聚焦dyHDL/miRNA210结合体-线粒体串话解析“荡涤痰浊”防治动脉粥样硬化理论

中医学认为动脉粥样硬化(atherosclorosis,AS)为本虚标实之证,脾气亏虚为其本,痰浊壅滞为其标。基于“痰浊宜荡涤”理论,观察涤痰汤加味方(健脾化痰、荡涤浊滞)防治AS具有临床意义。近年来,高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)与miRNA结合后调控细胞内信号转导干预AS逐渐成为研究热点,经生物信息学预测软件分析发现,HDL所结合的miRNA-210-3p与铁硫簇装配蛋白(ISCU1/2)可靶向结合调控线粒体能量稳态,因此聚焦dyHDL/miRNA210结合体-线粒体串话为挖掘健脾化痰中药防治心血管疾病有效靶点提供新的研究策略及科学依据。

运动结合饮食干预对肥胖青少年血清HDL亚类分布的影响

目的探索运动结合饮食干预对HDL亚类分布的影响。方法从皓千减肥夏令营11-17岁男性营员中选取肥胖青少年12名为研究对象,以同龄体重正常、男性青少年6名为对照。进行为期4周以饮食控制和运动干预为主的封闭式减肥夏令营。于入营第一天和第四周末,采集空腹肘静脉血5mL,进行血清HDL亚类preβ1-HDL、preβ2-HDL、preβ3-HDL、HDL3a、HDL3b、HDL3c、HDL2a及HDL2b的测试,以分析肥胖青少年血清HDL亚类的分布特点及运动结合饮食干预对HDL亚类分布的影响。结果(1)肥胖青少年血清HDL亚类中以preβ-HDL为主,占比90%以上,HDL3和HDL2所占较小。(2)与体重正常组比较,肥胖组血清总HDL水平无差异(P>0.05),但是HDL亚类中HDL2a(P<0.001)和HDL2b(P<0.01)含量显著升高,其他亚类无显著性差异(P>0.05)。(3)4周运动结合饮食干预未改变肥胖青少年血清中HDL总体水平(P>0.05),但是亚类中HDL2(P<0.05)和HDL3(P<0.05)含量下降,preβ-HDL含量(P<0.001)显著上升。结论肥胖青少年血清HDL亚类中以preβ-HDL为主。但是HDL2a和HDL2b含量高于体重正常青少年。4周的运动结合饮食干预可显著降低HDL2和HDL3含量,升高preβ-HDL含量,即改变HDL的亚类分布,但不改变HDL总水平。

miRNA378~*表达对柯萨奇B3病毒感染乳鼠心肌细胞凋亡、网腔钙结合蛋白、内质网应激伴侣蛋白表达的影响

目的:研究沉默miRNA378~*表达对柯萨奇B3病毒(CVB3)感染心肌细胞凋亡、内质网应激、网腔钙结合蛋白(calumenin)影响。方法:原代培养乳鼠心肌细胞分为:对照组(正常细胞)、柯萨奇病毒感染组(正常细胞+柯萨奇B3病毒)、miRNA378~*沉默对照组(正常细胞+柯萨奇B3病毒+转染miRNA378~*空质粒)、miRNA378~*沉默组(正常细胞+柯萨奇B3病毒+转染miRNA378~*沉默质粒),各组细胞分别转染和感染处理后置37℃、CO_2培养箱中培养3 d。检测细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、细胞凋亡率、网腔钙结合蛋白、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)及内质网应激信号通路因子激活转录因子6(ATF6)、转录因子C/EBP同源蛋白(CHOP)的表达。结果:通过检测ɑ-SMA蛋白,证实分离乳鼠细胞为心室肌细胞。TUNEL法检测不同组心室细胞凋亡情况发现,柯萨奇病毒感染组心室肌细胞凋亡明显,与柯萨奇病毒感染组心肌细胞相比较,miRNA378~*沉默组心肌细胞凋亡细胞量明显减少。与柯萨奇病毒感染组比较,Calumenin表达减少(P<0.01),而GRP78、ATF6、CHOP表达增加(P<0.01)。结论:CVB3病毒感染心肌细胞作用与miRNA378~*,引发内质网应激并激活信号通路因子,心肌细胞凋亡增加。

