磷脂酰肌醇3激酶抑制剂对17β-雌二醇作用下Ishikawa、HEC-1A细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂LY294002对17β-雌二醇(E2)作用下子宫内膜癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响,初步探讨阻断PI3K/Akt通路治疗子宫内膜癌的可能性。方法:应用MTT法(10-10mol/L、10-8mol/L、10-6mol/L、10-4mol/L的E2或10-6mol/LE2及0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L的LY294002)、流式细胞技术(0mol/L、10-8mol/L、10-6mol/LE2或10-6mol/LE2及0μmol/L、1μmol/L、50μmol/LLY294002)观察LY294002对E2作用下子宫内膜癌细胞Ishikawa、HEC-1A增殖、凋亡和细胞周期的影响。结果:随着E2浓度的增加,Ishikawa细胞A(570nm)值逐渐升高并呈时间依赖性(F=3.915,P=0.043),G0-G1期比例下降(F=50.926,P≤0.001),S期比例升高(F=17.836,P=0.001);而HEC-1A细胞周期各期比例无变化(P>0.05)。随着LY294002浓度的增加,2种细胞A(570nm)值逐渐下降并呈现时间依赖性(F=10.398,P=0.001;F=5.542,P=0.043),而且G0-G1期比例(F=32.024,P≤0.005;F=14.725,P≤0.017)升高,S期(F=30.132,P≤0.001;F=24.72,P≤0.01)比例下降。50μmol/L和100μmol/LLY294002作用2种细胞48h后,凋亡细胞百分比均增加(P<0.001)。结论:LY294002可以抑制E2对子宫内膜癌细胞的增殖,促使其发生凋亡,抑制细胞周期进展,使细胞周期停滞在G1期。PI3K/Akt信号传导通路可作为治疗子宫内膜癌的新靶点。

二甲双胍对LKB1基因过表达的子宫内膜癌HEC-1A细胞的影响

目的研究二甲双胍对LKB1基因过表达的子宫内膜癌HEC-1A细胞的增殖与细胞周期的影响。方法以不同浓度的二甲双胍作用于LKB1基因过表达的子宫内膜癌HEC-1A细胞(LKB组)与缺失LKB1基因表达的HEC-1A细胞(CON组)。用流式细胞术仪检测各组HEC-1A细胞的细胞周期;RT-PCR法和Western blot技术检测各组HEC-1A细胞的LKB1、m TOR基因与蛋白的表达;以平板克隆法与细胞迁移实验检测各组细胞的细胞增殖水平。结果与缺失LKB1基因表达的HEC-1A细胞比较,LKB1基因过表达的HEC-1A细胞随着二甲双胍浓度的升高明显降低细胞克隆形成率、细胞迁移率、S期细胞比例及m TOR基因与蛋白的表达,而增加G0/G1期细胞比例及LKB1基因与蛋白的表达,差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论二甲双胍抑制LKB1基因过表达的子宫内膜癌HEC-1A细胞的生长和侵袭,其机制可能为介导LKB1/m TOR信号传导通路而抑制子宫内膜癌细胞的增殖。

环巴胺对子宫内膜癌HEC-1A细胞迁移、周期及自噬的影响

目的探讨环巴胺(cyclopamine,CYP)对子宫内膜癌HEC-1A细胞迁移、周期及自噬的影响。方法分别用0、5、10、20、40μmol/L CYP处理HEC-1A细胞24和/或48 h,瑞氏吉姆萨染色后观察细胞形态改变,划痕试验检测细胞迁移能力,流式细胞术检测细胞周期及自噬微管相关蛋白轻链3B(light chain 3B,LC3B)的表达,Western blot法检测LC3-B蛋白表达水平。结果随着CYP浓度的增加,HEC-1A细胞数目减少,细胞密度逐渐降低,出现空泡化、核碎裂等现象逐渐加重;HEC-1A细胞的迁移率显著下降(P<0.05);HEC-1A细胞处于G0/G1期的比例显著增加(P<0.05);表达LC3B蛋白的HEC-1A细胞百分比显著上升(P<0.05),且HEC-1A细胞中的LC3B蛋白表达水明显增高(P<0.05)。结论 CYP可阻滞子宫内膜癌HEC-1A细胞周期运转,引发细胞自噬,从而抑制细胞存活及迁移。

