叔丁基双氧水诱导HEI-OC1细胞株凋亡与STATs mRNA表达的相关性分析

目的通过分析氧化应激损伤的凋亡HEI-OC1细胞各信号转导及转录激活子(signal transducers and activators of transcription,STATs)的表达,探讨酪氨酸激酶-信号转导及转录激活子(janus kinase-signal transducers and activators of transcription,JAK-STATs)信号通路在毛细胞凋亡中的生物学作用。方法采用不同浓度(0、20、40、60 μM)叔丁基过氧化氢(tert-butyl hydroperoxide,t-BHP)染毒构建HEI-OC1细胞株凋亡模型(0μM浓度为对照组),Annexin V-FITC/PI法检测20、40、60 μM浓度t-BHP染毒组细胞凋亡水平,实时荧光定量PCR检测STATs mRNA表达水平。结果对照组及20、40、60 μM t-BHP染毒组的细胞凋亡率分别为3.9%、7.4%、32.0%、91.2%;与对照组相比,各浓度T-BHP染毒组STAT1mRNA、STAT3mRNA、STAT5mRNA、STAT6 mRNA的表达水平均显著性下降(分别为F=5 534.302,P<0.01;F=146.038,P<0.01;F=685.929,P<0.01;F=516.11,P<0.01),各浓度t-BHP染毒组间差异无统计学意义(P>0.05);与对照组相比各浓度t-BHP染毒组STAT2mRNA的表达水平均有显著变化(F=1 259.148,P<0.01),20 μM染毒组STAT2 mRNA的表达水平明显下降(P<0.01),但40、60 μM染毒组均明显升高(P<0.01);STAT4 mRNA在HEI-OC1细胞株中未见表达。结论 JAK-STAT2信号通路具有促进毛细胞氧化应急损伤凋亡的生物学作用,JAK-STAT1/STAT3/STAT5/STAT6信号通路有抑制毛细胞氧化应急损伤凋亡的生物学作用。

氧化应激损伤与HEI-OC1细胞株中Prestin表达的相关性分析

目的观察氧化应激损伤对HEI-OC1细胞Prestin表达的影响,探讨感音性聋的发生机制。方法采用不同浓度(50、100、200μM)双氧水(H_2O_2)染毒培养的HEI-OC1细胞(染毒组),对照组细胞加入无药物培养液,24h后检测各组细胞超氧化物歧化酶(SOD)活力,实时荧光定量PCR检测Prestin mRNA表达水平,免疫荧光法分析Prestin表达水平。结果与对照组相比,氧化应激损伤后染毒组的HEI-OC1细胞SOD活力明显下降,尤以200μM H_2O_2染毒组下降更明显(F=9 926.293,P<0.01);氧化应激损伤的HEI-OC1细胞Prestin mRNA和Prestin蛋白表达水平均明显下降,200μM H_2O_2染毒组下降更明显(F=4 065.046、7 657.217,P<0.01)。结论氧化应激损伤可抑制Prestin的表达,此为感音性聋的重要病理学变化。

Gjb2在高糖诱导的HEI-OC1细胞株凋亡及其与氧化应激中的作用

目的研究Gjb2在高糖诱导的HEI-OC1细胞株凋亡与氧化应激中的作用。方法高血糖处理HEI-OC1细胞株后,RT-qPCR检测了Gjb2的表达。Tunel实验和流式细胞术检测HEI-OC1细胞株凋亡,RT-qPCR和Western Blot检测了凋亡相关基因和蛋白的表达。采用流式细胞术检测高糖处理后HEI-OC1细胞株内ROS的生成,RT-qPCR和Western blot检测了SOD2和catalase的mRNA和蛋白表达。结果 HEI-OC1细胞株经高糖处理后,凋亡率显著升高,BCL2的mRNA表达显著降低,而BAX、Caspase-3、Caspase-9的mRNA表达则显著升高,同时BCL2的蛋白表达显著降低,而BAX、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9的蛋白表达则显著升高。氧化应激检测结果显示高糖处理后细胞内ROS水平显著升高,同时伴随着SOD2和catalase的mRNA和蛋白表达显著升高。高糖处理显著抑制了Gjb2的表达,而在HEI-OC1细胞株中过表达Gjb2则能抑制高糖诱导的细胞凋亡和氧化应激。结论过表达Gjb2能抑制高糖诱导的HEI-OC1细胞株凋亡和氧化应激。