阿霉素损伤心肌细胞miRNA378与网腔钙结合蛋白、内质网应激的关系

目的:研究阿霉素损伤心肌细胞miRNA378与网腔钙结合蛋白(calumenin)、内质网应激相关性。方法:原代培养乳鼠心肌细胞分为6组:对照组、阿霉素组、miRNA378过表达对照组、miRNA378过表达组、miRNA378沉默对照组、miRNA378沉默组,采用免疫组化法检测细胞α-SMA蛋白;慢病毒质粒转染心室肌细胞,实时荧光定量PCR技术检测各组心肌细胞miRNA378、calumenin及葡萄糖调节蛋白78(GRP78)mRNA表达。结果:与阿霉素组相比较,miRNA378过表达组心肌细胞calumenin mRNA表达增加(P<0.01),而GRP78 mRNA表达减少(P<0.01);与阿霉素组相比较,miRNA378沉默组calumenin及GRP78 mRNA表达无统计学差异。结论:阿霉素损伤乳鼠心肌细胞是通过减少calumenin蛋白表达进而引起内质网应激,该作用通过上调miRNA378得到缓解。

HDL内miR-223、miR-33a/b表达变化与冠状动脉狭窄程度的相关性研究

目的:探讨从冠状动脉粥样硬化性心脏病(CAD)患者血浆中分离提取的高密度脂蛋白(HDL)内miR-223、miR-33a、miR-33b表达水平变化与冠状动脉狭窄程度的相关性。方法:选择因胸闷、胸痛、心悸不适就诊于本院心内科并行冠状动脉造影检查(CAG)的86例患者,依据CAG结果分为对照组、冠心病(CAD)组,CAD组采用Gensini积分分为轻中度狭窄组、重度狭窄组。通过超速离心分离法提取血浆中HDL,应用实时荧光定量PCR检测各组HDL内miR-223、miR-33a、miR-33b的表达含量变化。采用多因素Logistic回归分析CAD发生的影响因素,应用Spearman相关分析法分析CAD患者HDL中miRNA表达与Gensini积分的相关性;并绘制ROC评价HDL内miRNA表达水平对CAD诊断价值。结果:CAD组HDL-miR-223表达量明显高于对照组,HDL-miR-33a表达量低于对照组,且CAD重度狭窄组HDL-miR-223相对表达量高于轻中度狭窄组。CAD患者HDL-miR-223相对表达量与Gensini积分呈正相关;ROC分析显示HDL-miR-223、HDL-miR-33a均对CAD的诊断具有一定预测价值,且二者联合对诊断CAD预测价值更高。结论:HDL内miR-223、miR-33a与CAD发生发展密切相关,随着冠脉狭窄程度进展,HDL内miR-223表达量升高。

RNA结合蛋白hnRNPK与miRNAs互作调控猪骨骼肌卫星细胞分化与骨骼肌发育的分子机理

我校生命科学学院徐永杰博士2019年获批国家自然科学基金面上项目:RNA结合蛋白hnRNPK与miRNAs互作调控猪骨骼肌卫星细胞分化与骨骼肌发育的分子机理,项目批准号:31972537.猪肉是我国最主要的动物型蛋白食物,生产和消费量占全球的一半以上,使得猪肉产量和品质的遗传改良成了我国育种工作者最为关注的问题.猪肉相关的宏观性状,如生长速度、猪肉品质等最终由成肌细胞增殖或分化相关基因的功能所决定,深入挖掘这些基因的表达调控机制,对阐明影响猪肉生长速度、品质性状形成的分子机理具有重要意义.

miRNA与乳腺癌治疗抵抗的关系及机制研究进展

miRNA是一类内源性非编码RNA，负责转录后调节，几乎参与细胞内所有生物过程。它位于肿瘤相关基因区域，并通过放松对肿瘤基因的监控参与肿瘤的发生。近年来miRNA作为肿瘤原癌基因或肿瘤抑制基因已有报道［1-2］，一些miRNA抑制肿瘤的生长和转移，如miRNA?29c可通过直接结合和调节TGFB诱导因子同源框2（TGIF2），CAMP反应元件结合蛋白5（CREB5）和V?Akt小鼠胸腺瘤病毒癌基因同源物3（AKT3）发挥其生长抑制作用［2］。

ox-LDL刺激对冠心病患者单核细胞ATP结合盒转运体A1反应性的影响

目的研究在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激下冠心病患者单核细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)的表达水平及ABCA1在动脉粥样硬化(AS)中的作用机制。方法分别取冠心病患者(42例)及正常对照者(40例)新鲜血液中的单核细胞,利用密度(1.077)梯度离心法分离,PE荧光标记ABCA1,采用流式细胞仪检测其在单核细胞中的表达量。ox-LDL(30mg/L)刺激单核细胞24h后,观察两组ABCA1表达量的变化情况,分析ABCA1表达量与血脂的相关性。结果冠心病组高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、载脂蛋白A1(apoA1)表达量分别为1.15±1.40,1.19±0.17,与正常对照组(分别为1.36±0.40,1.34±0.22)相比明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。ox-LDL刺激后两组ABCA1表达量均增加,冠心病组单核细胞ABCA1表达量与刺激后表达量增加幅度(ΔABCA1)(分别为9.80±4.62,4.36±2.34)均较正常对照组(分别为29.35±5.17,7.43±1.51)低,差异有统计学意义(P<0.05)。ABCA1表达量与血脂无明显相关性(P>0.05)。结论冠心病患者体内高浓度ox-LDL对ABCA1表达有抑制作用,ABCA1的损伤和异常血脂谱均使患者逆胆固醇转运(RCT)降低,在AS及冠心病的发生、发展中起着重要作用。

