miR-34a靶向调控HDAC1基因对急性髓系白血病细胞凋亡的影响

目的:探讨急性髓系白血病细胞中miR-34a对HDAC1的调控作用以及对细胞凋亡的影响。方法:将miR-34a mimics、miR-34a inhibitor、miR-34a scramble转染到HL-60细胞中,采用CCK8试验和流式细胞术分别检测miR-34a不同表达水平对HL-60细胞增殖和凋亡的影响。应用Western blot检测miR-34a表达改变后HDAC1蛋白表达水平。构建含HDAC1 3′UTR的双荧光素酶报告载体,应用双荧光素酶报告实验验证miR-34a与HDAC1的作用位点。构建不含HDAC1 3′UTR的表达载体,应用回复实验验证miR-34a与HDAC1的相互作用。结果:miR-34a过表达可导致HL-60细胞的增殖抑制、凋亡率增加。生物信息学分析表明,HDAC1是miR-34a的靶基因;Western blot结果显示,miR-34a高表达可下调HDAC1蛋白表达,双荧光素酶实验和回复实验显示,miR-34a可作用于HDAC1 3′UTR区,调理其表达。结论:miR-34a促进HL-60细胞凋亡,其作用可能与其对HDAC1表达调控有关。

淡水养殖凡纳滨对虾生长相关基因HDAC1克隆及其表达分析

【目的】分析组蛋白去乙酰基酶1基因(HDAC1)在不同淡水生长特性家系凡纳滨对虾中的表达情况,明确HDAC1基因在对虾淡水养殖过程中的功能作用,为揭示凡纳滨对虾生长调控的分子机制提供参考依据。【方法】通过RACE克隆凡纳滨对虾HADC1基因cDNA序列,利用DNAMAN、ProtParam、ProtScale、PSORT等在线软件进行生物信息学分析,以实时荧光定量PCR检测凡纳滨对虾HDAC1基因组织表达特征;选取4个家系凡纳滨对虾在1‰盐度下进行淡水养殖,养殖70 d后统计对虾存活率(RS)、日增重率、体长日增率、特定生长率(SGR)及饲料转化率(FCR),并利用实时荧光定量PCR检测凡纳滨对虾肠道中的HDAC1基因表达情况。【结果】凡纳滨对虾HDAC1基因c DNA全长3230 bp,包括67 bp的5’非编码区(5’-UTR)、1711 bp的3’非编码区(3’-UTR)及1452 bp的开放阅读框(ORF),共编码483个氨基酸残基;HDAC1基因DNA全长4692 bp,含有8个外显子和7个内含子。凡纳滨对虾HDAC1基因编码蛋白分子量为54640.22 Da,理论等电点(p I)为5.59,属于稳定的亲水性蛋白,具有1个Histone deacetylase 1结构域,无跨膜结构。凡纳滨对虾HDAC1氨基酸序列与斑节对虾HDAC1氨基酸序列的相似性最高,达99.79%。HDAC1基因在凡纳滨对虾各组织中均有表达,以在肠道中的相对表达量显著高于在其他组织中的相对表达量(P<0.05);在4个家系群体中,无论是大虾还是小虾,生长慢的群体中HDAC1基因相对表达量较低,生长快的群体中HDAC1基因相对表达量较高。【结论】HDAC1基因在凡纳滨对虾各组织中均有表达,以肠道中的相对表达量最高,且HDAC1基因相对表达量与凡纳滨对虾的生长速度成正比,故推测其参与凡纳滨对虾的生长调节过程。

泥蚶HDAC1基因cDNA全长、内含子克隆及时空表达特征分析

HDAC1作为HDACs家族中重要成员,可使组蛋白去乙酰化进而调节基因表达,在细胞分化和胚胎早期发育中起重要作用。本文利用SMART RACE技术克隆得到泥蚶HDAC1(Tg-HDAC1)基因的cDNA全长序列,并对其内含子进行扩增及不同组织、不同发育时期的定量表达。结果发现:TgHDAC1基因的cDNA序列全长为2 275bp,开放阅读框(ORF)1 587bp,编码528个氨基酸;TgHDAC1蛋白序列与斑马鱼、鸡、小鼠等的相似性都在80%以上,表明该蛋白氨基酸序列在物种进化过程中具有保守性;在Tg-HDAC1基因中扩增出13个内含子,均存在于开放阅读框中,且都遵循GT-AG原则;荧光定量PCR(qRT-PCR)分析结果显示,Tg-HDAC1基因在成体血液、内脏团、外套膜、鳃、斧足和闭壳肌6个组织中均有表达,而在足中的表达量最高,且与其余5组织中的表达量有极显著差异(P<0.01),说明它对该组织生长具有重要作用。不同发育时期的表达差异结果表明,TgHDAC1基因在担轮幼虫期表达量最高,显著高于其他发育时期(P<0.05)。