RNA干扰抑制高迁移率族蛋白1表达对子宫内膜癌细胞株HEC-1A的增殖抑制作用及对细胞周期和细胞凋亡的影响

目的探讨通过RNA干扰阻滞高迁移率族蛋白1(HMGB1)的表达水平对子宫内膜癌(EC)细胞株HEC-1A中的细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响。方法将细胞分为以下三组:空白对照组(HEC-1A细胞未感染)、阴性对照组(HEC-1A细胞感染无关序列)、干预组(慢病毒转染HEC-1A细胞)。通过Western blot法对三组HEC-1A细胞中的HMGB1蛋白表达水平进行检测,并采用实时荧光定量PCR对HMGB1 mRNA相对表达量进行检测。采用MTT法对HEC-1A细胞增殖情况进行检测,用流式细胞术对HEC-1A细胞周期变化进行检测,同时用Annexin VFITC/PI法对HEC-1A细胞凋亡情况进行检测。采用Western blot法对转染HMGB1-siRNA后细胞cyclin D1、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)及磷酸化Akt(p Akt)蛋白表达进行检测。结果相比空白对照组与阴性对照组,干预组HEC-1A细胞中HMGB1蛋白表达水平显著下降(P <0. 01)。经实时荧光定量PCR检测结果可知相比空白对照组与阴性对照组,干预组HEC-1A细胞中HMGB1 mRNA相对表达量显著下降(P <0. 01)。相比空白对照组、阴性对照组,干预组cyclin D1和p Akt蛋白表达显著下降(P <0. 01);而三组Akt蛋白表达水平的比较,并无显著差异(P> 0. 05)。相比空白对照组、阴性对照组,干预组HEC-1A细胞在570 nm波长处的吸光度值显著下降(P <0. 01)。干预组HEC-1A细胞G0/G1期比率在整个细胞周期分布中的比率最高,其较空白对照组、阴性对照组显著升高(P <0. 01);干预组HEC-1A细胞S期比率、G2/M期比率较空白对照组、阴性对照组显著下降(P <0. 01)。干预组HEC-1A细胞凋亡比率较空白对照组、阴性对照组显著升高(P <0. 01)。结论 HMGB1表达降低可有效阻滞EC细胞株HEC-1A的增殖,使得细胞于G0/G1期受阻,同时可有效促进细胞凋亡,其作用机制可能在于降低cyclin D1蛋白表达和干扰磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路。

过表达miR-136-5p对子宫内膜癌HEC-1A细胞增殖、侵袭以及凋亡的影响

目的探讨miR-136-5p和E2F1在子宫内膜癌中的表达以及过表达miR-136-5p对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。方法通过生物信息学网站分析TCGA数据库中子宫内膜癌miR-136-5p以及E2F1mRNA和蛋白的表达。采用miR-136-5p模拟物转染子宫内膜癌HEC-1A细胞,设置空白组(未进行转染)、miR-136-5p阴性对照组(转染无义序列)、miR-136-5p模拟物转染组(转染miR-136-5p模拟物),采用CCK-8方法检测各组HEC-1A细胞的增殖能力,Transwell实验检测各组HEC-1A细胞的侵袭能力,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,Western blot检测HEC-1A细胞E2F1蛋白表达,应用Targetscan软件预测E2F1是否为miR-136-5p的靶基因,应用双荧光素酶报告基因实验验证。结果生物信息学分析显示,与正常组相比,子宫内膜癌组织中miR-136-5p表达下调,E2F1的mRNA和蛋白表达上升。miR-136-5p模拟物转染组HEC-1A细胞中miR-136-5p表达上升,细胞增殖能力下降、侵袭能力下降,细胞凋亡率上升。miR-136-5p过表达组HEC-1A细胞中E2F1蛋白表达下降,生物信息学分析结果显示,E2F1是miR-136-5p的靶基因,双荧光素酶实验证实E2F1为miR-136-5p的靶基因。结论过表达miR-136-5p可以抑制HEC-1A细胞增殖与侵袭,促进凋亡,其机制可能与调控E2F1的表达相关。

