利用CRISPR/Cas9技术构建CYP2E1基因敲除的HEK293FT细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9系统在HEK293FT细胞系中敲除CYP2E1基因并探讨其在检测化学物毒性中的应用。方法:设计3对分别靶向CYP2E1基因第2、第3和第7外显子的sg RNA序列并构建PX461表达载体;将携带靶向CYP2E1的sg RNA表达载体转染至HEK293FT细胞中,通过SURVEYOR检测分析sg RNA的切割效率;利用有限稀释法获得CYP2E1敲除细胞株,通过实时荧光定量PCR和蛋白印迹检测细胞株中CYP2E1的敲除效果;并检测其对N-(4-羟基苯基)乙酰胺和1,2-二氯乙烷的细胞毒性效应的影响。结果:SURVEYOR检测分析靶向CYP2E1基因第3外显子的sg RNA的切割效率为23%;成功构建了2株CYP2E1基因敲除的细胞株,实时荧光定量PCR结果显示CYP2E1 m RNA表达下降,蛋白印迹结果显示CYP2E1蛋白无表达;CYP2E1基因敲除会显著降低N-(4-羟基苯基)乙酰胺和1,2-二氯乙烷的细胞毒性。结论:通过CRISPR/Cas9构建出CYP2E1稳定敲除的肾细胞系,为研究CYP2E1的功能和作用机制提供了有效的工具。

人MCHR1真核表达载体构建及稳定转染HEK293细胞系的建立

目的构建人MCHR1真核表达载体,转染HEK293细胞,建立稳定转染的HEK293细胞系。方法采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HEK293细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HEK293细胞系,用RT-PCR、Western-blot检测MCHR1的表达。结果构建了pcDNA3.1(+)/MCHR1真核表达载体,建立了稳定转染的HEK293细胞系,并成功地表达了目的基因。结论真核表达载体成功构建和稳定转染HEK293细胞系的建立为进一步研究MCHR1的功能奠定了良好的实验基础。

稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒受体CD163的HEK293细胞系的建立

为构建稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)受体CD163的HEK293细胞系,本研究采用RT-PCR方法从猪肺泡巨噬细胞(PAM)总RNA中扩增CD163基因并将其克隆至真核表达载体pc DNA3.1(+)中,构建重组质粒pc DNA-CD163。将该重组质粒转染HEK293细胞,并利用G418筛选、纯化,获得了稳定表达CD163受体蛋白的HEK293CD163细胞系。RT-PCR、流式细胞术及western blot检测结果表明,该细胞系在传代至15代后,CD163在HEK293细胞中仍然能够稳定表达。在该细胞系中接种PRRSV后进行间接免疫荧光及噬斑试验检测表明,病毒能够通过CD163感染HEK293CD163细胞并在其中增殖。该细胞系的建立为进一步研究PRRSV的侵入细胞和致病机制提供了病毒在体外增殖的易感细胞系。

表达BCRP的胚肾细胞系HEK293/BCRP的建立及生物学特征

目的:建立HEK293/BCRP多药耐药细胞系并研究其生物学功能。方法:构建有BCRP基因的表达载体,利用脂质体转染方法将载体转入HEK293细胞,并用RT-PCR、间接免疫荧光染色和流式细胞术分析检测转染细胞系BCRP的表达,体外细胞毒试验检测其对米托蒽醌等的耐药指数,流式细胞术和激光共聚焦分别检测其对罗丹明123和阿霉素的外排作用。结果:HEK293/BCRP细胞系在BCRP mRNA和蛋白表达均明显升高(P<0.05),对米托蒽醌的耐药指数达112.07倍,经1.5 h和3 h外排,细胞内罗丹明123浓度分别降低了42.25%和69.01%,激光共聚焦显示细胞内阿霉素浓度降低。结论:成功构建了表达BCRP的胚肾细胞系HEK293/BCRP,并对多种抗肿瘤药物具有耐受性。

稳定表达马TRIM5α蛋白的HEK293细胞系的建立及其抗病毒活性初步研究

为建立稳定表达马TRIM5α(eqTRIM5α)的HEK293细胞系,并检测马TRIM5α(eqTRIM5α)的抗病毒功能,本研究将eqTRIM5α克隆于慢病毒表达载体pLPCX中,构建重组质粒pLPCX-eqTRIM5α-HA,同时构建恒河猴的pLPCX-Rh TRIM5α-HA作为阳性对照。利用VSV-G包装慢病毒,感染HEK293细胞,并利用嘌呤霉素筛选、纯化,建立了稳定表达eqTRIM5α和Rh TRIM5α的HEK293细胞系。经western blot和流式细胞术鉴定,该细胞系传代至20代后,仍然能够检测到eqTRIM5α和RhTRIM5α的稳定表达。将该细胞系应用于抗马传染性贫血病毒(EIAV)活性研究中,结果显示eqTRIM5α同RhTRIM5α一样均能够抑制病毒复制,表明eqTRIM5α是一种对EIAV具有较强限制作用的宿主蛋白。该细胞系的建立为进一步评价和研究eqTRIM5α的抗病毒作用和机制奠定了基础。

