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HEK 293T细胞中TRAF6多聚泛素化修饰KLF5的方式及其修饰位点的鉴定 被引量:1
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作者 李玉 应帅 +6 位作者 葛文 阮玉婷 吴宁霞 王伟民 张婧 邱文 王迎伟 《南京医科大学学报(自然科学版)》 CAS 北大核心 2023年第4期445-451,共7页
目的:研究人胚肾293T(HEK 293T,简称293T)细胞中外源性肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor⁃associated factor 6,TRAF6)与Krüppel样因子5(Krüppel⁃like factor 5,KLF5)的结合及TRAF6多聚泛素化修饰KLF... 目的:研究人胚肾293T(HEK 293T,简称293T)细胞中外源性肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor⁃associated factor 6,TRAF6)与Krüppel样因子5(Krüppel⁃like factor 5,KLF5)的结合及TRAF6多聚泛素化修饰KLF5的方式和修饰的位点。方法:将构建的Flag⁃TRAF6、HA⁃KLF5、泛素过表达质粒、shTRAF6小干扰质粒和TRAF6 C70A位点突变质粒行不同组合转染293T细胞48 h。用免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)和免疫印迹(immunoblotting,IB)实验检查TRAF6与KLF5的结合以及KLF5 K63或K48多聚泛素化水平。此外,构建KLF5全部赖氨酸突变的质粒,分别与TRAF6质粒共转染293T细胞。用前述IP/IB检测KLF5 K63连接的多聚泛素化修饰,并确定KLF5 K63泛素化修饰的位点。结果:293T细胞中TRAF6能与KLF5结合;TRAF6过表达和基因沉默或TRA6酶活性缺失能相应上调或下调KLF5 K63的多聚泛素化;KLF5被TRAF6 K63多聚泛素化修饰的位点是其第99位和第100位的赖氨酸。结论:TRAF6能与KLF5相互作用,并对KLF5⁃K99和K100进行K63多聚泛素化修饰。 展开更多
关键词 肿瘤坏死因子受体相关因子6 Krüppel样因子5 K63连接的多聚泛素化修饰 hek 293t细胞
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人源WNT16 HEK 293T稳转细胞株构建、蛋白纯化与活性检测方法研究
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作者 王克芬 陈海迪 +3 位作者 章嘉成 周鑫 邓成 武永康 《四川医学》 CAS 2023年第12期1233-1238,共6页
目的无翅型MMTV整合位点家族成员16(WNT16)是一种重要的信号调节蛋白,参与多种细胞生物学过程的调控。本研究旨在构建稳定转染WNT16基因的HEK 293T细胞株,并利用多聚赖氨酸标签(HIS-Tag)实现高效纯化WNT16蛋白。方法使用TK-PCDH-copGFP-... 目的无翅型MMTV整合位点家族成员16(WNT16)是一种重要的信号调节蛋白,参与多种细胞生物学过程的调控。本研究旨在构建稳定转染WNT16基因的HEK 293T细胞株,并利用多聚赖氨酸标签(HIS-Tag)实现高效纯化WNT16蛋白。方法使用TK-PCDH-copGFP-T2A-Puro载体,将WNT16 CDS-HIS序列通过XbaI和BamHI位点连接载体,构建慢病毒载体质粒;将该质粒与pSPAX2和pMD2.G一起共转染HEK 293T细胞,制备携带WNT16基因的慢病毒;利用慢病毒感染HEK 293T细胞,并通过嘌呤霉素筛选和Western Blot鉴定稳定过表达WNT16的细胞株;利用镍螯合琼脂糖凝胶与HIS标签的高亲和性纯化WNT16蛋白,使用考马斯亮蓝染色和Western Blot法检测纯化效果;用纯化的WNT16蛋白刺激Jurkat细胞,使用Western Blot法检测Jurkat细胞中β-catenin信号通路蛋白的水平,以评估WNT16蛋白的活性。结果成功构建过表达WNT16基因的慢病毒表达载体,并用其感染HEK 293T细胞。经过嘌呤霉素筛选和Western Blot鉴定,我们获得了稳定表达WNT16的HEK 293T细胞株。使用HIS标签成功纯化了WNT16蛋白,并用考马斯亮蓝染色和Western Blot法检测了纯化效果。最后,我们用纯化的WNT16蛋白刺激Jurkat细胞,并用Western Blot法检测了Jurkat细胞中β-catenin信号通路蛋白的水平,WNT16蛋白能够显著增加Jurkat细胞中β-catenin蛋白的表达,表明纯化的WNT16蛋白具有激活WNT/β-catenin通路的生物学活性。结论本研究成功实现了WNT16蛋白的高效表达和纯化,并初步研究了其功能。这为进一步探究WNT16在细胞生物学中的作用提供了重要的实验基础。 展开更多
关键词 WNT16 hek 293t细胞 过表达 稳转细胞株 纯化 HIS标签
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白藜芦醇对镉诱导HEK 293T细胞自噬与凋亡的影响 被引量:2
