒NL63 N和E蛋白基因序列及生物信息学分析

为了解北京地区新近发现的新型冠状病毒-人冠状病毒NL63（Human coronavirus NL63,HCoV-NL63）的N和E蛋白编码基因的特征,从经RT-PCR检测阳性的临床标本中扩增得到的HCoV-NL63 N蛋白和E蛋白编码基因序列,分别克隆至pCF-T和pUCm-T载体中并进行测序,同时运用生物信息学的方法,对北京HCoV-NL63阳性标本BJ8081 N和E蛋白编码基因的核苷酸和氨基酸序列与HCoV-NL63原型株及其他几种冠状病毒的N和E蛋白编码基因的核苷酸和氨基酸序列进行比较分析和种系进化分析;用SOPMA方法对BJ8081 N和E蛋白的二级结构进行了预测分析,并对N和E蛋白的其他生物学特性进行了预测分析。经序列比对分析发现,BJ8081 N蛋白氨基酸序列在78-85肽段（FYYLGTGP）内与所比较的其他冠状病毒N蛋白相应位置的氨基酸序列完全相同,提示此区段可能为包括HCoV-NL63在内的所有冠状病毒N蛋白的保守区域。在BJ8081 N蛋白氨基酸序列的100-121肽段可能是和基因组RNA相结合的位置;在BJ8081 E蛋白的15-37位氨基酸可能是E蛋白的跨膜区域。研究对BJ8081 N蛋白和E蛋白的编码基因序列进行了测定和生物信息学分析,为今后对HCoV-NL63的进一步深入研究奠定了基础。

HcoV-NL63——一种新发现的呼吸道感染病毒病原

人冠状病毒NL63（Human coronavirus NL63，HCoV-NL63）是2004年4月荷兰学者van der Hoek L等首先报道发现的一种与呼吸道疾病有关的新的人冠状病毒，它是一单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科冠状病毒属。感染后可以引起上、下呼吸道感染，在儿童和免疫力低下的人群中的感染率较高，可与其它病毒合并感染，也可单独感染而引起发病。目前检测HCoV—NL63的方法主要是RT—PCR。

基于颜色判定的RT-LAMP技术检测HCoV-NL63冠状病毒基因

建立了一种适合于国境口岸简便、快速、灵敏和特异检测人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)的核酸检测方法。通过建立基于颜色判定的逆转录环介导等温扩增(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)技术,针对HCoV-NL63核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N)基因序列设计出6条特异性引物,在等温条件下(63℃)进行扩增反应60min,在扩增前加入钙黄绿素作为反应指示剂,并结合浊度仪进行实时监测,以最终反应颜色变化作为结果判断标准。利用该方法对同种属其他人冠状病毒、诺如病毒、流感病毒进行检测,以分析该方法的诊断特异性。应用该方法对梯度稀释的HCoV-NL63病毒RNA进行检测,以分析该方法的诊断灵敏性,并与常规real-time RT-PCR方法进行比较。结果显示,本研究建立的基于颜色判定的RT-LAMP方法在短时间内(40min)即可达到对HCoV-NL63的快速检测。该检测方法与加入其它病毒RNA模板溶液颜色均不产生改变,具有较高的检测特异性。检测灵敏性最低检测下限为1 600拷贝/反应。本研究建立的基于颜色判定的RT-LAMP方法可实现对HCoV-NL63冠状病毒现场快速检测,具有在国境口岸以及基层医疗机构和疫区现场推广应用的潜力。

