透明质酸微球的制备及细胞毒性的研究

目的:构建适宜牙髓再生的透明质酸(HA)微球支架,评价其作为细胞载体的可行性。方法:乳化交联法制备透明质酸微球,SEM观察其形貌特征及粒径大小,将该微球材料与人牙髓干细胞(hDPSCs)共培养,MTT实验检测hDPSCs在微球存在的微环境内的增殖情况。结果:乳化交联法可制备透明质酸微球,该微球规则、圆整、粒径5~10μm;透明质酸微球浓度0.05~0.8 mg/ml作用24~72 h不抑制hDPSCs增殖,细胞毒性为0级。结论:透明质酸微球可作为应用hDPSCs的载体。

miR-206靶向调控CXCR4对人牙髓干细胞迁移能力的影响

目的:探讨miR-206对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)迁移能力的影响及其机制。方法:收集正常和牙髓炎状态牙齿,分离培养人牙髓干细胞,检测牙髓组织和h DPSCs中miR-206和CXCR4的表达;分别转染miR-206 inh ibitor、miR-206 mimics和对照组;Transw ell小室实验检测细胞迁移能力;qPCR检测miR-206和CXCR4 mRNA的表达;Western blot检测CXCR4蛋白水平的表达,生物信息学分析miR-206的靶基因,双荧光素酶报告实验验证,共转染miR-206 inhibitor和CXCR4 siRNA,分析共转染后对CXCR4表达及细胞迁移能力的影响。结果:炎症牙髓组织和h DPSCs中miR-206的表达水平显著下调,而CXCR4的表达水平明显升高;miR-206过表达可明显抑制h DPSCs的迁移能力和CXCR4的表达,抑制miR-206的表达,则结果相反;通过生物信息学分析miR-206的潜在靶基因含有CXCR4,双荧光素酶报告实验验证CXCR4为miR-206的靶基因;进一步研究表明沉默CXCR4可逆转miR-206 inhibitor对牙髓干细胞迁移的促进作用。结论:miR-206可靶向调控CXCR4影响人牙髓干细胞迁移能力,提示miR-206在h DPSCs损伤修复过程中发挥着重要作用。

腺病毒介导表皮生长因子体外转染人牙髓干细胞对其凋亡的影响

目的通过体外培养人牙髓干细胞(Human dental pulp stem cells,hDPSCs),观察重组腺病毒介导的表皮生长因子(Recombinant adenovirus mediated epidermal growth factor,rAd-EGF)转染至hDPSCs后对其凋亡的影响。方法 rAd-EGF转染hDPSCs后,采用RT-PCR检测EGF mRNA的表达情况,用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测hDPSCs的凋亡情况。结果在一定时间内,rAd-EGF转染入hDPSCs,实验组hDPSCs中EGF mRNA的表达水平相对于阴性对照组与空白组均明显上调(P<0.05),并且同阴性对照组与空白组比较,实验组hDPSCs体外凋亡指数明显降低(P<0.05)。结论 rAd-EGF转染入hDPSCs,EGF mRNA的表达量增加,在短期内对其凋亡具有抑制作用。

炎症状态下A20基因沉默对人牙髓干细胞增殖及分化的影响

目的:探讨在体外模拟炎症状态下,A20基因沉默对人牙髓干细胞(h DPSCs)增殖及分化能力的影响。方法:用脂多糖(LPS)刺激h DPSCs,Western-Blot技术检测不同时间点锌指蛋白A20表达量的变化;通过RNA干涉技术构建A20基因沉默的细胞模型,CCK-8法检测细胞增殖能力;矿化液诱导培养后,用碱性磷酸酶检测试剂盒测定ALP的活性,茜素红染色观察矿化结节的形成,并用RT-PCT检测成牙/成骨分化相关基因ALP、DSPP、OCN、RUNX2表达水平。结果:h DPSCs在LPS刺激2 h后,A20的表达即显著增加,在接近72 h时其表达量恢复至基础水平;在模拟炎症状态下,与对照组相比,A20基因沉默后的h DPSCs,其增殖能力明显降低(P<0.05),ALP的活性、矿化结节的形成、成牙/成骨分化相关基因的表达水平均受到抑制(P<0.05)。结论:在炎症状态下,A20在早期呈现一过性的高表达,A20基因沉默能够抑制h DPSCs的增殖及分化能力。