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作者 王芸芸 刘小綪 +3 位作者 邵峦峦 杨颖 蒋琦辰 毛伟平 《复旦学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期52-60,共9页
为了探究白藜芦醇与镉诱导人胚胎肾细胞293(HEK 293T)细胞自噬与凋亡之间的关系,本研究在已证明低浓度镉诱导细胞自噬,高浓度镉导致细胞凋亡的基础上,以HEK 293T细胞为研究对象,并分别与镉、白藜芦醇及各种抑制剂进行联合培养,利用免疫... 为了探究白藜芦醇与镉诱导人胚胎肾细胞293(HEK 293T)细胞自噬与凋亡之间的关系,本研究在已证明低浓度镉诱导细胞自噬,高浓度镉导致细胞凋亡的基础上,以HEK 293T细胞为研究对象,并分别与镉、白藜芦醇及各种抑制剂进行联合培养,利用免疫印记分析检测自噬标志蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ、溶酶体标志蛋白cathepsin L、组蛋白去乙酰化酶相关蛋白SIRT1和凋亡蛋白caspase-3的表达水平,激光共聚焦检测细胞自噬质粒(GFP-LC3)和溶酶体相关膜蛋白结合因子(LAMP2)的表达量,同时检测活性氧(ROS)水平,倒置相差显微镜和流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果显示:白藜芦醇进一步增强镉诱导HEK 293T细胞的自噬,且这种效应发生在自噬体溶酶体融合之前,其作用原理可能与白藜芦醇的抗氧化性有关并与SIRT1基因有密切联系,以上结果说明白藜芦醇对镉诱导的细胞自噬有一定的调控作用,此外,细胞凋亡与自噬之间关系紧密,白藜芦醇可抑制镉诱导的细胞凋亡。 展开更多
关键词 白藜芦醇 hek 293t细胞 自噬 细胞凋亡
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人CD23基因的扩增及其在HEK 293T细胞的高效表达
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作者 李秀锦 仲峰 +4 位作者 付志强 范绍瑛 李轶 刘俊乐 仲飞 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2007年第5期565-568,共4页
目的建立一个有效表达CD23的系统。方法采用RT-PCR方法,从外周血淋巴细胞中扩增人的CD23cDNA基因,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3·1B上,构建成pcDNA3·1/CD23质粒表达载体;将pcDNA3·1/CD23质粒转染HEK293T细胞,通过流式... 目的建立一个有效表达CD23的系统。方法采用RT-PCR方法,从外周血淋巴细胞中扩增人的CD23cDNA基因,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3·1B上,构建成pcDNA3·1/CD23质粒表达载体;将pcDNA3·1/CD23质粒转染HEK293T细胞,通过流式细胞仪和Westernblot检测CD23在细胞中的表达情况。结果扩增的CD23cDNA序列与文献报道的一致;通过构建表达载体和转染细胞实现了CD23cDNA在293T细胞膜上的表达。转染效率达80%以上,并获得了较高水平的表达。结论扩增CD23cDNA基因,经过转染HEK293T细胞,实现了CD23在HEK293T细胞的高效表达。 展开更多
关键词 CD23 hek293t细胞 表达 WESTERN BLOT 流式细胞分析
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Protective Effect of Reduced Glutathione C_(60) Derivative against Hydrogen Peroxide-induced Apoptosis in HEK 293T Cells 被引量:1
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作者 黄锦 周迟 +3 位作者 贺军 胡铮 官文超 刘胜洪 《Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences)》 SCIE CAS 2016年第3期356-363,共8页
Hydrogen peroxide(H_2O_2) and free radicals cause oxidative stress, which induces cellular injuries, metabolic dysfunction, and even cell death in various clinical abnormalities. Fullerene(C_(60)) is critical fo... Hydrogen peroxide(H_2O_2) and free radicals cause oxidative stress, which induces cellular injuries, metabolic dysfunction, and even cell death in various clinical abnormalities. Fullerene(C_(60)) is critical for scavenging oxygen free