白细胞介素-6参与肿瘤相关抗原HCA520对HEK293细胞的促增殖作用

目的:研究肿瘤相关抗原HCA520对HEK293细胞增殖的影响,获得HCA520生物学功能的初步提示。方法:构建pcDNA3 HCA520 flag真核表达载体转染HEK293细胞并建立稳定转染细胞系,利用MTT实验观察HCA520对HEK293细胞增殖速率的调节。通过RT PCR检测可能参与HCA520对HEK293细胞增殖促进作用的相关分子,并用3 (4, 5 二甲基2 噻唑) 2, 5 二苯基溴化四唑(MTT)实验进一步验证目标分子对HEK293细胞增殖的作用。结果:MTT实验结果显示HCA520显著提高HEK293细胞的增殖速率,HCA520上调白细胞介素6在HEK293细胞中的表达,后者部分参与HCA520对HEK293细胞的促增殖作用。结论:HCA520对HEK293细胞的增殖具有促进作用,并推测可能通过促进细胞恶性增殖在肿瘤发生中发挥作用。

过表达FLJ22349促进人胚胎肾细胞HEK293及乳腺癌细胞MCF-7的生长

目的:人假想蛋白FLJ22349基因位于染色体22q13.2上,编码一个229个氨基酸的蛋白。表达谱分析发现多种肿瘤组织中有FLJ22349的表达,预测该基因可能与肿瘤的发生发展有密切关系。本研究旨在用生物信息学方法分析FLJ22349的结构和功能,并初步研究FLJ22349在HEK293及乳腺癌细胞中的作用。方法:运用各种生物信息学数据库初步分析FLJ22349的结构和功能。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法分析FLJ22349基因在小鼠正常组织,人癌症细胞株及HEK293中的表达情况。将载有FLJ22349的基因的质粒转染入HEK293,MCF-7,MDA-MB231中,观察该基因的亚细胞定位。MTT检测细胞的生长变化。结果:FLJ22349基因在人类、猩猩、恒河猴、褐家鼠、小鼠和狗中有很高的同源性,但与其它已知的基因无同源性。小鼠正常组织中有FLJ22349表达;乳腺癌细胞株MDA-MB231,肝癌细胞株Bel-7402也有表达;主要定位于细胞核;转染FLJ22349的HEK293,MCF-7细胞株生长曲线显示促进细胞生长(P<0.05)。FLJ22349转染120h后,MTT实验观察到HEK293,MCF-7细胞的增殖率分别为299%,456%;而对照组分别为233%,272%。结论:FLJ22349基因过表达促进HEK293和MCF-7细胞的生长。

DRR1与COMMD1基因在人肾上皮细胞HEK293T中相互作用的研究

目的到目前为止,肿瘤抑制基因DRR1被发现在各种组织中表达广泛,但其作用机制尚未完全揭示。本研究主要对DRR1在细胞核内与COMMD1基因之间相互的作用进行研究。方法采用免疫荧光染色的方法检测DRR1和COMMD1在HEK293T细胞核内表达情况,同时,在细胞中过表达DRR1后检测细胞核内COMMD1含量变化。结果DRR1主要在细胞核内表达,且DRR1与COMMD1在细胞核内相互结合;过表达DRR1可以促进细胞核内COMMD1的富集。结论DRR1对COMMD1在细胞核内富集具有调控作用,为DRR1的作用机制提供了新的理论依据。

VR1受体稳定真核表达细胞系的建立

[目的 ]为研究VR1(Vanilloidreceptorsubtype1)受体的功能 ,建立VR1稳定真核表达细胞系。 [方法 ]采用RT -PCR的方法从大鼠脊髓克隆VR1cDNA ,并构建VR1表达载体。将VR1质粒通过电穿孔方法转染HEK2 93细胞 ,经G4 18筛选获得稳定表达的细胞克隆。采用RT -PCR、Westernblotting、免疫荧光、细胞Ca2 +浓度测定等方法检测VR1受体的表达。 [结果 ]筛选的阳性细胞克隆含有VR1的mRNA及蛋白质 ,细胞Ca2 +浓度的改变提示VR1受体的功能性表达。 [结论 ]建立了稳定表达VR1受体的真核表达细胞系。