家蚕AGO1蛋白结合RNA的分离与鉴定

RNA诱导的基因沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)核心蛋白为Argonaute(AGO)家族蛋白,作为miRNA及RNAi功能途径中的关键蛋白,能够结合miRNA和siRNA,降解靶标基因mRNA或抑制其翻译。因此,利用AGO蛋白抗体通过免疫沉淀分离其结合RNA是目前规模化分离鉴定miRNA及相关小RNA靶基因的重要方法。首先对家蚕AGO1基因进行克隆表达和抗体制备,用自制的兔多克隆抗体免疫沉淀家蚕组织内源BmAGO1蛋白,成功分离BmAGO1蛋白结合的RNA;同时在BmN细胞中采用6×His标签融合表达BmAGO1蛋白,用His单抗免疫沉淀His-BmAGO1蛋白,同样成功分离获得其结合RNA。qRT-PCR检测发现,BmAGO1蛋白结合的RNA中含有家蚕miRNA靶基因BmEm4的mRNA。研究结果为批量鉴定家蚕miRNA靶基因奠定了基础,同时也为深入研究BmAGO1蛋白在家蚕中的功能提供了依据。

胃癌MKN-45细胞株侧群细胞中关键miRNAs筛查及初步分析

目的探索胃癌细胞miRNA表达情况并确定MKN-45胃癌细胞株侧群(side population,SP)细胞中的关键miRNA。方法利用荧光活化的细胞分选技术及Hoechst 33342荧光染料标记胃癌侧群细胞,用miRNA基因芯片检测胃癌侧群细胞及主群细胞的表达情况,根据miRNA差异表达情况及生物信息学预测结果筛查关键miRNA。结果设定miRNA表达差异在1.5倍及以上为差异显著,发现侧群细胞和主群细胞相比,表达升高和降低的miRNA各有34条;经实时RT-PCR验证及生物信息学预测发现,表达下调的hsa-miR-3175和hsa-mi R-203及表达上调的hsa-mi R-130a,hsa-miR-324-5p,hsa-miR-34a和hsa-mi R-25-star在维持及调控侧群细胞的特性方面具有重要作用。结论胃癌细胞MKN-45侧群细胞中差异表达的miRNA为hsa-miR-3175,hsa-miR-203,hsa-miR-130a,hsa-miR-324-5p,hsa-miR-34a和hsa-miR-25-star,但是否在维持及调控侧群细胞的特性方面具有重要作用还需进一步研究证实。

ABCE1基因在非小细胞肺癌内相关调节miRNA的筛选

目的：筛选ATP结合盒E1（ABCE1）基因的相关调节miRNA，为诊治肺癌提供新思路。方法选取20例非小细胞肺癌患者，其中男性13例，女性7例；年龄45～73岁，平均年龄62.9岁。鳞癌11例，腺癌9例。应用生物信息学预测ABCE1基因上游的miRNA，通过实时定量聚合酶链反应（RT-Q-PCR）及免疫组织化学方法，对标本非小细胞癌组织和癌旁组织进行检测，并进行统计学分析，从中筛选出目的miRNA。结果生物信息软件预测7个最有可能调节 ABCE1基因的miRNA，分别为miR-29a/b/c、miR-135a/b、miR-203及miR-141；其中miR-29a/b/c、miR-135a、miR-203的表达在癌组织内较癌旁组织都有不同程度的降低，以miR-135a、miR-29c差异最为明显，与之对应ABCE1在相同的肺癌组织内表达上调（P〈0.05）；仅miR-135a与ABCE1在上述肺癌患者内表达呈现负性相关（r=-0.665，P=0.001）。结论在非小细胞肺癌内，很有可能是miR-135a负性调节ABCE1基因，两者结合可能成为诊治肺癌的新靶点。