radicals originated from cell metabolism, and reduced glutathione(GSH) is another important endogenous antioxidant. In this study, a novel water-soluble reduced glutathione fullerene derivative(C_(60)-GSH) was successfully synthesized, and its beneficial roles in protecting against H_2O_2-induced oxidative stress and apoptosis in cultured HEK 293 T cells were investigated. Fourier Transform infrared spectroscopy and 1H nuclear magnetic resonance were used to confirm the chemical structure of C_(60)-GSH. Our results demonstrated that C_(60)-GSH prevented the reactive oxygen species(ROS)-mediated cell damage. Additionally, C_(60)-GSH pretreatment significantly attenuated H_2O_2-induced superoxide dismutase(SOD) consumption and malondialdehyde(MDA) elevation. Furthermore, C_(60)-GSH inhibited intracellular calcium mobilization, and subsequent cell apoptosis via bcl-2/bax-caspase-3 signaling pathway induced by H_2O_2 stimulation in HEK 293 T cells. Importantly, these protective effects of C_(60)-GSH were superior to those of GSH. In conclusion, these results suggested that C_(60)-GSH has potential to protect against H_2O_2-induced cell apoptosis by scavenging free radicals and maintaining intracellular calcium homeostasis without evident toxicity. 展开更多
关键词 reduced glutathione C60 derivative hydrogen peroxide oxidative stress apoptosis hek 293t cells
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SNAPIN基因对受体酪氨酸激酶c-MET在HEK 293T细胞中表达的影响
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作者 高迎春 张传领 +3 位作者 牛丽丽 温建勋 程国强 肖瑞 《山西医科大学学报》 CAS 2015年第8期724-728,共5页
目的探讨HEK 293T细胞中受体酪氨酸激酶c-MET的表达是否受SNAPIN基因表达的影响。方法构建pEGFPSNAPIN荧光蛋白表达载体,并将pEGFP-SNAPIN荧光蛋白表达载体和siRNA干扰片段通过脂质体转染的方法分别转染到HEK 293T细胞中,利用实时定量PC... 目的探讨HEK 293T细胞中受体酪氨酸激酶c-MET的表达是否受SNAPIN基因表达的影响。方法构建pEGFPSNAPIN荧光蛋白表达载体,并将pEGFP-SNAPIN荧光蛋白表达载体和siRNA干扰片段通过脂质体转染的方法分别转染到HEK 293T细胞中,利用实时定量PCR的方法在转录水平上观察SNAPIN表达改变对其相互作用蛋白c-MET的影响。结果成功构建pEGFP-SNAPIN荧光蛋白表达载体;实时定量PCR实验结果显示SNAPIN被沉默后其表达量降低,c-MET的表达也相应下降;转染pEGFP-SNAPIN荧光蛋白表达载体后,SNAPIN的表达量增加,c-MET的表达也相应增加。结论转录水平上SNAPIN相互作用蛋白c-MET的表达可能受到SNAPIN的调控。 展开更多
关键词 SNAPIN C-MET hek 293t细胞
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小鼠精子发生相关蛋白3基因在小鼠生精细胞的特异表达及对HEK 293T细胞凋亡和自噬的影响 被引量:3
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作者 王玉晶 温丽敏 +3 位作者 白欣艳 曹睿 王海龙 郭睿 《解剖学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期41-48,共8页