雌激素对D-半乳糖诱导的HEI-OC1细胞氧化应激损伤的作用

目的探讨雌激素对D-半乳糖诱导耳蜗毛细胞氧化应激的影响及相关分子机制。方法体外培养小鼠耳蜗毛细胞株HEI-OC1(house ear institute-organ of Corti 1),分为空白对照组、D-半乳糖组(20 mg/mL)和雌激素+D-半乳糖组(20 mg/mL D-半乳糖+10 nmol/Lβ-雌二醇)。CCK-8法检测各组HEI-OC1细胞增殖情况;利用DCFH-DA探针技术检测各组HEI-OC1细胞内的ROS含量;利用超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒检测各组HEI-OC1细胞内氧化应激因子SOD含量;Western blot检测各组细胞核因子E2相关蛋白(Nrf2)、血红素加氧酶(HO-1)的蛋白表达水平。结果与空白对照组相比,D-半乳糖组细胞增殖活性减弱(P<0.01),ROS含量显著上升(P<0.01),SOD活力和Nrf2、HO-1蛋白表达水平显著下降(P<0.01)。与D-半乳糖组相比,雌激素+D-半乳糖组细胞增殖活性增加(P<0.01),ROS水平显著下降(P<0.01),同时,SOD活力和Nrf2、HO-1蛋白表达水平显著上升(P<0.01)。结论雌激素能够通过Nrf2/HO-1通路缓解D-半乳糖诱导的HEI-OC1细胞氧化应激所造成的损伤。

过表达溶质载体家族1成员5和敲低慢病毒载体构建及稳定转染RAW264.7细胞株

背景:溶质载体家族1成员5(solute carrier family 1 member 5,SLC1A5)在多种疾病中发挥了潜在作用,但确切作用机制尚不清楚。构建稳定的SLC1A5过表达和敲低细胞模型可为深入研究SLC1A5在疾病中的确切作用机制以及发现潜在治疗靶点提供有力的实验工具。目的:构建小鼠SLC1A5过表达和敲低的慢病毒载体,以建立稳定转染的RAW264.7细胞株,为深入探讨SLC1A5在炎症中的作用提供实验基础。方法:根据SLC1A5基因序列设计合成引物并使用聚合酶链反应扩增该基因片段。将目的基因定向接入经Age I/Nhe I酶切的载体质粒GV492中构建重组慢病毒质粒,对阳性克隆进一步筛选后测序比对结果;pHelper1.0质粒载体、pHelper2.0质粒载体、目的质粒载体与293T细胞共同培养并转染,获得慢病毒原液进行包装和滴度测定;在此基础上,通过体外培养RAW264.7细胞,确定嘌呤霉素工作质量浓度;不同滴度的慢病毒分别与RAW264.7细胞共同培养,根据荧光强度确定转染效率;用嘌呤霉素挑选出稳定转染细胞,实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹方法检测稳定转染细胞株的SLC1A5基因和蛋白表达水平。结果与结论:(1)测序序列与目的序列一致提示重组慢病毒载体构建成功;(2)过表达SLC1A5慢病毒的滴度为1×10~9 TU/mL,敲低SLC1A5慢病毒的滴度为3×10~9 TU/mL;(3)确定RAW264.7细胞嘌呤霉素工作质量浓度为3μg/mL;(4)过表达/敲低SLC1A5慢病毒转染RAW264.7细胞的最佳条件皆为HiTransG P转染增强液且感染复数值等于50;(5)过表达SLC1A5稳转细胞株中SLC1A5基因和蛋白的表达量明显上调,而敲低SLC1A5稳转细胞株中SLC1A5基因和蛋白的表达量显著下调。结果表明,成功构建了小鼠SLC1A5过表达和敲低的慢病毒载体并获得稳定转染的RAW264.7细胞株。