三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因R219K多态性与冠心病相关性的荟萃分析

目的研究中国人群ATP结合盒转运体A1(ABCA1)基因R219K多态性与冠心病的相关性。方法计算机检索CBM、CNKI、万方数据库、VIP及Medline、PubMed等数据库,收集中国人群ABCA1基因R219K多态性与冠心病相关性的病例对照研究,检索时间从建库(CBM:1978;CNKI 1994;万方数据库:1989年;VIP:1989年;Medline:1966年;PubMed:2000年)至2012年2月。在评价纳入研究质量并提取有效数据后,用RevMan 5.0软件进行Meta分析。结果纳入13个文献,冠心病2363例,对照人群2328例。K等位基因较R等位基因(OR=0.66,95%CI:0.60～0.71,P<0.01)、携带RK+KK较RR基因型(OR=0.60,95%CI:0.53～0.68,P<0.01)、RK较RR基因型(OR=0.67,95%CI:0.59～0.76,P<0.01)、KK较RR基因型(OR=0.45,95%CI:0.38～0.53,P<0.01)人群发生冠心病的风险更低。结论中国人群ABCA1基因R219K多态性与冠心病的发生、发展有一定关联,而ABCA1的K等位基因是冠心病的保护因素。

2型糖尿病患者外周血单核细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1的变化及其意义

目的初步分析2型糖尿病患者血脂及外周血单核细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)的变化,以及2型糖尿病患者ABCA1的变化与血脂、糖代谢的相关性。方法分别取2型糖尿病组及对照组(各40例)外周血中的单核细胞,利用抗原、特异性一抗及PE荧光标记的二抗间的相互反应,在流式细胞仪上检测氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激前后ABCA1的表达变化,同时在空腹情况下检测血脂及空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1C)。分析2型糖尿病患者ABCA1表达变化与年龄、血脂水平和糖代谢的相关性。结果与对照组相比,2型糖尿病组甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)[即非高密度脂蛋白胆固醇(NHDL-C)]水平显著升高(P<0.01),血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、载脂蛋白A1(apoA1)的水平及外周血单核细胞ABCA1的表达显著降低(P<0.01)。ox-LDL刺激24h后,2型糖尿病组ABCA1的变化量(刺激后表达量/初始表达量)明显高于对照组ABCA1的变化量(P<0.01),但最终表达量仍显著低于对照组(P<0.01);ox-LDL刺激后2型糖尿病组AB-CA1的改变量与HDL-C呈正相关。结论2型糖尿病患者体内存在受损的胆固醇逆转运及血脂谱,具有诱发动脉粥样硬化(AS)和冠心病的基础。

ABCA1基因启动子区域VNTR-ZNF位点多态性及与血浆HDL水平的关系

目的:探讨腺苷三磷酸结合盒转运体A1(ABCA1)基因启动子区域VNTR-ZNF位点多态性的分布频率及其与血浆高密度脂蛋白(HDL)水平的关系。方法:随机抽取166例冠心病患者和99例健康对照者,采用PCR扩增法和聚丙烯酰胺凝胶电泳对VNTR-ZNF位点ACCCC插入和缺失进行检测。结果:被检总人群ABCA1基因VNTR-ZNF位点等位基因频率分别为插入型为31.3%(166/530),缺失型68.7%(364/530);基因型频率分别为插入型6.4%(17/265),缺失型43.8%(116/265),插入/缺失型49.8%(132/265),2组间基因型频率和等位基因频率比较差异无统计学意义,血浆HDL及HDL亚组水平在3种基因型间差异亦无统计学意义(P>0.05)。结论:天津地区ABCA1基因的VNTR-ZNF位点基因型分布与欧洲地区不同,此基因变异对血浆HDL水平无明显影响。

家蚕Argonaute2的表达分析及其结合RNA的初步研究

从家蚕cDNA文库中扩增到家蚕BmAGO2基因完整的ORF序列,通过Lasergene软件分析获得BmAGO2的抗原表位区(命名为Kago2),构建含Kago2的表达载体,转化大肠杆菌诱导表达,融合蛋白经镍柱亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA和Western blotting检测抗血清的效价可达到1∶25 600以上,抗体特异性较好。表达谱分析结果显示,BmAGO2蛋白在家蚕卵期、蛹期、蛾期和五龄幼虫期均表达,但在蛹期表达量要偏低。而在五龄幼虫各组织中BmAGO2蛋白的表达差异较明显,BmAGO2蛋白在头部和表皮中大量表达,丝腺、马氏管和脂肪中也有少量表达,而在血淋巴、气管和中肠中未检测到该蛋白的表达。结合BmAGO2表达谱分析结果,进一步利用其抗体通过免疫共沉淀方法从BmAGO2蛋白表达量高的家蚕头部和表皮中分离出BmAGO2蛋白及结合的RNA,并逆转录成cDNA。以家蚕miRNA潜在的靶基因Bmem4,Bm(spl)-like,Bmemc,Bmmγ,Bmmβ2作为检测基因,荧光定量PCR分析获得的BmAGO2结合RNA,和对照组RNA相比,Bmem4,Bm(spl)-like,Bmemc,Bmmγ,Bmβ2基因在BmAGO2结合RNA中的含量分别富集了3.93、1.31、2.4、1.31、0.97倍。miRNA靶位点分析表明,Bmem4和Bmemc存在多个miRNA结合位点,极有可能是miRNA的靶基因。目前还没有有效的家蚕miRNA靶基因高通量鉴定方法,本实验为家蚕miRNA靶基因的高通量筛选提提供了可靠地实验途径。