HDAC1基因沉默的hUC-MSCs移植对创伤性脑损伤小鼠的神经保护作用

目的:观察组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)基因沉默的人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)静脉移植对创伤性脑损伤小鼠神经功能恢复的影响。方法:80只健康成年C57BL/6小鼠,利用立体定位仪和颅脑打击器制作中度脑损伤模型,分为Sham组、Vehicle组、hUC-MSCs移植组和联合组(n=20)。移植后第1、3、7、14、21和28天,采用改良神经功能损伤评分系统评价小鼠神经功能恢复情况;通过Morris水迷宫实验、挂线实验、新物体识别实验评价小鼠长期运动及认知功能。结晶紫染色评估小鼠的脑损伤体积和观察海马CA3区神经元形态学改变;湿重法检测脑含水量;伊文斯蓝染色检测血脑屏障的开放程度。结果:与Vehicle组相比,hUC-MSCs移植组和联合组小鼠神经功能损伤评分降低,水迷宫实验中逃避潜伏期增加、穿越平台次数及在平台象限停留时间增加,挂线时间和辨别指数增加,其中联合组各指标均有明显改善(P<0.05)。与hUC-MSCs移植组相比,联合组小鼠脑损伤体积减少、脑含水量降低、血脑屏障开放程度减轻(P<0.05),且海马CA3区神经元丢失减少。结论:HDAC1基因沉默的hU-MSCs移植对创伤性脑损伤小鼠有较好的神经保护作用。

RNA干扰组蛋白去乙酰化酶1对人胰腺癌细胞增殖、凋亡的调控机制研究

目的观察沉默组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)基因对人胰腺癌PaTu8988细胞增殖、凋亡的影响及可能机制。方法胰腺癌PaTu8988细胞株分为空白对照组(不予任何处理)、阴性对照siRNA组(予以30nmol/L阴性siRNA)、siRNA1组(予以15nmol/LHDAC1siRNA)和siRNA2组(予以30nmol/LHDAC1siRNA)。siRNA转染48h后,用相对实时定量RT-PCR法和West-ernblotting检测HDAC1基因表达情况;相对实时定量RT-PCR法检测细胞增殖凋亡相关基因p21、Bcl-2、Bax的表达;WST-8法检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞凋亡变化。结果转染HDAC1siRNA48h后人胰腺癌PaTu8988细胞中HDAC1mRNA表达量在siRNA1组和siRNA2组分别为46.1%±6.1%和32.3%±1.4%,均显著低于空白对照组(100.0%±3.4%)和阴性对照siRNA组(87.4%±28.3%,P<0.05)。Westernblotting显示HDAC1蛋白表达量亦明显下降,以siRNA2组表达量最低(P<0.05)。WST-8法检测显示4组细胞存活率分别为100%±17.1%、87.1%±5.0%、68.7%±4.7%、61.6%±2.0%,siRNA1组和siRNA2组与其他各组相比差异显著(P<0.05)。流式细胞术检测显示上述4组胰腺癌细胞凋亡率分别为4.20%±0.95%,4.59%±1.26%,10.09%±1.36%,11.19%±6.07%,与空白对照组和阴性对照siRNA组相比,siRNA1组和siRNA2组凋亡率显著增高(P<0.05)。siRNA1组和siRNA2组p21、BaxmRNA相对表达量明显高于其他各组(P<0.05),而Bcl-2mRNA相对表达量明显低于其他各组(P<0.05)。结论HDAClsiRNA能特异、有效地抑制人胰腺癌PaTu8988细胞HDACl的表达,同时抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡,其机制可能与上调p21、Bax表达,下调Bcl-2表达有关。

青黄散联合健脾补肾方对骨髓增生异常综合征患者HDAC1基因去甲基化的影响

目的探讨青黄散联合健脾补肾方提高骨髓增生异常综合征(MDS)患者外周血红蛋白机制。方法选择2016年2月-2018年2月在中国中医科学院西苑医院及首都医科大学附属北京中医医院血液科就诊的30例MDS患者,采用青黄散联合健脾补肾方治疗6个月。采用血细胞分析仪检测患者治疗前后血常规,亚硝酸氢盐测序法(BSP)检测治疗前后骨髓HDAC1基因甲基化变化,Real-time PCR检测治疗前后HDAC1 mRNA及缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)mRNA变化,采用自身前后对照的方法比较治疗前后上述指标的差异。结果治疗前MDS骨髓标本中,HDAC1基因启动子区CpG1、CpG5、CpG12、CpG23位点呈高甲基化,分别为58.67%、85.67%、63.89%、71.63%,治疗后,上述HDAC1基因启动子区4个甲基化位点呈低甲基化状态,分别为0.67%、0、1.33%、1.33%;治疗后HDAC1 mRNA相对表达量较治疗前增加了4.9倍(P<0.01),HIF-1αmRNA相对表达量较治疗前增加了7.5倍(P<0.05)。结论青黄散联合健脾补肾方可通过降低HDAC1基因高甲基化增加下游HIF-1αmRNA表达,发挥提高外周血红蛋白作用。