RAD001通过诱导自噬提高人子宫内膜癌细胞对紫杉醇的敏感性

目的:探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂RAD001通过诱导细胞自噬增强紫杉醇杀伤子宫内膜癌细胞作用的机制。方法:用MTT法检测RAD001对人子宫内膜癌Ishikawa和HEC-1A细胞的生长抑制作用,用激光共聚焦显微镜观察GFP-LC3蛋白的聚集;用流式细胞术检测细胞死亡;用Western blotting方法检测LC3-I、LC3-II、mTOR及ULK1蛋白的表达;用靶向ULK1的siRNA特异性地抑制Ishikawa细胞中ULK1的表达,再检测相关指标。结果:RAD001可抑制Ishikawa和HEC-1A细胞的增殖,提高它们对紫杉醇的敏感性。RAD001诱导Ishikawa和HEC-1A细胞发生自噬及自噬性细胞死亡。RAD001通过抑制mTOR/p70S6K通路、上调ULK1诱导自噬,从而产生紫杉醇增敏作用。结论:RAD001可以通过抑制mTOR信号通路,上调ULK1的表达,诱导自噬性细胞死亡的发生,从而提高子宫内膜癌细胞对紫杉醇的敏感性。

miR-195靶向AEG-1基因对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响及机制研究

目的探讨miR-195对子宫内膜癌HEC-1A细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响,并初步探讨其作用机制。方法采用脂质体介导将miR-195模拟物(mimics)转染至HEC-1A细胞为miR-195组,转染阴性对照和未转染的HEC-1A细胞分别为NC组和Blank组。qPCR检测各组HEC-1A细胞中miR-195的表达水平,MTT和流式细胞术分别检测细胞增殖和凋亡情况,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,qPCR和Westernblot检测AEG-1mRNA和蛋白表达水平,双荧光素酶报告基因实验验证miR-195和HEC-1A的靶向关系。结果与Blank组和NC组比,miR-195组HEC-1A细胞中miR-195的表达水平明显上调(P<0.05),OD值明显降低(P<0.05),凋亡率明显升高(P<0.05),迁移和侵袭细胞数显著减少(P<0.05),AEG-1mRNA和蛋白表达水平明显下调(P<0.05),双荧光素酶报告基因实验结果显示,AEG-1-Wt组中miR-195组HEC-1A细胞的相对荧光活性显著低于NC组(P<0.05),AEG-1-Mut组中miR-195组HEC-1A细胞的相对荧光活性与NC组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 miR-195能够抑制子宫内膜癌HEC-1A细胞增殖、迁移和侵袭,并促进HEC-1A细胞凋亡,该过程可能与靶向调控AEG-1的表达有关。

miR-214靶向TWIST1对子宫内膜癌细胞迁移、侵袭及上皮-间质转化的影响

目的:探讨微小RNA(miR)-214靶向Twist相关蛋白1(TWIST1)对子宫内膜癌HEC-1A细胞迁移、侵袭和上皮间质转化的影响。方法:将miR-214模拟物(mimics)转染至HEC-1A细胞后,实时荧光定量PCR检测细胞中miR-214和TWIST1 mRNA表达;双荧光素酶报告基因实验检测miR-214和TWIST1靶向关系;将体外培养的HEC-1A细胞分为Blank组、miR-214 mimics组、pcDNA-TWIST1组和miR-214 mimics+pcDNA-TWIST1组,免疫印迹法检测细胞中TWIST1、钙粘附蛋白E(E-cadherin)、N-钙粘附分子(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)蛋白表达,划痕实验检测细胞迁移,Transwell小室检测细胞侵袭。结果:转染miR-214 mimics使HEC-1A细胞中miR-214表达升高,TWIST1 mRNA表达降低;miR-214可直接靶向结合TWIST1。与Blank组比较,miR-214 mimics组细胞中TWIST1、N-cadherin、Vimentin蛋白和划痕愈合率以及侵袭细胞数均降低,E-cadherin蛋白表达升高,而pcDNA-TWIST1组细胞中TWIST1、N-cadherin、Vimentin蛋白和划痕愈合率以及侵袭细胞数均升高,而E-cadherin蛋白表达降低(均P<0.05)。与pcDNA-TWIST1组比较,miR-214 mimics+pcDNA-TWIST1组细胞中TWIST1、N-cadherin、Vimentin蛋白表达和划痕愈合率以及侵袭细胞数均降低,E-cadherin蛋白表达升高(均P<0.05)。结论:miR-214可通过靶向调控TWIST1抑制子宫内膜癌HEC-1A细胞迁移、侵袭和上皮-间质转化。