目的检测小鼠精子发生相关蛋白3(spata3)基因在小鼠生精细胞的表达情况,并借助过表达细胞模型进一步分析该基因对人胚肾HEK 293T细胞凋亡及自噬的影响,旨在探讨spata3在精子发生过程中的意义。方法分别采用RT-PCR和免疫印迹法检测spata... 目的检测小鼠精子发生相关蛋白3(spata3)基因在小鼠生精细胞的表达情况,并借助过表达细胞模型进一步分析该基因对人胚肾HEK 293T细胞凋亡及自噬的影响,旨在探讨spata3在精子发生过程中的意义。方法分别采用RT-PCR和免疫印迹法检测spata3基因mRNA及蛋白产物在小鼠各组织中的表达;应用免疫组织化学和免疫荧光染色观察SPATA3蛋白在生精细胞中的定位;借助脂质体将真核表达载体Plv-EGFP-2(a)purospata3瞬时转染HEK 293T细胞,进一步在蛋白水平分析细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)、BAX和Bcl-2及自噬相关蛋白LC3A/B的变化。结果 Spata3基因及其编码产物在小鼠睾丸组织特异表达;粗线期精母细胞和圆形精子细胞的胞质与胞核均有显著SPATA3蛋白的阳性着色,长形精子细胞的胞质也有大量分布;过表达spata3的HEK 293T细胞内活化型Caspase-3和PARP降解产物的含量较对照组差异无显著性,BAX表达量0.815±0.020较裸细胞组0.469±0.012和空载体转染组0.588±0.018均有所增高,Bcl-2含量0.214±0.020低于裸细胞0.507±0.021和空载体转染组0.545±0.024,LC3A/B-Ⅱ的表达量0.741±0.037则显著高于裸细胞组0.136±0.011和空载体转染组0.169±0.012。结论 Spata3基因在小鼠生精细胞特异表达,过表达spata3对HEK 293T细胞凋亡无明显影响,但可以促进细胞自噬。 展开更多
关键词 精子发生相关蛋白3基因 hek 293t细胞 细胞转染 自噬 免疫印迹法 小鼠
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垂盆草乙醇提取物诱导HEK 293T细胞凋亡及作用机制 被引量:3
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作者 彭勇波 王齐 梁大焱 《中南民族大学学报(自然科学版)》 CAS 2019年第3期372-376,共5页
目的:探讨垂盆草乙醇提取物(EESS)对HEK293T细胞凋亡的诱导作用和机制.方法:利用CCK-8法检测垂盆草乙醇提取物对细胞增殖影响,用Hoechst33342染色法及Annexin V-FITC染色流式细胞检测其对细胞凋亡的影响,以Western blot检测其对NF-κB... 目的:探讨垂盆草乙醇提取物(EESS)对HEK293T细胞凋亡的诱导作用和机制.方法:利用CCK-8法检测垂盆草乙醇提取物对细胞增殖影响,用Hoechst33342染色法及Annexin V-FITC染色流式细胞检测其对细胞凋亡的影响,以Western blot检测其对NF-κB信号通路蛋白及凋亡相关通路蛋白Bcl-2,Bax,Bcl-xL等表达的影响.结果:EESS对细胞增殖具有抑制作用,能促进其凋亡呈剂量依赖性,并显著上调NF-κΒ磷酸化水平及凋亡启动蛋白线粒体细胞色素C(Cyc)蛋白和促凋亡蛋白Bax的表达(P<0.05).结论:垂盆草乙醇提取物能诱导HEK 293T细胞的凋亡,其作用机制与NF-κΒ信号途径及其介导的凋亡启动蛋白Cyt c和促凋亡蛋白Bax的表达上调有关. 展开更多
关键词 垂盆草 乙醇提取物 hek293t 凋亡
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花生红衣中反式白藜芦醇对HEK293T细胞抗氧化的影响
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作者 孙畅 周春田 +5 位作者 岳玉兰 吕呈蔚 李云飞 黄威 李铁柱 胡济美 《中国食品学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2024年第5期150-160,共11页
目的:分析花生红衣中的白藜芦醇成分,探究其主要成分反式白藜芦醇(RES)对人胚胎肾细胞293(HEK293T)抗氧化的影响及其潜在的分子机制。方法:采用超声波辅助酶法提取花生红衣中的白藜芦醇,采用高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)技术分析花... 目的:分析花生红衣中的白藜芦醇成分,探究其主要成分反式白藜芦醇(RES)对人胚胎肾细胞293(HEK293T)抗氧化的影响及其潜在的分子机制。方法:采用超声波辅助酶法提取花生红衣中的白藜芦醇,采用高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)技术分析花生红衣中白藜芦醇粗提液的组成成分。通过测定细胞活力,检测RES对HEK293T细胞的最高毒性。通过荧光素酶报告基因试验及免疫印迹试验检测其对Keap1-Nrf2-ARE抗氧化信号通路的影响,以DPPH自由基清除率评价其体外抗氧化能力。结果:HPLC-MS结果表明,花生红衣中含有白藜芦醇苷、白皮杉醇和RES。由于白藜芦醇在自然界中主要以反式白藜芦醇形式存在,因此选择RES进行后续试验。细胞存活力检测结果表明,RES对HEK293T细胞的最高无毒浓度为50μmol/L,体外抗氧化作用呈浓度依赖性。荧光素酶报告基因分析表明,RES显著诱导了ARE介导的转录激活。免疫印迹结果显示,RES能诱导Nrf2介导的3个抗氧化蛋白表达【血红素氧合酶1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO1)和谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCLM)】表达。此外,DPPH自由基清除率测定结果表明,RES能有效清除DPPH自由基,具有体外抗氧化能力。结论:花生红衣中白藜芦醇的主要成分RES对HEK293T细胞有抗氧化作用,可通过Keap1-Nrf2-ARE信号通路激活潜在的抗氧化活性。 展开更多