人冠状病毒HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光RT-PCR检测方法的研究

目的建立一种快速、灵敏、高效的人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)和NL63(HCoV-NL63)双重实时荧光RTPCR检测方法。方法根据GENBANK数据库中HCoV-HKU1和HCoV-NL63的基因序列,利用BIOEDIT5.0软件进行序列比对分析,选择基因组的保守序列,并借助引物设计生物信息学软件,设计筛选出一套针对HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光PCR扩增的引物。从特异性、最低检测限、重复性等方面进行评估,建立了HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光PCR检测方法。结果分别以HCoV-HKU1和HCoV-NL63质粒为模板,HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光PCR方法的最低检测量分别为4.96×102 copies/ml和4.96×102 copies/ml。该方法针对其他病原微生物及人类基因组无反应信号,特异性好。4个梯度稀释质粒样本的4次重复检测Ct值变异系数均<5%,重复性好。结论 HCoV-HKU1和HCoV-NL63双重实时荧光RT-PCR方法准确性好、灵敏度高、稳定性好,在临床鉴别诊断和口岸冠状病毒的监测中具有很好的应用前景。

HCoV-NL63 N蛋白不同片段的表达纯化及血清学检测应用分析

将HCoV-NL63核衣壳蛋白N端（Np1~154aa）、C端（Cp141~306aa）基因片段克隆到原核表达载体pET30a（＋）上进行原核表达,制备相应的纯化蛋白Np、Cp蛋白,利用Np、Cp蛋白建立基于Western-Blot条带印迹的HCoV-NL63抗体检测法,并与基于全长N蛋白（Nf）的HCoV-NL63抗体检测法相平行筛查了50份成年体检血清。结果显示：50份成年体检血清中,采用Nf、Np、Cp分别检出25、27、36份HCoV-NL63抗体阳性血清,检出率分别为50%、54%、72%。不同N蛋白与血清反应抗体阳性谱存在差异,其中Np与Nf检出一致率为64%,Cp与Nf检出一致率为54%,而Np与Cp检出一致率为54%。本研究表明人冠状病毒NL63在我国人群中感染常见,N蛋白C端（Cp）检出率比全长N（Nf）及N端（Np）要高,Nf、Np、Cp在抗体检测上存在不一致性。这为HCoV-NL63血清学试剂研发及免疫学研究提供了依据与实验基础。

新型人冠状病毒NL63膜蛋白(M)基因的序列分析及其抗原表位预测分析

目的了解新发现的、与北京地区婴幼儿急性呼吸道感染相关的人冠状病毒HCoV- NL63的主要结构蛋白——膜蛋白(M)的基因特征。方法分别从2份已确认为HCoV-NL63阳性的、取自急性呼吸道感染患儿的标本(BJ3140和BJ8081)中用RT-PCR方法扩增得到其M蛋白的全基因,在对其进行了序列分析的基础上对推导出的M蛋白的抗原表位进行了预测分析。结果BJ3140和BJ8081的M蛋白编码基因全长681bp,编码一个含226个氨基酸的蛋白。BJ3140和BJ8081之间M基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.1%和99.6%;与HCoV-NL63原型株有很高的核苷酸(99.1%～99.7%)和氨基酸同源性(99.6%和98.7%),而与HCoV-229E的氨基酸同源性为61.3%,与HCoV- OC43和SARS-CoV氨基酸同源性则低于31.0%。BJ3140和BJ8081的M蛋白N端21个氨基酸位于病毒包膜外区,随后是3次跨膜区,最后是较长的包膜内区。不同方法的预测结果显示BJ3140的M蛋白的B细胞表位优势肽段多位于C-末端包膜内区域。结论从北京地区婴幼儿HCoV-NL63感染阳性的呼吸道标本中扩增得到的M蛋白编码基因与HCoV-NL63原型株有很高的同源性,具有与其他冠状病毒M蛋白相似的结构特征。