补肾活血汤通过调控PI3K/Akt/mTOR通路对HEI-OC1细胞的抗衰老作用

目的探讨补肾活血汤延缓耳蜗毛细胞株HEI-OC1衰老的潜在机制。方法应用D-半乳糖建立衰老HEI-OC1细胞模型,设立对照组、模型组、补肾活血汤组、PI3K抑制剂组和补肾活血汤+PI3K抑制剂组。采用ELISA法检测细胞SOD、GSH-Px活性和MDA水平,DCFH-DA法检测细胞ROS水平,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot法检测细胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达,RT-qPCR法检测细胞Beclin-1、P62、Bcl-2、Bax mRNA表达。结果与对照组比较,模型组HEI-OC1细胞SOD和GSH-Px活性、ROS水平、Beclin-1和Bcl-2 mRNA表达均降低(P<0.01),MDA水平、细胞凋亡率、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达、P62和Bax mRNA表达均升高(P<0.01);与模型组比较,各给药组均可改善以上指标(P<0.05,P<0.01),其中补肾活血汤+PI3K抑制剂组作用最为显著,而补肾活血汤组与PI3K抑制剂组之间比较无差异。结论补肾活血汤可通过促进自噬、抑制凋亡和减轻氧化应激损伤延缓HEI-OC1细胞的衰老,其机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。

人单核细胞株巨细胞病毒编码miR-US25-1-3p过表达后蛋白质组学变化分析

目的分析人单核细胞株(THP-1)过表达人巨细胞病毒(HCMV)编码miR-US25-1-3p后蛋白质表达谱变化及价值。方法采用脂质体将hcmv-miR-US25-1-3p模拟物转染THP-1细胞构建hcmv-miR-US25-1-3p过表达细胞株,RT-qPCR验证转染效果;采用串联质谱标签标记联合液相色谱-串联质谱对hcmv-miR-US25-1-3p过表达后THP-1细胞蛋白质组学进行定量分析,生物信息学分析差异表达蛋白质生理病理功能;westernblot验证重要差异蛋白表达变化。结果与对照相比,THP-1细胞过表达hcmV-miR-US25-1-3p后65种蛋白质呈现差异表达,其中17种上调,48种下调。GO、COG和KEGG注释及功能预测结果显示,差异表达蛋白主要参与炎症反应信号通路、代谢过程、细胞及遗传信息功能,与肿瘤、病毒性心肌炎、非酒精性脂肪肝、原发性免疫缺陷病、类风湿关节炎、多种病原体感染、阿尔茨海默病、亨廷顿病等多种疾病相关。48种下调蛋白质中,文献调研和生物信息学分析发现,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)和受激活调节正常T细胞表达和分泌因子(RANTES)参与抗病毒及炎症反应,上述蛋白质下调表达经western blot验证。结论HCMV编码的hcmv-miR-US25-1-3p能够影响宿主蛋白表达谱,并可能通过抑制TRAIL和RANTES表达,促进病毒潜伏、免于宿主细胞杀伤。

利用改良的CRISPR/Cas9n double nick系统构建DPF2基因敲除的人胰腺癌PANC-1细胞株

目的利用改良的CRISPR/Cas9n double nick系统构建DPF2基因敲除的PANC-1人胰腺癌细胞模型。方法设计两对靶向DPF2基因第四外显子上下游的单链向导RNA(single guide RNA,sgRNA),化学合成sgRNA寡核苷酸序列,并克隆至pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin真核表达质粒中。将克隆正确的DPF2-sgRNA重组真核表达质粒与Cas9真核表达载体pST1374-N-NLS-flag-linker-Cas9共转染至PANC-1细胞中,通过嘌呤霉素和杀稻瘟菌素筛选阳性转染细胞,进一步通过有限稀释法筛选获得单克隆细胞株。提取细胞基因组DNA对敲除位点进行聚合酶链反应(PCR)鉴定和测序鉴定。Western blot检测细胞中DPF2蛋白表达情况。结果sgRNA成功插入pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin中且序列正确。PCR扩增鉴定和测序结果表明,PANC-1细胞中一段包括完整第四外显子在内的长度为401 bp的DPF2基因片段被敲除。Western blot检测结果表明,DPF2基因敲除细胞中的DPF2蛋白表达缺失。结论通过改良的CRISPR/Cas9n double nick基因编辑系统成功构建DPF2基因敲除PANC-1稳定细胞株。