两株子宫内膜癌细胞中mTOR信号通路激活的研究

目的探讨PTEN缺失Ishikawa和PTEN完整HEC-1A细胞中mTOR信号通路的激活。方法激光共聚焦显微镜检测Ishikawa和HEC-1A细胞中PTEN蛋白表达;RT-PCR和western blot法从mRNA和蛋白水平分别检测mTOR mRNA和下游磷酸话靶蛋白S6K1和4E-BP1表达。结果Ishikawa细胞中PTEN蛋白表达缺失,HEC-1A细胞PTEN蛋白表达显著(P<0.01);两株细胞中均存在mTOR mRNA表达,而Ishikawa细胞中表达水平要高于HEC-1A细胞(P<0.05);Ishikawa细胞中S6K1和4E-BP1蛋白的磷酸化要明显高于HEC-1A细胞(P<0.05)。结论两株子宫内膜癌细胞中均存在mTOR信号通路的激活,这种激活水平与PTEN相关,PTEN缺失Ishikawa细胞的激活水平较高。

miR-373-3p低表达慢病毒载体构建及其对子宫内膜癌细胞增殖迁移的抑制作用

目的构建人miR-373-3p低表达慢病毒载体,探讨miR-373-3p低表达对子宫内膜癌HEC-1A细胞增殖和迁移能力的影响。方法利用PCR扩增包含miR-373-3p前体序列的目的基因,经酶切后克隆入慢病毒载体GV280中构建GV280-pre-miR-373-3p inhibitor表达载体,通过与包装质粒共转染293T细胞,进行慢病毒的包装和滴度测定。分别用空载慢病毒(空载病毒组)及重组慢病毒miR-373-3p(miR-373-3p组)感染HEC-1A细胞,并设立空白对照组。采用RT-PCR法检测细胞miR-373-3p mRNA的相对表达水平,CCK-8法检测培养24、48、72、96 h时细胞增殖活力,细胞划痕和Transwell小室试验检测培养24、48 h时细胞迁移能力。结果成功构建了人miR-373-3p低表达慢病毒载体。与空白对照组和空载病毒组比较,miR-373-3p组miR-373-3p相对表达量低,培养48、72、96h HEC-1A细胞增殖活力均降低(P均<0.05),24、48 h HEC-1A细胞划痕面积迁移率低,24 h穿膜细胞数少(P均<0.05)。空载病毒组及空白对照组各指标比较,P均>0.05。结论成功构建了人miR-373-3p低表达慢病毒载体,miR-373-3p低表达可抑制人子宫内膜癌细胞HEC-1A的增殖、迁移能力。

GPR30下调对子宫内膜癌细胞及裸鼠移植瘤组织PI3K/Akt信号通路的影响

目的:探讨G蛋白偶联受体(GPR30)下调对子宫内膜癌细胞及裸鼠移植瘤组织PI3K/Akt信号通路的影响。方法:采用免疫细胞化学SP法观察子宫内膜癌细胞系HEC-1A和Ishikawa细胞中GPR30、Akt和磷酸化Akt(p-Akt)蛋白的定位。以p GFP-V-RS(对照)和p GFP-V-RS-GPR30(干扰)分别转染两种细胞,用蛋白印迹法检测两种细胞中GPR30、Akt及p-Akt蛋白的表达水平。构建裸鼠移植瘤模型(分别接种上述4种转染细胞,共4组),用免疫组化SP法检测4组裸鼠移植瘤组织中p-Akt蛋白的表达。结果:1HEC-1A和Ishikawa细胞中,GPR30、Akt和p-Akt蛋白阳性表达均呈棕黄色,定位于细胞质。2稳定转染p GFP-V-RS-GPR30的两种细胞株中GPR30和p-Akt的表达均下调(P<0.05)。3与接种转染p GFP-V-RS细胞的2组裸鼠相比,接种转染p GFP-V-RS-GPR30细胞的2组裸鼠移植瘤组织中p-Akt表达降低。结论:在子宫内膜癌细胞及裸鼠移植瘤组织中,GPR30下调可能抑制了PI3K/Akt通路的活化。