稳定高效表达正反义Alu-Sx细胞系的建立

目的建立稳定高效表达正反义A lu-Sx的细胞系。方法根据A lu亚家族Sx序列合成两对两端带有限制性酶切位点的引物,提取HEK293细胞的总DNA后PCR扩增,产物连接到真核表达载体pcDNA3.1/myc-H is A中构建成重组体。经酶切及测序鉴定后,阳离子脂质体转染法转染HEK293细胞后G418筛选稳定表达的细胞克隆,Northern杂交检测并挑选出表达最强的亚克隆。结果成功构建A lu亚家族Sx的正反义真核表达载体并获得高效稳定表达的HEK293细胞亚克隆。结论高效稳定表达正反义A lu Sx的HEK293细胞亚克隆可用于下一步研究。

分泌人内皮抑素基因工程细胞系的建立

目的建立稳定的基因工程细胞系。方法将含有白细胞介素-2(IL-2)分泌肽的人endostatin全长cDNA插入真核表达载体pSNA2.0,产生重组质粒pSNA2.0/hEndostatin,利用阳离子脂质体介导将其转染到人HEK293细胞中,G418筛选后得到阳性克隆hED/293,采用Western-blot检测转染细胞上清中endostatin蛋白的表达。结果hED/293细胞株培养上清中有endosta-tin蛋白的表达,分子量为20000。结论重组pSNA2.0/hEndostatin真核表达载体构建正确,转染HEK293细胞后可有效的表达人endostatin蛋白,并能分泌到细胞外。

RHBDF2-shRNA慢病毒载体的构建和Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系的建立

目的:构建RHBDF2-shRNA慢病毒载体,建立Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系,并检测稳转细胞株中RHBDF2 mRNA和蛋白表达水平。方法:根据NCBI提供的RHBDF2基因序列,设计并合成针对RHBDF2基因干扰靶点的shRNA-oligo,退火后将其连接到经Eco RⅠ和AgeⅠ酶切的慢病毒载体FV067-RNAi-EGFP-Puro中,构建FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒质粒,通过PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。使用HEK 293T细胞和Neuro-2a细胞作为实验材料,FV067 Vector作为对照组,FV067-RHBDF2-shRNA作为实验组。通过Lipofectamine 2000将FV067 Vector和FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒质粒分别与慢病毒辅助质粒psPAX2和pMD2G共转染至HEK 293T细胞中,转染48 h收集并纯化慢病毒,分别将对照组FV067 Vector和实验组FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒在感染复数(MOI)为50时感染Neuro-2a细胞,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白的表达,采用2 mg·L^-1嘌呤霉素筛选出RHBDF2基因稳定沉默的细胞系。实时荧光定量PCR法检测2组细胞中RHBDF2 mRNA表达水平,免疫印迹法检测2组细胞中RHBDF2蛋白表达水平。结果:PCR和测序,RHBDF2-shRNA慢病毒载体中的干扰序列与设计合成的RHBDF2-shRNA-oligo序列完全一致。FV067 Vector慢病毒的滴度为5×10^8 TU·mL^-1,FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒的滴度为3×10^8 TU·mL^-1。实时荧光定量PCR检测,实验组稳转细胞株中RHBDF2 mRNA表达水平比对照组降低了52.26%(t=11.44,P=0.0076)。免疫印迹法检测,与对照组比较,实验组RHBDF2-shRNA稳转细胞系中RHBDF2蛋白表达水平降低了47%(t=6.374,P=0.0078)。结论:成功构建了FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒载体并建立了Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系,且Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系中RHBDF2 mRNA和蛋白表达水平明显降低。

人心肌细胞缓慢激活延迟整流钾电流细胞模型的建立

目的建立稳定表达人心肌细胞缓慢激活延迟整流钾电流(IKs)的细胞模型。方法编码IKs通道α亚单位的KCNQ1基因及β亚单位的KCNE1基因共转染HEK 293细胞,潮霉素B筛选,电生理学及药理学方法鉴定。结果KCNQ1/KCNE1基因被成功转入HEK 293细胞,KCNQ1/KCNE1电流与人心肌IKs电流具有相似的电流特性;hKCNQ1/hKCNE1通道反转电位与细胞外钾离子浓度呈线性关系;选择性IKs通道阻断剂Chromanol 293B对KCNQ1/KCNE1电流具有明显而可逆的抑制作用,其IC50(+40 mV)为9.1μmol/L;无钾细胞外液可以增加KCNQ1/KCNE1电流幅度,+40 mV时电流幅度增加(28.6±2.0)%(P<0.01,n=8),但对其动力学特性无明显影响。结论已经成功构建稳定表达人心肌KCNQ1/KCNE1通道蛋白的HEK 293细胞系,其电生理学特性和药理学特性与人心肌IKs相似,可以作为研究人心肌IKs的细胞模型。