基于自噬与凋亡平衡探讨补肾活血汤对衰老耳蜗毛细胞株HEI-OC1的保护作用

目的探讨补肾活血汤对衰老耳蜗毛细胞株HEI-OC1自噬和凋亡的影响。方法应用D-半乳糖构建衰老HEI-OC1细胞的体外模型后,将细胞分为对照组、衰老组、含药血清低、中及高剂量组(5%、10%、20%),采用噻唑蓝(MTT)比色法检测耳蜗HEI-OC1细胞的增殖能力;β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老状态;膜联蛋白V/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双染流式细胞术检测细胞凋亡的程度;Western印迹检测细胞中自噬和凋亡相关蛋白的表达水平。结果MTT、β-半乳糖苷酶染色、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术和Western印迹结果显示,与对照组比较,衰老组HEI-OC1细胞增殖能力明显下降;细胞衰老状态明显增加,细胞凋亡率明显增加,Atg5、Atg12、Beclin1和Bcl-2蛋白表达水平明显下降,p62和Bax蛋白表达水平显著升高(均P<0.01)。与衰老组比较,补肾活血汤各组HEI-OC1细胞增殖能力明显上升;细胞凋亡率明显降低;Atg5、Atg12、Beclin1和Bcl-2蛋白表达水平显著增加(均P<0.05);p62和Bax蛋白表达水平显著下降(均P<0.05),且均呈现出剂量依赖性。结论补肾活血汤可通过促进自噬及抑制凋亡来延缓耳蜗毛细胞株HEI-OC1的衰老,且与其浓度相关。

微小RNA通过SIRT1调控小鼠耳蜗老化HEI-OC1细胞凋亡的研究

目的构建小鼠耳蜗毛细胞株HEI-OC1(house ear institute-organ of Corti 1)老化模型,探索微小RNA-96(miR-96)可否通过SIRT1调控老化HEI-OC1凋亡。方法CCK-8筛选D-半乳糖浓度。流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测p53、p38、caspase-3蛋白表达。q RT-PCR检测miR-96、SIRT1 mRNA表达,Western blot检测SIRT1蛋白表达。miR-96模拟物转染HEI-OC1细胞,qRT-PCR检测miR-96、SIRT1 mRNA表达,Western blot检测SIRT1、caspase-3蛋白表达。结果HEI-OC1细胞在15 mg/ml D-半乳糖条件下培养72 h后,凋亡较对照组显著增加(P<0.01),且p53、p38(P<0.05)及caspase-3(P<0.0001)蛋白表达明显增加。老化组miR-96与SIRT1 mRNA和蛋白表达均明显减低(P<0.05)。miR-96过表达后,SIRT1 mRNA及蛋白较对照组表达升高,caspase-3蛋白表达降低(P<0.05)。结论老化HEI-OC1细胞中miR-96、SIRT1 mRNA与蛋白的表达均下降。miR-96可通过上调SIRT1抑制HEI-OC1细胞的凋亡。miR-96、SIRT1可能成为保护老年性聋耳蜗毛细胞的作用靶点。

银杏叶提取物对放射性损伤耳蜗毛细胞株HEI-OC1增殖、凋亡及Survivin、Bax表达的影响

目的探讨银杏叶提取物(EGB761)对放射性损伤耳蜗毛细胞株HEI-OC1增殖、凋亡及细胞存活素(Survivin)、Bcl-2家族前凋亡蛋白(Bax)表达的影响。方法体外培养耳蜗毛细胞株HEI-OC1,设置正常对照组、放射性损伤组及10 mg/L、20 mg/L、50mg/L、100 mg/L EGB761干预组,除正常对照组外其他组均选择对数生长期HEI-OC1细胞进行照射,建立放射性损伤模型,之后各干预组分别给予相应浓度EGB761进行干预。应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验检测各组HEI-OC1细胞增殖能力,利用流式细胞仪(FCM)检测各组HEI-OC1细胞凋亡情况,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRTPCR)检测各组细胞Survivin、Bax表达水平。结果 MTT结果显示,与正常对照组比较,放射性损伤组HEI-OC1细胞增殖能力明显下降(P <0. 05);与放射性损伤组比较,EGB761干预组HEI-OC1细胞增殖能力明显上升(P <0. 05),且呈一定剂量依赖性。FCM结果显示,与正常对照组比较,放射性损伤组HEIOC1细胞凋亡率明显增加(P <0. 05);与放射性损伤组比较,EGB761干预组HEI-OC1细胞凋亡率明显降低(P <0. 05),且呈一定剂量依赖性。qRT-PCR结果显示,与正常对照组比较,放射性损伤组HEI-OC1细胞中Survivin水平明显下降(P <0. 05),Bax水平明显升高(P <0. 05);与放射性损伤组比较,EGB761干预组HEI-OC1细胞中Survivin水平明显升高(P <0. 05),Bax水平明显下降(P <0. 05),且呈一定剂量依赖性。结论 EGB761可明显促进HEI-OC1细胞增殖,抑制HEI-OC1细胞凋亡。其作用机制可能为上调凋亡抑制基因Survivin表达及下调凋亡促进基因Bax表达。