lncRNA SNHG1 在子宫内膜癌组织中的表达水平及其临床意义

目的:探讨长链非编码RNA SNHG1(long non-coding RNA SNHG1,lncRNA SNHG1)在子宫内膜癌组织中的表达水平,分析其在子宫内膜癌中的作用机制及其临床意义。方法:采用NCBI-GEO和TCGA数据库分析SNHG1在子宫内膜癌中的表达水平。收集2016年1月至2019年3月天津医科大学中新生态城医院手术切除的53例子宫内膜癌组织和41例正常子宫内膜组织标本,以及子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1A、正常子宫内膜细胞ESC,用qPCR检测组织和细胞中SNHG1的表达水平,并分析SNHG1表达水平与患者的临床病理特征的相关性。用MTT、Annexin V/PI染色法流式细胞术检测SNHG1对HEC-1A细胞增殖能力和凋亡水平的影响,用Transwell小室法检测HEC-1A细胞的迁移及侵袭能力。用StarBase预测并用qPCR和Western blotting验证SNHG1与RELA的调控关系,用双荧光报告基因实验、qPCR验证SNHG1影响NF-κB信号通路。结果:SNHG1在子宫内膜癌组织中的表达水平显著高于正常子宫内膜组织(P<0.01),其表达水平与肿瘤大小、TNM分期、组织学分级和淋巴结转移相关联(均P<0.05);Ishikawa和HEC-1A细胞中SNHG1的表达水平显著高于ESC细胞(均P<0.01)。过表达SNHG1可明显促进HEC-1A细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并抑制HEC-1A细胞的凋亡(均P<0.01)。SNHG1通过促进RELA的表达激活了NF-κB信号通路,并促进下游靶基因IL-6和CCL19的表达(均P<0.01)。结论:子宫内膜癌中高表达的SNHG1通过上调RELA激活NF-κB信号通路发挥其促癌的作用。

全硫代反义hTR对人子宫内膜癌细胞生长的抑制作用

目的将互补于hTR模板区的全硫代修饰型反义寡核苷酸(PS-ASODN)作用于人子宫内膜癌HEC-1A细胞,探讨端粒酶PS-ASODN对肺癌的治疗价值。方法本实验将互补于hTR模板区的PS-ASODN转染作用于人子宫内膜癌HEC-1A细胞,然后分别采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色实验、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测人子宫内膜癌HEC-1A细胞的体外增殖、端粒酶活性、细胞凋亡的改变。结果端粒酶PS-ASODN对HEC-1A细胞生长具有明显的抑制作用。0.5～1.5μM的端粒酶PS-ASODN对HEC-1A细胞作用72h后端粒酶皆为阴性,对照组端粒酶皆为阳性。结论端粒酶PS-ASODN对体外培养的子宫内膜癌HEC-1A细胞的增殖有明显的抑制作用,其抑制作用具有浓度、时间依赖性。

环状RNA MYLK对子宫内膜癌细胞生长凋亡和侵袭及上皮间质转换的影响

目的探讨环状RNA MYLK干扰对子宫内膜癌HEC-1A细胞增殖、凋亡、侵袭和上皮间质转化(EMT)的作用及对小鼠异种移植瘤生长的影响。方法MYLK-shRNAs转染HEC-1A细胞,构建MYLK干扰细胞模型。将转染后的HEC-1A细胞皮下注射裸鼠,建立移植瘤裸鼠模型。体外实验分为对照组、shRNA-NC组、circMYLK-shRNA1组、circMYLK-shRNA2组和circMYLK-shRNA3组,小鼠实验取shRNA-NC组和circMYLK-shRNA1组。RT-qPCR检测MLYK的表达并筛选出干扰效率高的干扰链;克隆形成实验检测细胞克隆形成情况;流式细胞术检测细胞凋亡;Transwell实验检测细胞侵袭;Western Blot检测EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达;免疫组化检测肿瘤组织的Ki67和Vimentin的表达。结果三种shRNAs干扰MYLK,shRNA1干扰效率最佳,用于后续实验。与对照组比较,circMYLK-shRNA1组的克隆形成率显著降低(P<0.05),细胞凋亡率显著升高(P<0.05),侵袭细胞数量显著减少(P<0.05),E-cadherin的表达显著上调(P<0.05),N-cadherin和Vimentin的表达显著下调(P<0.05)。体内实验中,与shRNA-NC组比较,circMYLK-shRNA1组肿瘤体积显著减小(P<0.05),肿瘤重量显著减轻(P<0.05),组织MYLK的表达显著下调(P<0.05),组织Ki67和Vimentin的表达显著下调(P<0.05)。结论MYLK干扰抑制了子宫内膜癌HEC-1A细胞的增殖、凋亡、侵袭和上皮间质转化,也阻碍了小鼠异种移植瘤的生长。