关键词 花生红衣 白藜芦醇 hek293t 高效液相色谱-质谱联用 Keap1-Nrf2-ARE信号通路 抗氧化
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再生基因4(REG4)真核表达载体的构建及其蛋白在HEK293T细胞中的表达、纯化
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作者 徐杨 杜惠芬 +4 位作者 李克生 柴丹丹 石晓玲 连晓雯 张学良 《现代检验医学杂志》 CAS 2023年第4期35-39,共5页
目的构建再生基因4(regenerating gene 4,REG4)的真核表达载体,转染人胚肾细胞293T(human embryonic kidney 293T cells,HEK 293T),获得重组人再生胰岛衍生蛋白IV(regenerating islet-derived protein IV,Reg IV)。方法根据NCBI数据库R... 目的构建再生基因4(regenerating gene 4,REG4)的真核表达载体,转染人胚肾细胞293T(human embryonic kidney 293T cells,HEK 293T),获得重组人再生胰岛衍生蛋白IV(regenerating islet-derived protein IV,Reg IV)。方法根据NCBI数据库REG4基因序列进行基因优化、合成,将其克隆至pCDNA3.4载体并进行双酶切和测序鉴定,通过转染试剂聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)将pCDNA3.4-REG4质粒瞬时转染至HEK 293T细胞(实验组),同时以pEGFP-C1质粒作为转染对照组,未转染重组质粒的HEK 293T细胞作为空白对照组。荧光显微镜观察转染对照组转染效率,分别收集实验组及空白对照组细胞和细胞培养液上清,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)与免疫印迹试验(Western-Blot,WB)检测Reg IV蛋白表达水平。通过镍柱及丙烯葡聚糖凝胶S-400(Sephacryl S-400)柱进行蛋白纯化,SDS-PAGE及WB对纯化后重组蛋白进行鉴定。结果经测序和双酶切鉴定,重组质粒pCDNA3.4-REG4构建成功。转染对照组(pEGFP-C1质粒)荧光显微镜观察结果显示转染效率约50%,表明转染成功。WB结果显示仅在实验组(pCDNA3.4-REG4质粒)的细胞中检测到RegIV蛋白。镍柱纯化时目的蛋白无法与镍柱填料有效结合,SephacrylS-400凝胶柱层析纯化获得了此重组蛋白。结论成功构建了REG4基因真核表达载体并在HEK 293T细胞中成功表达,为深入研究Reg IV蛋白的作用机理及开发潜在的抗癌靶向药物奠定了基础。 展开更多
关键词 再生基因4 再生胰岛衍生蛋白Ⅳ 真核表达 人胚肾细胞293t 瞬时转染 蛋白纯化
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犬β防御素-1真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达 被引量:4
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作者 靳慧君 仲飞 +3 位作者 吴凌娟 解民 王微 韩冬梅 《动物学报》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2008年第5期897-902,共6页
哺乳动物的β-防御素是一类具有广谱抗微生物活性的阳离子小肽。为了克隆和分析犬β防御素-1基因,并建立一套在HEK293T细胞中高效表达犬β防御素-1的方法,本研究采用RT-PCR方法从犬睾丸组织中扩增出犬β防御素-1(cBD-1)的cDNA基因,并将... 哺乳动物的β-防御素是一类具有广谱抗微生物活性的阳离子小肽。为了克隆和分析犬β防御素-1基因,并建立一套在HEK293T细胞中高效表达犬β防御素-1的方法,本研究采用RT-PCR方法从犬睾丸组织中扩增出犬β防御素-1(cBD-1)的cDNA基因,并将其克隆到pcDNA3.1A载体中,构建了犬β防御素-1基因的真核表达载体pcDNA3.1A-cBD-1,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:克隆的犬β防御素-1基因序列与已发表序列(GenBank编号:NM-001024641)的同源性为99.7%。表达犬β防御素-1经Western-blot检测,证明构建的犬β防御素-1基因表达载体能够在真核细胞中表达,表达产物能够分泌到细胞外。为进一步研究犬β防御素的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 犬β防御素-1 载体构建 hek293t细胞 表达