银杏内酯B调控E2f1/Cdk1抑制妥布霉素诱导的HEI-OC1细胞凋亡

目的探究银杏内酯B对妥布霉素诱导的House Ear Institute-Organ of Corti 1(HEI-OC1)细胞凋亡的影响及其作用机制。方法研究选用HEI-OC1小鼠耳蜗毛细胞,使用妥布霉素或妥布霉素联合银杏内酯B处理细胞,通过EdU实验检测对细胞增殖的影响,流式细胞术检测对细胞凋亡的影响,Western blot检测凋亡相关蛋白的表达及对E2f1/Cdk1通路的调节作用。结果妥布霉素处理细胞后,HEI-OC1细胞增殖能力降低(P<0.001),凋亡率升高(P<0.001),细胞Bcl2表达降低,而Bax、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9表达升高(P<0.001)。妥布霉素联合银杏内酯B处理细胞后,E2f1和Cdk1蛋白的表达水平显著降低;银杏内酯B可降低妥布霉素对HEI-OC1细胞增殖、凋亡的影响(P<0.050)。结论银杏内酯B通过调控E2f1/Cdk1通路抑制妥布霉素诱导的HEI-OC1内耳细胞凋亡。

金合欢素对幽门螺杆菌感染的胃上皮GES-1细胞凋亡的抑制作用

目的研究金合欢素对幽门螺旋杆菌(Hp)感染GES-1细胞凋亡的保护作用及潜在的作用机制。材料和方法体外用Hp和金合欢素处理GES-1细胞,CCK-8法检测细胞活力,创面愈合法评估细胞迁移及修复能力的变化,流式细胞术分析细胞凋亡率,western blots法检测凋亡相关蛋白的表达水平。结果Hp可诱导GES-1细胞活力下降,抑制细胞迁移,使细胞凋亡比率增加,同时增加Bax、cle-caspase3的表达水平。而金合欢素处理可增强细胞活力,抑制Hp感染所致的细胞凋亡水平,并下调Bax、cle-caspase3的表达。讨论与结论金合欢素能增强GES-1细胞活性,通过抑制Hp感染的GES-1细胞凋亡,从而对胃黏膜上皮细胞具有保护作用。

H_(2)O_(2)诱导类毛细胞HEI-OC1氧化应激损伤模型建立

目的建立H_(2)O_(2)诱导HEI-OC1细胞凋亡模型,以噪声性聋小鼠耳蜗内氧化应激水平为依据,模拟病理状态毛细胞(hair cell)氧化应激损伤,为大规模抗氧化药物筛选建立体外氧化应激介导细胞损伤实验模型。方法体外培养HEI-OC1细胞系,采用不同浓度H_(2)O_(2)处理不同时间构建氧化应激损伤细胞模型,进行细胞活性检测,并统计分析半抑制浓度(IC50);同时结合120dB白噪声处理4h后致聋小鼠耳蜗内氧化应激水平,共同确定体外细胞模型最适诱导条件。免疫荧光检测1 mM H_(2)O_(2)诱导12h下线粒体ROS及细胞凋亡过程中关键性半胱氨酸死亡蛋白酶Caspase 3激活情况;用Western blot检测各组细胞中Caspase 3、4-HNE、线粒体途径促凋亡蛋白信号分子Bax及凋亡抑制因子Bcl-2的表达情况。结果不同浓度H_(2)O_(2)作用12h条件下,HEI-OC1细胞系随着H_(2)O_(2)浓度的升高细胞活力明显下降,半抑制浓度(IC50)约在0.736mM;因此后续分别选取0.5mM和1 mM H_(2)O_(2)处理不同时间,观察发现HEI-OC1细胞系随着双氧水处理时间的延长细胞活力明显下降;此外,免疫荧光结果表明,H_(2)O_(2)诱导HEIOC1产生mtROS积累、Caspase-3激活,同时WB数据证明,双氧水处理后的HEI-OC1细胞内存在4-HNE累积(且升高水平与噪声处理后小鼠耳蜗组织内4-HNE水平相当)、及Caspase 3激活、Bax升高,Bcl-2表达下降现象,预示H_(2)O_(2)可介导HEI-OC1氧化应激反应,并进一步诱导细胞凋亡。结论H_(2)O_(2)诱导HEI-OC1凋亡过程中,细胞活性减弱与H_(2)O_(2)剂量和处理时间密切相关,且1mM H_(2)O_(2)刺激细胞后诱发与噪声致聋小鼠耳蜗内近似程度的氧化应激反应及细胞凋亡现象。综上,该模型较为理想的模拟了耳蜗氧化应激损伤病理状态,有望为后续in vitro实验模拟氧化损伤及保护性药物筛选工作奠定必要理论基础。