肿瘤转移抑制基因1及Gli1基因在子宫内膜腺癌细胞系中的表达

目的探讨肿瘤转移抑制基因1(metastasis suppressor 1,MTSS1)及Gli1基因在子宫内膜腺癌细胞系Ishikawa和HEC-1A中的m RNA的转录及蛋白表达水平。方法体外培养子宫内膜高分化腺癌细胞系Ishikawa和中分化腺癌细胞系HEC-1A细胞,采用RT-PCR和Western blot法分别检测两株癌细胞系中MTSS1和Gli1基因m RNA的转录及蛋白的表达水平。结果子宫内膜高分化腺癌细胞系Ishikawa中MTSS1基因m RNA的转录及蛋白的表达水平显著高于中分化细胞系HEC-1A(P<0.05),Ishikawa细胞系中Gli1基因m RNA转录及蛋白表达水平显著低于HEC-1A细胞系(P<0.05)。结论 MTSS1可能作为转移抑制基因,通过调控Sonic hedgehog(Shh)信号通路参与子宫内膜腺癌的发生发展,为进一步研究子宫内膜腺癌的发生发展机制奠定了基础。

HBXIP真核表达载体及转基因人子宫内膜癌细胞系的构建研究

目的构建携带肝炎BX-相互作用蛋白(HBXIP)基因的重组pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP质粒,将其转染人子宫内膜癌HEC-1A,建立稳定表达HBXIP蛋白的细胞株,并检测HBXIP在人子宫内膜癌HEC-1A细胞中的表达。方法实验于2014—2015年于中国医科大学附属第一医院中心实验室进行。聚合酶链反应(PCR)逆转录c DNA扩增HBXIP基因全长,亚克隆到真核表达载体pc DNA3.1-myc-his A内,构建出重组真核表达质粒pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP,酶切及DNA测序证实重组质粒pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP正确插入HBXIP的核苷酸序列。证实HBXIP基因成功插入空载体pc DNA3.1-myc-his A,脂质体法将pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP转染HEC-1A细胞,并用Western blot免疫印迹法检测在人子宫内膜癌细胞HEC-1A中HBXIP蛋白表达。结果 (1)HBXIP总RNA在提取进程中没有发生明显的降解,说明获得的RNA和m RNA完整。PCR扩增后的产物在约276 bp处出现明显的特异性条带,与理论预计的c DNA片段长度一致。(2)HBXIP基因真核表达质粒pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP成功构建,重组质粒经pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP酶切和测序鉴定,表明均含有大小正确的HBXIP基因片段。(3)Western blot免疫印迹法检测在人子宫内膜癌HEC-1A细胞中HBXIP蛋白表达。pc DNA3.1-myc-his A组与pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP组HBXIP蛋白相对表达量比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 HBXIP基因片段被成功插入真核表达载体质粒pc DNA3.1-myc-his A的多克隆位点,成功构建了HBXIP基因的重组真核表达质粒pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP。构建的HBXIP基因重组真核表达质粒pc DNA3.1-myc-his A-HBXIP转染HEC-1A细胞后,可在HEC-1A细胞中稳定表达,为进一步研究HBXIP基因奠定了基础。