ERK信号通路在人牙髓干细胞增殖与分化中的作用

目的:探讨细胞外信号调节激酶(ERK)通路是否参与对人牙髓干细胞(h DPSCs)增殖及分化过程的调控。方法:用不同浓度的ERK通路抑制剂U0126干预h DPSCs,用CCK-8法检测细胞增殖;在矿化液诱导条件下,用不同浓度U0126干预h DPSCs 14 d,茜素红染色观察矿化结节的形成,RT-PCR检测成骨/成牙相关基因ALP、OCN、DSPP及BSP的表达;Western blot检测U0126(25μmol/L)干预后,ERK通路活性的变化。结果:不同浓度的U0126对h DPSCs的增殖能力无显著影响(P>0.05);与对照组相比,不同浓度的U0126对矿化结节的形成和成骨/成牙相关基因ALP、OCN、DSPP及BSP的表达均有抑制作用,25μmol/L U0126的抑制作用最明显(P<0.05);Western blot结果显示随着时间的延长,p-ERK的表达量逐步增加,在加入25μmol/L U0126后,p-ERK表达量下降(P<0.05)。结论:ERK信号通路可能不参与对h DPSCs增殖的调控,而在促进h DPSCs成骨/成牙分化过程中起调控作用。

GDF11通过介导PI3K/AKT通路对人牙髓干细胞体外矿化能力的影响研究

目的:探究GDF11在人牙髓干细胞(hDPSCs)矿化过程中的作用及潜在机制。方法:收集拔除的25岁以下患者第三磨牙组织,用成骨培养基诱导培养原代hDPSCs,对传代培养的细胞进行流式细胞术hPDSCs鉴定。用RNA干扰技术对hDPSCs进行生长分化因子11(GDF11)基因敲减实验。免疫荧光染色用于验证hDPSCs中GDF11的表达和分布,商业试剂盒用于检测hDPSCs牙源性分化和矿化能力;qRT-PCR用于检测牙本质相关标志物(牙本质唾液酸磷蛋白(DSPP)、骨钙素(OCN)和Ⅰ型胶原α1链(COL1a1))的表达水平;Western Blot用于检测PI3K/AKT信号通路中相关蛋白分子的蛋白磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)和磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR))表达水平。结果:GDF11在hDPSCs中表达主要分布在细胞质中,敲减GDF11后可减弱牙源性分化和矿化能力(P<0.05),导致牙本质标志物相关基因DSPP、OCN和COL1a1的转录水平显着下调(P<0.05),并下调PI3K/AKT信号通路中相关蛋白分子的蛋白p-AKT和p-mTOR表达(P<0.05)。结论:GDF11通过PI3K/AKT信号通路正向调节h DPSCs的牙源性分化和矿化。

超顺磁氧化铁纳米颗粒对人牙髓干细胞生物学影响的体内外研究

目的：探讨不同浓度超顺磁氧化铁纳米颗粒（SPIO）在体内外对人牙髓干细胞（h DPSCs）活力、增殖和成骨分化的影响。方法：用不同浓度SPIO标记h DPSCs后,体外条件下对其活力、增殖、分化等进行观察;然后将细胞/支架复合物植入裸鼠皮下,观察体内条件下SPIO对h DPSCs成骨分化的影响。结果：25、50μg/m L的SPIO不影响h DPSCs的活力,100μg/m L的SPIO抑制细胞活力;25、50μg/m L的SPIO在1~3 d促进细胞增殖,而100μg/m L的SPIO则抑制细胞增殖且促进其凋亡。25μg/m L的SPIO在体外和体内条件下对h DPSCs的成骨分化均无明显影响。结论：25μg/m L的SPIO可以有效标记h DPSCs,在早期可促进其增殖,而对其成骨分化无影响。

GSK126通过Wnt/β-catenin信号通路调控牙周膜干细胞成骨分化能力

目的体外研究GSK126对人牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)成骨分化能力的影响及调控机制。方法分离培养人牙周膜干细胞,检测牙周膜干细胞矿化诱导前后EZH2和H3K27me3的表达;新型EZH2抑制剂(GSK126)加入成骨诱导液培养后,qPCR检测EZH2和成骨基因(RUNX2、ALP、OCN)mRNA水平的表达;Western blot检测H3K27me3及β-catenin蛋白水平的表达,茜素红染色观察细胞成骨分化能力的变化;检测Wnt/β-catenin抑制剂(XAV939)对GSK126作用后细胞成骨分化能力的影响。结果成骨诱导后牙周膜干细胞中成骨基因(RUNX2、ALP、OCN)的表达水平明显升高,而EZH2和H3K27me3的表达水平显著下调;GSK126可显著抑制EZH2、H3K27me3的表达,但明显促进hPDLSCs的成骨分化能力及β-catenin蛋白水平的表达;进一步实验结果表明XAV939可逆转GSK126对牙周膜干细胞成骨分化的促进作用。结论GSK126可通过Wnt/β-catenin信号通路调控人牙周膜干细胞成骨分化能力,提示新型小分子药物GSK126在hPDLSCs组织工程损伤修复中具有潜在重要作用。