表达人冠状病毒NL63棘突蛋白不同片段的重组痘苗病毒的制备与表达分析

HCoV-NL63是新近发现的人冠状病毒,对其外膜糖蛋白-棘突蛋白的表达及功能的研究仍有待深入。本研究利用天坛株痘苗病毒载体,克隆构建可表达HCoV-NL63棘突蛋白四个片段(N端棘突蛋白:S1;C端棘突蛋白:S2;受体结合区大片段:RL;受体结合区小片段:RS)的重组痘苗病毒(vJSC1175-S1;vJSC1175-S2;vJSC1175-RL;vJSC1175-RS),酶切测序证实表达载体构建正确,免疫荧光分析(IFA)各重组痘苗病毒中棘突蛋白不同片段的表达与定位,Western-Blot分析表明各种重组蛋白表达正确。分析结果显示:4种重组蛋白均能有效表达,S1、RL及RS蛋白的荧光主要分布在细胞膜上,而S2蛋白的荧光则主要分布于细胞浆,各个片段的分子量大小与文献报道相同,并可进行正确的翻译修饰(糖基化)。本研究首次采用痘苗病毒天坛株载体构建制备了表达HCoV-NL63棘突蛋白不同片段的重组痘苗病毒,为进一步分析人冠状病毒HCoV-NL63棘突蛋白的结构功能及探索其抗原性和免疫原性奠定了基础。

人类冠状病毒NL63的研究进展

人类冠状病毒NL63（human coronavirus NL63，HCoV-NL63）是2004年荷兰学者首先报道发现的一种与呼吸道疾病有关的新的人冠状病毒。感染后可以引起上、下呼吸道感染，在儿童及免疫力低下的人群中的感染率较高。

急性呼吸道感染患儿人冠状病毒NL63检测与分析

目的建立人冠状病毒NL63(human coronavirus NL63)的实时荧光定量PCR(real-time fluorescentquantitative PCR,FQ-PCR)方法,了解呼吸道疾病患儿感染人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)的情况。方法收集2008年10月至2009年4月因急性呼吸道感染(ARTI)而就诊于福建医科大学省立临床医学院患儿的咽拭子、鼻咽抽吸物、痰标本共151份,设计多聚酶蛋白1a基因的引物和Taqman探针,扩增1a基因片段,并将其克隆到PMD18-T载体上,构建质粒标准品,建立FQ-PCR检测方法,进行敏感性、特异性试验。扩增核衣壳蛋白N基因,对其序列进行初步分析。结果所建立的FQ-PCR方法特异性好,线性范围为101～1010copies/μL,变异系数小于5%。151份临床标本中共检测到2份HCoV-NL63阳性,阳性率为1.3%(2/151)。结论采用FQ-PCR方法可以检测急性呼吸道疾病患儿感染HCoV-NL63的情况。

五株人冠状病毒NL63的基因型鉴定及S1 domain基因特征分析

为阐明我国部分地区人冠状病毒(Human coronavirus,HCoV)NL63基因特征,本研究对2013年陕西省、2018年河南省和湖南省送检的5株HCoV-NL63核酸检测阳性的呼吸道样本进行HCoV-NL63基因型别鉴定及S1 do-main基因特征分析。通过对HCoV-NL63棘突蛋白(Spike glycoprotein,S)基因的S1 domain区域进行基因扩增和序列测定,同时结合GenBank数据库下载的1983～2018年其他国家74条HCoV-NL63代表株序列和2007～2010年中国流行的12条HCoV-NL63代表株序列,构建基因亲缘性关系树,并对S蛋白的S1 domain区域进行核苷酸序列比对分析。结果提示全球HCoV-NL63流行株可划分为A和B两个基因型;A基因型可进一步划分为A0,A1,A2和A3四个基因亚型,其中本研究将GenBank中2008年中国流行的2株HCoV-NL63毒株划分为新基因亚型(A3);B基因型可进一步划分为B0,B1和B2三个基因亚型。A和B基因型的HCoV-NL63代表株序列在地域分布上无明显差异,但A基因型不同基因亚型的HCoV-NL63序列在年代分布上呈现出一定的时间进化趋势。在我国A和B基因型HCoV-NL63均已被检测到,但主要以A基因型流行为主,且主要集中在A1和A2基因亚型。不同基因型HCoV-NL63序列在S1 domain区域核苷酸和氨基酸序列上存在特征性差异。本研究通过对五株HCoV-NL63基因型鉴定及S1 domain基因特征分析,初步阐明了我国部分地区流行的HCoV-NL63基因型/基因亚型分布情况及基因特征,丰富了我国本土流行的HCoV-NL63基因数据库,为我国HCoV-NL63分子流行病学研究及分子检测和监测技术的改进和验证提供了基础基因数据。