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一种高效稳定的磷酸钙转染HEK293T细胞的方法 被引量:4
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作者 况野 房有荣 +6 位作者 刘丽 王蓉 严子琴 李海龙 孟凡国 盛清 欧文斌 《浙江大学学报(农业与生命科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期407-413,共7页
为了克服磷酸钙转染法在真核细胞中转染效率低和不稳定性等缺点,适用于体外在哺乳细胞中高效表达外源蛋白,将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达质粒通过常规的磷酸钙转染法导入到HEK293T细胞中,对影响质粒转染效率的条... 为了克服磷酸钙转染法在真核细胞中转染效率低和不稳定性等缺点,适用于体外在哺乳细胞中高效表达外源蛋白,将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达质粒通过常规的磷酸钙转染法导入到HEK293T细胞中,对影响质粒转染效率的条件逐步予以优化,具体包括:在制备磷酸钙-DNA沉淀复合物时,对DNA质粒的用量和涡旋混匀时间的优化;磷酸钙-DNA沉淀形成后对转染促进剂(甘油、丁酸钠和氯喹)的浓度、作用时间及其组合进行优化和筛选。结果表明:GFP转染6孔板培养的HEK293T细胞的DNA质粒最适用量为3μg/孔,其转染效率较1和2μg/孔的平均转染效率提高了50%,较4和5μg/孔的平均转染效率提高了70%以上;涡旋混匀时间最佳为10s,比涡旋混匀5s时的转染效率提高了80%;在上述优化条件基础上加入不同的转染促进剂,其中单独使用15%甘油处理细胞6.5min时,所得转染效率较2.5、4.5、8.5和10.5min有明显提高,15%甘油+5mmol/L丁酸钠联用或者单独用500μmol/L氯喹处理细胞后,转染效率较常规方法分别提高了80%和75%,且荧光表达强度有所增强。总之,该文通过对磷酸钙转染时和转染后的条件进行优化,使其转染效率较常规方法有了显著提高,相对于脂质体转染法更加安全可靠,且价格低廉,因此可适用于大规模蛋白表达质粒转染或者病毒包装,尤其适用于各种糖基化蛋白如肿瘤诊断标志物在体外的高通量表达与制备。 展开更多
关键词 磷酸钙转染 hek293t细胞 转染促进剂 甘油 丁酸钠 氯喹
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过表达Grx1抑制HEK293T细胞中H2O2诱导的p38MAPK信号通路 被引量:3
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作者 邹朝霞 李强 +4 位作者 刘莹莹 吴莉芳 张春晶 房绍红 周宏博 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期537-542,共6页
谷氧还蛋白1(glutaredoxin1,Grx1)是细胞内一种重要的巯基-二硫键氧化还原酶,在细胞内氧化还原状态的调控及抵抗氧化应激损伤过程中发挥重要作用.为进一步探讨Grx1的抗氧化机制,本实验将重组质粒pcDNA3.1(+)-hGrx1瞬时转染HEK293T细胞,... 谷氧还蛋白1(glutaredoxin1,Grx1)是细胞内一种重要的巯基-二硫键氧化还原酶,在细胞内氧化还原状态的调控及抵抗氧化应激损伤过程中发挥重要作用.为进一步探讨Grx1的抗氧化机制,本实验将重组质粒pcDNA3.1(+)-hGrx1瞬时转染HEK293T细胞,经RT-PCR和Western印迹验证,细胞转染后实现了Grx1的过表达;以不同浓度H2O2为损伤因素,建立细胞氧化应激模型,检测过表达Grx1后细胞存活率,丙二醛(MDA)含量,超氧化物歧化酶(SOD)活力和乳酸脱氢酶(LDH)漏出率的变化,观察过表达Grx1后细胞的抗氧化能力;用终浓度100μmol/L H2O2作用于细胞,利用Western印迹检测120 min内HEK293T细胞中p38MAPK磷酸化水平.实验结果表明,HEK293T细胞过表达Grx1后,缓解了细胞的氧化应激损伤;转染空载体组细胞p38MAPK磷酸化水平在H2O2刺激后5min开始升高,15min达到最高值,并可维持至120min左右;而过表达Grx1组细胞p38MAPK磷酸化水平在H2O2刺激后各时间段没有明显改变,提示Grx1通过抑制H2O2诱导的p38MAPK信号通路激活发挥其抗氧化作用. 展开更多
关键词 谷氧还蛋白 hek293t细胞 氧化应激 P38MAPK 瞬时转染
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稳定表达绿色荧光蛋白的HEK293T细胞的构建 被引量:3
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作者 阳小飞 余意 +2 位作者 刘孟雪 荣伊 林显光 《中南民族大学学报(自然科学版)》 CAS 北大核心 2017年第2期38-41,共4页