黑腹果蝇miRNA前体的预测

MicroRNA(miRNA)是一类长度约23 nt的内源性单链小分子RNA,它通过与靶标结合位点区域的碱基互补结合来调控靶标基因的表达。通过寻找潜在的miRNA结合位点预测miRNA前体,首先在黑腹果蝇mRNA的3’UTR区域中搜寻潜在的miRNA结合位点,然后根据碱基配对原则以及miRNA前体的结构序列特征来预测可能存在的miRNA前体。在黑腹果蝇全基因组范围内对其miRNA的预测结果证实了该方法的有效性。该方法还可应用到其他物种的miRNA发现研究中。

阿托伐他汀诱导EPC-MVs增多对STEMI患者心肌细胞的保护作用研究

目的:观察阿托伐他汀诱导内皮祖细胞微囊泡(EPC-MVs)增多对ST段抬高型心肌梗死(STEMI)患者心肌细胞的保护作用,并探讨其可能机制。方法:选取2015年2月-2018年2月我院收治的STEMI患者168例,按阿伐他汀剂量分为A组(88例)和B组(94例)。所有患者均接受经皮冠脉介入治疗,术后予注射用比伐芦定、硫酸氢氯吡格雷片、阿托伐他钙片治疗。其中,A组予阿托伐他汀钙片20 mg,每日1次;B组予阿托伐他汀钙片20 mg,每日2次。30 d为1个疗程,两组患者均连续治疗至少3个疗程。观察两组患者血脂[总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)]水平(治疗前及治疗后第30、60、90天)和EPCs阳性细胞数(治疗后第30、60天);检测其EPC-MVs微RNA(miRNA)表达谱(治疗后第60天),验证差异表达miRNA的表达情况;分析表达差异最明显miRNA的靶基因及KEGG通路富集情况,并评价其对心肌HCM-a细胞增殖的影响;记录两组患者不良反应发生情况。结果:A组有8例患者脱落,B组有6例患者脱落。治疗前或治疗后30天,两组患者TC、LDL-C、HDL-C水平以及外周血EPCs阳性细胞数比较,差异均无统计学意义(P>0.05);治疗后,两组患者HDL-C水平(治疗后第60、90天)以及B组患者外周血EPCs阳性细胞数(治疗后第60天)均显著升高或增多,且B组显著高于或多于同时间点A组(P<0.05)。芯片检测结果显示,与A组比较,B组患者EPC-MVs中表达差异超过1.5倍的miRNA共有16个,其中7个上调、9个下调;差异表达前5位的分别为hsa-miR-126(上调)、hsa-miR-1275(上调)、hsa-miR-7704(下调)、hsa-miR-105-5p(下调)、hsa-miR-3180(下调)。荧光定量聚合酶链反应结果显示,B组患者hsa-miR-126、hsa-miR-1275的相对表达量均较A组显著升高,hsa-miR-7704、hsa-miR-105-5p、hsa-miR-3180的相对表达量均较A组显著降低(P<0.05)。表达差异最明显的为hsa-miR-126,其靶基因包括Ang-1、PDGF、p38 MAPK、Smad2/3、HIF-1、TGF-β等,参与调节的信号通路主要包括血管生成信号通路、慢性骨髓性白血病相关通路、肾上皮细胞癌相关通路等。CCK-8试验结果显示,hsa-miR-126特异性干扰物组细胞的光密度(OD)值较空白组显著降低,模拟物组细胞的OD值较空白组显著升高(P<0.05)。两组患者腹泻、恶心呕吐、皮疹等不良反应发生率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:不同剂量的阿托伐他汀均可调节患者体内HDL-C水平,大剂量阿托伐他汀可显著提高EPCs数量,且不会影响用药的安全性。这种作用可能与上调EPC-MVs中hsa-miR-126等的表达从而促进心肌细胞增殖有关。