人冠状病毒NL63受体结合区蛋白的原核表达纯化与鉴定

人冠状病毒NL63受体结合区蛋白是其免疫学诊断和疫苗研究的主要靶点,在受体吸附、病毒进入细胞及膜融合中起关键作用。本研究在E.coli系统中进行人冠状病毒NL63受体结合区(RBD)大、小蛋白的表达纯化,并对其进行免疫学鉴定。首先密码子优化设计合成了HCoV-NL63的RBD大片段(RL:232-684aa)与小片段(RS:476-616aa)的编码基因,并将其克隆进硫氧还蛋白表达载体pM48,构建了人冠状病毒NL63的受体结合区蛋白(RBD)大(RL)、小(RS)片段与硫氧还蛋白的融合表达质粒;转化E.coli BL21pLys S,利用IPTG进行诱导表达,用镍亲和层析对蛋白进行纯化,并以表达HCoV-NL63RL与RS蛋白的重组痘苗病毒免疫小鼠血清对重组蛋白进行免疫印迹鉴定。结果表明在37℃,0.8mM IPTG诱导4h时,蛋白表达量达到最高,融合蛋白主要以包涵体形式表达,纯化后纯度可达95%以上。Western blot显示,两个融合蛋白均与痘苗病毒(天坛株)表达的HCoV-NL63RL与RS蛋白免疫的小鼠血清发生特异性反应。本研究首次在国内用原核系统表达纯化并鉴定了人冠状病毒NL63受体结合区大小蛋白(RL和RS),为人冠状病毒NL63感染的免疫学检测与疫苗研究提供了基础。

人冠状病毒NL63的研究进展

2003年严重急性呼吸综合征(SARS)的爆发,使人冠状病毒成为研究的焦点.2004年又发现一种新型的人冠状病毒NL63,引起婴幼儿及免疫低下人群严重的临床症状,同时由于与SARS-CoV的相似性,使其成为研究SARS-CoV致病机理的重要工具.就HCoV-NL63的基因组特点,转录机制及感染过程的分子机制做一简要综述.

深圳市一起人类冠状病毒NL63聚集性疫情的病原学特征研究

2020年8月,广东省深圳市发生一起上呼吸道感染聚集性疫情,经对咽拭子样本进行病毒RNA的提取、逆转录和荧光定量PCR检测,确认为人类冠状病毒(Human coronavirus,HCoV)NL63感染所致,然后利用二代测序技术对阳性标本进行病毒全基因组测序,最终获取7条HCoV-NL63序列全长。在对毒株的棘突蛋白(Spike glycoprotein,S)基因及其S1 domain进行PCR扩增和序列测定分析中发现,S基因的160个碱基变异导致41个氨基酸突变和1个氨基酸缺失,其中39个位于S1 domain中,含1个位于受体结合结构域的突变(E572A)。在N端结构域内,三个氨基酸变异(N24S、S100P和N178S)造成三处潜在N-糖基化位点缺失,而四个氨基酸变异(N24S、E94N、G96S和L131S)却造成另三处潜在N-糖基化位点增加,使得潜在N-糖基化位点的总数保持不变。同时,结合GenBank数据库下载的45条多国的HCoV-NL63流行代表株序列,构建基于S基因中S1 domain的基因亲缘性关系树。进化分析发现,HCoV-NL63代表株主要被划分为A和B两大基因型,本次疫情中检测出的7株毒株和2株中国广东省流行的HCoV-NL63毒株进化距离最近,同属一个新的单独进化树分支,暂被划分为新基因亚型B3。本研究通过对毒株中S基因序列的比对、功能区域特征的分析以及基因型鉴定,从分子流行病学上初步阐明了深圳本次聚集性疫情中HCoV-NL63的基因特征及基因型/基因亚型,丰富和完善了我国流行的HCoV-NL63基因数据库,为今后对HCoV-NL63的分子检测、疫苗研发及致病机制研究提供了科学依据。