热休克蛋白75/78在叔丁基双氧水诱导HEI-OC1毛细胞株凋亡中的作用

目的分析氧化应激损伤的HEI-OC1毛细胞中热休克蛋白75/78(GRP75/78)的表达水平,探讨GRP75、GRP78在耳蜗毛细胞凋亡过程中的可能作用。方法用不同浓度(20、40、60μM)叔丁基过氧化氢(tBHP)染毒构建HEI-OC1毛细胞株凋亡模型,对照组不加t-BHP,培养24h后用Western blot检测各组毛细胞凋亡标志物Caspase-3、Active-Caspase-3表达水平,实时荧光定量PCR检测GRP75、GRP78mRNA表达水平。结果与对照组相比,各染毒组Caspase-3和Active-Caspase-3蛋白表达水平显著增高(F=1 196.741,P<0.001和F=184.131,P<0.001),40μM和60μM染毒组Caspase-3和Active-Caspase-3蛋白表达水平显著高于20μM染毒组(P<0.01),但40μM和60μM染毒组之间差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比较,各染毒组GRP75和GRP78mRNA表达水平显著增高(F=228.065,P<0.001和F=1 298.057,P<0.001),40μM和60μM染毒组GRP75和GRP78mRNA表达水平显著高于20μM染毒组(P<0.01),但40μM和60μM染毒组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 GRP75和GRP78在氧化应激损伤的耳蜗毛细胞中有抗凋亡的生物学作用。

大蒜素对PC-3细胞生物学行为及miR-146a-5p表达的影响

目的探讨大蒜素对PC-3细胞生物学行为及miR-146a-5p表达的影响。方法取PC-3细胞株分为A组(无药物干预的PC-3细胞株)、B组(A组+25μmol/L大蒜素溶液)、C组(A组+50μmol/L大蒜素溶液)及D组(A组+100μmol/L大蒜素溶液),采用噻唑蓝(MTT)检测PC-3存活率,Hoechst染色检测凋亡程度,Transwell小室检测侵袭数目,Western印迹检测ROCK1及Rhoc蛋白,qRT-聚合酶链反应(PCR)检测时增加E组(D组+miR-146a-5p激动剂)检测5组ROCK1、Rhoc及miR-146a-5p mRNA表达。结果A、B、C、D组细胞存活率、侵袭数目、ROCK1和Rhoc蛋白及mRNA依次降低,凋亡率及miR-146a-5p mRNA依次增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论大蒜素能够抑制PC-3细胞生物学增殖和侵袭,增加凋亡,并呈现浓度依赖性,这与激活miR-146a-5p减少ROCK1、Rhoc表达相关。

siRNA抑制GRP75表达对叔丁基双氧水诱导HEI-OC1毛细胞株凋亡的影响

目的分析抑制热休克蛋白75(GRP75)对氧化应激损伤HEI-OC1细胞凋亡的影响,探讨GRP75在耳蜗毛细胞凋亡过程中的作用机制。方法人工设计合成靶向GRP75的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA),转染不同浓度(20、40、60μM)叔丁基过氧化氢(t-BHP)染毒HEI-OC1毛细胞株,并设空白对照,采用蛋白免疫印迹法检测GRP75和Caspase-3蛋白表达水平。结果转染GRP75-siRNA后HEI-OC1细胞GRP75表达水平明显受到抑制(t=35.722,P<0.01);T-BHP染毒组GRP75表达水平明显升高(细胞凋亡组:F=1 009.09,P<0.01;siRNA转染组:F=1 603.97,P<0.01),并且都随着染毒浓度的增加而增加;T-BHP染毒组Caspase-3表达水平显著增高(细胞凋亡组:F=3 068.67,P<0.01;siRNA转染组:F=6 348.27,P<0.01),并都随着染毒浓度的增加而增加;20μM、40μM、60μM t-BHP染毒组转染siRNA后Caspase-3表达水平均显著升高(t=21.275、P<0.01;t=18.584、P<0.01;t=11.147、P<0.01)。结论抑制氧化应激损伤毛细胞的GRP75表达可导致凋亡程度加重,推测GRP75可能具有抗凋亡效应。