结合Bulk RNA和Single-cell RNA测序探索年龄相关性黄斑变性能量代谢关键基因及调控中药化合物预测

目的探寻年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)能量代谢的关键基因和潜在调控的中药化合物。方法从GEO数据库获取AMD相关Bulk RNA测序数据集GSE135092,利用R语言筛选差异表达基因,并与GSEA数据库下载的能量代谢相关基因(energy metabolism-related genes,EMRGs)映射取交集,获取AMD差异表达EMRGs,通过Cytoscape软件构建蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)、转录因子(transcription factor,TF)、微小RNA(microRNA,miRNA)网络。使用LASSO回归在差异表达EMRGs中筛选AMD标志物,构建风险评分。同时,将AMD相关Single-cell RNA测序数据集GSE188280进行主成分分析(principal component analysis,PCA)及统一流形逼近与投影(uniform manifold approximation and projection,UMAP)分析以聚类降维,并进行细胞类型注释,进一步评估AMD关键差异表达EMRGs在不同细胞类型间的表达水平。将关键差异表达EMRGs导入Coremine Medical数据库中进行相关中药活性成分预测及分子对接、分子动力学验证。结果筛选出6个AMD关键差异表达EMRGs:FOXO3、GSK3B、MEF2A、NCOA1、HDAC1、PPARG,并构建相应PPI、TF-mRNA、mRNA-miRNA网络。LASSO回归得出NCOA1、MEF2A、FOXO3、GSK3B表达与AMD发生呈正相关,HDAC1表达与AMD发生呈负相关。分析AMD相关Single-cell RNA测序将32714个细胞分类为19个簇,使用marker基因将细胞簇鉴定为9种细胞类型,进一步得到HDAC1、MEF2A、FOXO3及NCOA1在内皮细胞中高表达。根据关键基因HDAC1、MEF2A、FOXO3筛选到9味中药及其285种活性成分,经分子对接及分子动力学模拟,其中丹参醇B治疗AMD潜力最大。结论HDAC1和丹参醇B为AMD能量代谢的潜在关键基因及作用化合物。

HDAC1对ERα和ERβ蛋白水平的调控

目的:构建带编码HA标签的hdac1基因真核表达载体,研究组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)对雌激素受体α和β(ERα和ERβ)蛋白水平的影响。方法:用提取的RNA产物进行逆转录合成cDNA,利用PCR技术扩增出hdac1基因完整编码区序列,通过DNA重组技术构建含编码hdac1DNA片段的真核表达载体pcDNA3-HA-hdac1;利用GST沉降(pu ll-down)实验观察HDAC1是否能特异结合ERα或ERβ;又将pcDNA3-HA-hdac1重组质粒分别和ERα表达载体或ERβ表达载体质粒共转染293T细胞,观察HDAC1对ERα和ERβ蛋白水平的影响。结果:转染pcDNA3-HA-hdac1重组质粒的哺乳动物细胞表达了与预期相对分子质量大小一致的HDAC1蛋白;GST沉降实验表明,HDAC1蛋白与ERα和ERβ均结合;共转染实验观察到HDAC1可使ERα蛋白水平降低,而对ERβ没有影响。结论:HDAC1与ERα和ERβ均结合,但其对ER s的作用具有亚型特异性,ERα和ERβ蛋白水平可能受不同类型的组蛋白去乙酰化酶(HDACs)的调控。

果蝇组蛋白去乙酰化酶HDAC1和HDAC3选择性调控形态发生素靶基因转录

在真核细胞中,组蛋白的乙酰化状态对于基因转录的正常进行具有重要的调控作用。组蛋白的乙酰化修饰由组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferases,HATs)执行,这种修饰是动态的、可逆的,负责去乙酰化修饰的酶是组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs),推测HDACs可能通过影响组蛋白的乙酰化状态在基因的转录过程中发挥调控作用。该文以组蛋白去乙酰化酶HDAC1和HDAC3为对象,研究了它们在果蝇翅膀发育过程中对Wg(Wingless)、Hh(Hedgehog)以及Dpp(Decapentaplegic)信号通路下游靶基因转录的调控作用。结果发现,HDAC1功能缺失可导致Dpp下游靶基因Omb(optomotor-blind)和Hh下游靶基因Ptc(patched)的表达上调。Real-time quantitative PCR(RT-q PCR)结果显示,在HDAC1基因敲除的果蝇中,Ptc、Ci(cubitus interruptus)以及Omb的转录水平增加。HDAC3缺失导致Sal(spalt)的表达上调。RT-q PCR结果证实了HDAC3基因敲除果蝇的Sal转录增加,同时发现Vg(vestigial)的转录下降。而过表达HDAC1或HDAC3对下游靶基因的表达则没有影响。综上所述,该研究表明,HDAC1和HDAC3可以选择性地调控形态发生素下游靶基因的转录。