为探讨绿色荧光蛋白(GFP)在传代细胞中是否能随细胞的增殖稳定表达,构建稳定表达GFP的细胞系统,选取HEK293T细胞,使用第三代慢病毒包装系统,包装表达了GFP的慢病毒,然后用包装好的慢病毒去侵染HEK293T细胞.通过细胞成像技术统计了不同... 为探讨绿色荧光蛋白(GFP)在传代细胞中是否能随细胞的增殖稳定表达,构建稳定表达GFP的细胞系统,选取HEK293T细胞,使用第三代慢病毒包装系统,包装表达了GFP的慢病毒,然后用包装好的慢病毒去侵染HEK293T细胞.通过细胞成像技术统计了不同代数细胞的荧光强弱并计算细胞形态大小,利用膜片钳记录了HEK293T细胞的电流-电压(I-V)曲线.实验结果显示,GFP能随细胞的增殖稳定表达,被慢病毒侵染后的细胞的形态及基本电生理活动与正常细胞相比,没有产生显著差异. 展开更多
关键词 绿色荧光蛋白 hek293t细胞 慢病毒
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重组鸡白细胞介素-7在HEK293T细胞中的表达及其条件分析 被引量:1
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作者 霍珊珊 王利月 +5 位作者 张永红 张建楼 徐建 崔丹 仲飞 李秀锦 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期83-87,共5页
为提高重组鸡白细胞介素-7(chIL-7)在真核细胞中的表达水平,本试验分析了影响基因表达的一些因素,包括转染方法、质粒用量、转染时间及表达时间等,对重组chIL-7表达水平的影响,并通过正交试验设计方法确定了利用HEK293T细胞表达重组chI... 为提高重组鸡白细胞介素-7(chIL-7)在真核细胞中的表达水平,本试验分析了影响基因表达的一些因素,包括转染方法、质粒用量、转染时间及表达时间等,对重组chIL-7表达水平的影响,并通过正交试验设计方法确定了利用HEK293T细胞表达重组chIL-7的最适表达条件。结果表明,在T75细胞瓶中,由脂质体介导使用30μg质粒,转染4h,表达48h和由磷酸钙介导使用40μg质粒,转染6h,表达60h可以获得较高的表达效率,表达水平分别为(124±9)和(94.3±8)μg/106个细胞。本结果为进一步研究chIL-7的功能提供有利条件。 展开更多
关键词 ChIL-7 最适表达条件 正交试验 hek293t细胞
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重组犬IFN-γ在HEK293T细胞中的表达 被引量:1
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作者 靳慧君 李楠 +3 位作者 郭常春 韩冬梅 王微 仲飞 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期102-105,共4页
为了建立一套犬IFN-γ(cIFN-γ)在HEK293T细胞中表达的方法,用伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激犬脾细胞,通过RT-PCR方法从脾细胞中扩增犬IFN-γ基因,并将其克隆到pcDNA3.1A载体中,构建的真核表达载体pcDNA3.1A-cIFN-γ经磷酸钙介导转染HEK293T... 为了建立一套犬IFN-γ(cIFN-γ)在HEK293T细胞中表达的方法,用伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激犬脾细胞,通过RT-PCR方法从脾细胞中扩增犬IFN-γ基因,并将其克隆到pcDNA3.1A载体中,构建的真核表达载体pcDNA3.1A-cIFN-γ经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:克隆的犬IFN-γcDNA基因与GenBank上发表的序列一致,同源性100%。表达产物经Western-blot方法检测,证明克隆的犬IFN-γ基因能够在HEK293T细胞中进行表达,并且表达产物能够分泌到细胞外。 展开更多
关键词 犬γ-干扰素 hek293t细胞 表达
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猪β防御素-2基因在HEK293T细胞中的表达 被引量:1
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作者 王微 解民 +3 位作者 吴凌娟 靳慧君 韩冬梅 仲飞 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期78-81,共4页
用Trizol试剂提取猪血白细胞总RNA,根据已发表的序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增出猪β防御素-2(pBD-2)基因,并将该基因插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成猪β防御素-2基因的真核表达载体pcDNA3.1A/pBD-2,经磷酸钙介导转染HEK293T... 用Trizol试剂提取猪血白细胞总RNA,根据已发表的序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增出猪β防御素-2(pBD-2)基因,并将该基因插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成猪β防御素-2基因的真核表达载体pcDNA3.1A/pBD-2,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:本试验扩增的pBD-2基因与已发表的序列完全一致。表达产物经Western-blot检测,证明pBD-2能够在真核细胞HEK293T中表达。 展开更多