siRNA抑制STAT2表达对叔丁基过氧化氢诱导HEI-OC1细胞株凋亡影响

目的分析信号传导和转录激活因子2(STAT2)对氧化应激损伤HEI-OC1毛细胞株凋亡的影响。方法采用随机数表法将对数生长期HEI-OC1毛细胞分为干扰组和未干扰组,干扰组中加入人工设计合成靶向STAT2的小干扰RNA和选择性改良伊格尔培养液(opti-MEM),未干扰组中仅加入opti-MEM,分别以不同浓度(0、20、40、60μmol/L)的叔丁基过氧化氢(t-BHP)染毒干扰组和未干扰组。蛋白免疫印迹法检测各组细胞STAT2和半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)相对表达水平,流式细胞仪检测毛细胞凋亡率。结果在未干扰组和干扰组中,HEI-OC1细胞的细胞凋亡率和STAT2、Caspase-3的相对表达水平均随t-BHP染毒剂量的升高而升高(P<0.01)。与同剂量染毒的未干扰组比较,20、40、60μmol/L t-BHP染毒的干扰组HEI-OC1细胞的细胞凋亡率和Caspase-3相对表达水平均升高(P<0.01),而STAT2相对表达水平均降低(P<0.01)。结论抑制氧化应激损伤毛细胞的STAT2表达可导致凋亡程度加重;STAT2具有抗凋亡效应。

BALB/c小鼠乳腺癌4T1细胞株移植模型的建立

目的:应用来源于BALB/c小鼠的4T1乳腺癌细胞株建立BALB/c小鼠乳腺癌模型,选择最佳的模型制作方法。方法:90只BALB/c小鼠随机分为3组,每组30只,分别接种1×106ml-1、1×107ml-1、1×108ml-14T1乳腺癌细胞株细胞悬液。每组小鼠再随机分两组分别接种于胸壁和侧腹壁。比较各组的成瘤时间、成瘤率和8周存活率,并用C-erbB-2免疫组化法检查肿瘤病理状态。结果:细胞浓度为1×107ml-1时,肿瘤成瘤率高,生长稳定;4T1细胞不同部位接种不影响成瘤率及生长;C-erbB-2免疫组织化学检查均为阳性。结论:应用1×107ml-1浓度的4T1细胞进行接种是最佳的模型制作方法。

宫颈癌细胞株和宫颈上皮组织中Pin1和Cyclin D1的表达及临床意义

背景与目的:肽基脯氨酰顺反异构酶Pin1在人类多种肿瘤中过表达,Pin1过表达可增强CyclinD1表达,在肿瘤发生发展中起重要作用。本研究拟探讨宫颈癌细胞株及宫颈上皮组织中Pin1、CyclinD1的表达及其临床意义。方法:应用RT-PCR、Westernblot法检测HeLa、SiHa、C33a、Caski细胞中Pin1和CyclinD1基因蛋白表达,免疫组化法检测10例正常宫颈、21例宫颈上皮内瘤样病变、57例浸润癌组织中Pin1和CyclinD1的表达状况,评价其临床意义。结果:HeLa、SiHa、C33a、Caski细胞存在不同程度Pin1mRNA及蛋白过表达(P<0.05)。正常宫颈、宫颈上皮内瘤样病变、浸润癌组织中Pin1蛋白表达逐渐增强,分别为0%、47.62%、64.91%(P<0.05)。Pin1蛋白过表达与宫颈癌临床分期、病理分级、淋巴结转移无关(P>0.05);但宫颈腺癌组织中Pin1表达明显高于鳞癌(P<0.05)。Pin1过表达与CyclinD1表达呈显著正相关(P<0.05)。结论:Pin1在宫颈癌细胞株及宫颈癌组织中存在mRNA及蛋白水平上的过表达,Pin1过表达与CyclinD1表达密切相关,Pin1和CyclinD1异常表达可能参与宫颈癌的发生发展。