胰岛素对子宫内膜癌化疗增敏作用及诱导其细胞凋亡的研究

目的探讨普通胰岛素有无化疗增敏的作用及诱导细胞凋亡的原理。方法 2007年10月至2008年6月在华中科技大学同济医学院附属协和医院对Ishikawa,Hec-1A细胞经胰岛素和脂质体紫杉醇处理后,以3-(4,5)-双甲基-2-噻唑-(2,5)-二本基溴四氮唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖情况;以流式细胞仪检测细胞凋亡。结果胰岛素联合脂质体紫杉醇合用72h时抑制率高达63.2%和50.2%,与脂质体紫杉醇单独作用相比差异有统计学意义(P<0.01)。两药合用时抑制率达到最高峰。结论体外脂质体紫杉醇可抑制Ishikawa和Hec-1A细胞增殖并诱导其发生凋亡,且与胰岛素联合应用时抑制作用明显增加。

女性外周血来源γδ T淋巴细胞对子宫内膜癌细胞的杀伤效果

目的 观察女性外周血来源γδT淋巴细胞体外扩增能力,探讨其对子宫内膜癌细胞的杀伤效果。方法 青年女性3例为青年组,围绝经期女性4例为围绝经期组,采集2组肘静脉血4 mL,采用固相抗体包被法联合白细胞介素-2体外扩增外周血γδT淋巴细胞。扩增14 d,记录γδT淋巴细胞数量、扩增倍数,采用流式细胞术检测γδ及Vδ1、Vδ2 T淋巴细胞比率。取子宫内膜癌HEC-1A、Ishikawa细胞,分别以11、51、101、201和401效靶比加入青年组及围绝经期组γδT淋巴细胞处理24 h,采用CCK-8法检测细胞存活率。取HEC-1A、Ishikawa细胞,分为卡铂组、γδT淋巴细胞组、联合组,卡铂组使用卡铂处理72 h,γδT淋巴细胞组使用20∶1效靶比青年组γδT淋巴细胞处理24 h,联合组使用卡铂处理72 h后加入201效靶比青年组γδT淋巴细胞继续处理24 h,采用CCK-8法检测细胞存活率。结果 (1)扩增14 d,青年组γδT淋巴细胞计数[(5.76±0.43)×10^(6)/mL]多于围绝经期组[(3.19±0.48)×10^(6)/mL](t=3.819,P=0.012),扩增倍数(213.50±15.10)大于围绝经期组(95.87±11.98)(t=5.288,P=0.003),γδT淋巴细胞比率[(92.77±0.69)%]、Vδ2 T淋巴细胞比率[(94.23±0.77)%]均高于围绝经期组[(70.40±3.26)%、(67.43±2.30)%](t=5.743,P=0.002;t=9.589,P=0.002),Vδ1 T淋巴细胞比率[(0.72±0.49)%]与围绝经期组[(1.94±1.32)%]比较差异无统计学意义(t=0.867,P=0.435)。(2)效靶比11、51、101、201、401的青年组和围绝经期γδT淋巴细胞处理24 h, HEC-1A、Ishikawa细胞存活率比较差异均有统计学意义(P<0.05),细胞存活率均随γδT淋巴细胞效靶比升高而降低(P<0.05)。效靶比为101、201、401的青年组γδT淋巴细胞处理24 h时HEC-1A细胞存活率[(73.71±3.07)%、(50.14±3.02)%、(37.36±0.86)%]分别低于围绝经期组γδT淋巴细胞处理24 h[(82.66±1.60)%、(73.01±1.51)%、(47.73±4.31)%](t=4.007,P=0.011;t=10.240,P<0.001;t=4.648,P=0.001)。(3)联合组HEC-1A、Ishikawa细胞存活率[(24.32±5.30)%、(23.13±2.83)%]均低于γδT淋巴细胞组[(50.14±3.02)%、(36.48±1.89)%]、卡铂组[(83.18±2.19)%、(84.14±2.62)%](P<0.05)。结论 青年及围绝经期女性外周血来源γδT淋巴细胞对子宫内膜癌细胞均有杀伤作用,呈剂量依赖性增强,青年女性外周血来源γδT淋巴细胞的杀伤效果优于围绝经期女性外周血来源γδT淋巴细胞,联合卡铂可进一步抑制子宫内膜癌细胞存活。