关键词 猪β防御素-2 hek293t细胞 表达
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人源性抗体在HEK293T细胞中瞬时表达条件的优化 被引量:1
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作者 陶俊 向军俭 +2 位作者 王宏 龚义平 邓宁 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第11期137-141,共5页
以HEK293T细胞为宿主对抗体基因的转染和表达条件进行优化。以GFP(green fluorescence protein)和人源性抗b FGF抗体1A2为报告基因,考察了3种转染试剂磷酸钙,PEI,FuGene HD的转染效率,确定FuGene HD的转染效率最高后,对DNA∶FuGene HD... 以HEK293T细胞为宿主对抗体基因的转染和表达条件进行优化。以GFP(green fluorescence protein)和人源性抗b FGF抗体1A2为报告基因,考察了3种转染试剂磷酸钙,PEI,FuGene HD的转染效率,确定FuGene HD的转染效率最高后,对DNA∶FuGene HD的比例,加入氯喹的浓度,转染后的孵育时间,最佳的低温培养温度以及加入组蛋白抑制剂的浓度进行了优化。结果显示,FuGene HD的转染效率最高,达到56.7%。当转染的DNA=2μg/4×106细胞时,DNA∶FuGene HD的最佳比例为1∶4(W/V);加入氯喹能够增强FuGene HD的转染效率,最佳浓度为100μmol/L,转染后的最佳孵育时间为6h;低温诱导能够提高293T细胞表达抗体的能力,最佳的温度为33℃;加入组蛋白抑制剂丁酸钠或丙戊酸能够明显提高抗体的表达量,丙戊酸的效果优于丁酸钠。通过对转染试剂,转染方法,培养温度,组蛋白抑制剂的加入等条件进行优化使人源性抗bFGF抗体的表达量从1.5mg/L提高到了15.1mg/L。 展开更多
关键词 人源性抗体 瞬时表达 优化 hek293t
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GST pulldown技术检测HEK293T细胞Daam1的活性 被引量:1
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作者 李卫星 杜军 朱一超 《南京医科大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2011年第10期1412-1416,共5页
目的:运用GST pulldown技术建立真核细胞中Daam1活性检测的可靠方法。方法:构建GST-RhoA的原核表达载体,并使其在大肠杆菌BL21菌株中大量表达。用GST pulldown和Western blot技术分别检测HEK293T细胞中活化的Daam1及Daam1蛋白的表达。结... 目的:运用GST pulldown技术建立真核细胞中Daam1活性检测的可靠方法。方法:构建GST-RhoA的原核表达载体,并使其在大肠杆菌BL21菌株中大量表达。用GST pulldown和Western blot技术分别检测HEK293T细胞中活化的Daam1及Daam1蛋白的表达。结果:在成功构建了GST-RhoA的原核表达载体,并使其在原核细胞中大量表达融合蛋白GST-RhoA后,用GST pulldown和Western blot技术证实HEK293T细胞中有活化的Daam1和Daam1总蛋白的表达。结论:本工作所建立的GST pulldown技术可以检测HEK293T细胞中Daam1的活性,从而为进一步深入研究Daam1在真核细胞中的功能提供了技术保障。 展开更多
关键词 GST pulldown hek293t Daam1 真核细胞
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HEK293T细胞扩增重组腺病毒研究 被引量:3
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作者 曹洁玮 李小鹰 《军医进修学院学报》 CAS 2009年第6期860-862,共3页
目的探讨HEK293T细胞扩增重组腺病毒的可行性。方法重组腺病毒保存液稀释后感染HEK293T细胞,观察细胞病变效应,半数组织培养感染量测定扩增病毒的滴度,通过体外感染心肌细胞,成纤维细胞验证其感染活性。结果HEK293T细胞可以扩增带有绿... 目的探讨HEK293T细胞扩增重组腺病毒的可行性。方法重组腺病毒保存液稀释后感染HEK293T细胞,观察细胞病变效应,半数组织培养感染量测定扩增病毒的滴度,通过体外感染心肌细胞,成纤维细胞验证其感染活性。结果HEK293T细胞可以扩增带有绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒,病毒滴度为5×106PFU/mL,扩增后的腺病毒可以感染体外培养的心肌细胞和成纤维细胞。结论HEK293T细胞可有效扩增带有绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒。 展开更多
关键词 重组腺病毒 hek293t细胞 绿色荧光蛋白质
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