N-myc下游调节基因2在子宫内膜癌组织中表达及意义

目的探讨N-myc下游调节基因2(N-myc downstream-regulatedgene 2,NDRG2)在子宫内膜癌组织中的表达,及对肿瘤细胞增殖、侵袭的影响。方法行根治性切除术子宫内膜癌患者77例,手术切除的肿瘤组织为子宫内膜癌组,癌旁正常组织为癌旁组,采用实时荧光定量PCR法检测2组NDRG2基因表达,并分析其表达与临床病理特征的关系。将对数生长期子宫内膜癌HEC-1A细胞随机分为NDRG2抑制组(转染NDRG2干扰序列)、NDRG2正常表达组(转染NDRG2干扰对照序列)、空白对照组(不作任何处理),采用实时荧光定量PCR法检测3组转染48 h NDRG2基因表达,CCK-8法检测3组转染48、96 h增殖活力,划痕试验检测3组转染后培养12、24 h迁移能力,Transwell小室法检测3组转染48 h侵袭能力。结果子宫内膜癌组NDRG2 mRNA相对表达量(1.30±0.11)低于癌旁组(1.95±0.15)(P<0.05);FIGO分期Ⅱ~Ⅳ期、中低分化、有淋巴结转移者NDRG2 mRNA相对表达量(1.16±0.07、1.14±0.10、1.24±0.07)低于FIGO分期Ⅰ期、高分化、无淋巴结转移者(1.52±0.13、1.56±0.17、1.48±0.12)(P<0.05);转染48 h,NDRG2抑制组NDRG2 mRNA相对表达量(0.48±0.11)低于NDRG2正常表达组(1.07±0.08)、空白对照组(1.09±0.16);转染48、96 h,NDRG2抑制组增殖活力吸光度(optical density,OD)值(0.47±0.06、0.76±0.03)高于NDRG2正常表达组(0.33±0.07、0.58±0.03)、空白对照组(0.36±0.08、0.61±0.02)(P<0.05);NDRG2正常表达组、空白对照组转染48 h,NDRG2 mRNA相对表达量及转染48、96 h增殖活力OD值比较差异均无统计学意义(P>0.05);NDRG2抑制组转染后培养12、24 h划痕愈合率[(14.32±2.17)%、(34.28±4.95)%]及侵袭细胞数[(122.91±8.87)个]均高于NDRG2正常表达组[(7.14±1.52)%、(12.73±3.02)%、(104.21±2.94)个]、空白对照组[(6.82±1.24)%、(11.64±2.86)%、(99.71±5.40)个](P<0.05),NDRG2正常表达组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论NDRG2在子宫内膜癌组织中呈低表达,下调NDRG2基因表达可促进子宫内膜癌HEC-1A细胞增殖、迁移和侵袭。

胰岛素联合力朴素对子宫内膜癌化疗的体外研究

目的探讨子宫内膜癌细胞Ishikawa和Hec-1A分别经胰岛素、力朴素以及胰岛素联合力朴素作用后,对其抑制、凋亡、周期及凋亡抑制基因survivin表达的影响。方法根据已采用的MTT方法确定100 pmol/L胰岛素和1μmol/L力朴素为有效实验浓度。应用流式检测学方法检测各实验组不同时间(24 h、48 h、72 h)Ishikawa和Hec-1A细胞凋亡及周期情况;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测各实验组24 h时Ishikawa和Hec-1A细胞中凋亡抑制因子Survivin的表达及其差异。结果胰岛素联合力朴素组Ishikawa及Hec-1A细胞的凋亡率随着不同时间点凋亡率持续地增加(P<0.05);联合作用组抑制率明显多于力朴素单独作用组(P<0.05);联合作用Ishikawa细胞时,其周期主要阻滞于G1期;联合作用Hec-1A细胞时,其周期主要阻滞于G1期和G2/M期;联合作用于Ishikawa细胞后,与力朴素组单独作用相比,survivin表达差异无统计学意义(P>0.05);联合作用于Hec-1A细胞后,联合作用组survivin的表达明显多于力朴素组(P<0.05)。结论联合作用组比力朴素单独作用组明显抑制体外Ishikawa和Hec-1A细胞增殖,且两种药物联合作用,可明显下调Survivin在Hec-1A细胞中的表达。