mM-CSF及其剪切体重组逆转录病毒表达载体的构建

目的构建膜结合型M-CSF(mM-CSF)及其胞内区截短30个氨基酸的剪切体(mM-CSF-Δ)重组逆转录病毒表达载体。方法用DNA重组技术构建并鉴定mM-CSF和mM-CSF-Δ的重组逆转录病毒表达载体MSCVPGK-GFP-mM-CSF、MSCV-PGK-GFP-mM-CSF-Δ,与空载体对照MSCV-PGK-GFP分别转染Phoenix细胞包装病毒,并感染HEK293细胞,通过流式分选术获得3种阳性细胞。结果经Phoenix包装的重组及对照逆转录病毒成功感染HEK293细胞,获得了稳定表达细胞株HEK293-M、HEK293-M-Δ和对照细胞株HEK293-V。RT-PCR以及Western blotting法检测发现HEK293细胞中有mM-CSF和mM-CSF-Δ的表达,HEK293-M细胞和HEK293-M-Δ细胞经流式抗体标记后均能检测到膜蛋白的表达。结论成功构建了mM-CSF及其剪切体的重组逆转录病毒表达载体。

Proline rich结构域介导Nogo-A激活NF-κB信号

髓鞘来源的中枢神经再生抑制因子——Nogo-A被发现除表达于成熟的少突胶质细胞,还广泛高表达于多种类型的神经元中.目前,神经元中Nogo-A的功能还不明确.为探讨神经元内Nogo-A的功能,以HEK293FT细胞为模型,利用信号途径报告基因系统筛选过表达Nogo-A对多种信号途径的调控作用,发现过表达Nogo-A能特异激活NF-κB信号,利用不同的Nogo-A剪接体和截断体形式研究,证明Nogo-A激活NF-κB信号依赖于其氨基端的prolinerich结构域,进一步使用NF-κB信号途径相关分子显性突变体揭示IκBα、TRAF6、Rac/Cdc42参与Nogo-A激活NF-κB信号.结果提示,Nogo-A可以显著激活NF-κB信号,且依赖于Nogo-A氨基段的prolinerich结构域.

利用CRISPR/Cas9技术敲除RNA甲基化酶TRDMT1基因及其功能初探

为构建TRDMT1基因敲除的HEK293细胞系,利用CRISPR/Cas9系统在TRDMT1基因第1个外显子前插入BGH Ploy(A)转录终止序列,终止TRDMT1基因表达。利用重叠PCR方法合成sgRNA序列,构建TRDMT1-gRNA载体及含不同抗生素基因的同源重组载体TRDMT1-LOXN-Puro和TRDMT1-LOXP-Neo;将同源重组载体TRDMT1-LOXN-Puro、TRDMT1-LOXP-Neo及TRDMT1-gRNA、Cas9表达载体MLM3613共转染HEK293细胞;利用Puromycin和Neomycin抗生素筛选细胞,通过RT-qPCR检测TRDMT1基因转录终止效率。通过细胞生长曲线和划痕试验检测TRDMT1基因敲除对HEK293细胞增殖和迁移能力的影响。结果表明:成功构建了TRDMT1-gRNA载体及TRDMT1-LOXN-Puro、TRDMT1-LOXP-Neo同源重组载体;与正常HEK293细胞相比,试验组TRDMT1表达量仅为1%;TRDMT1基因敲除后显著影响HEK293细胞增殖和迁移。这一研究通过CRISPR/Cas9技术成功构建了TRDMT1基因敲除的HEK293细胞系(HEK293-TKO),为RNA甲基化研究提供了一种有效的工具;TRDMT1基因可能与细胞的增殖和迁移有关。

人乳头状瘤病毒16型E7基因重组腺相关病毒载体的构建及E7 mRNA和蛋白在真核细胞中的表达

目的构建含人乳头状瘤病毒16型E7(HPV16E7)基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体,并验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞中的表达。方法将含腺相关病毒(AAV)末端反向重复序列及HPV16E7基因的重组质粒pAAVMCSE7、含rep/cap基因的质粒pAAVRC及辅助质粒pAAVhelper共同转染胚胎肾细胞系HEK293细胞,回收、纯化病毒颗粒并鉴定,斑点杂交法测定病毒滴度,RTPCR技术、蛋白印迹法验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞中的表达。结果电镜鉴定结果显示真核细胞中有病毒颗粒存在,斑点杂交法测定病毒滴度为1×1011/ml。含HPV16E7基因的rAAV载体转染真核细胞后,在细胞内可检测到HPV16E7mRNA和蛋白的表达。结论本实验成功构建了含HPV16E7基因的rAAV载体,经验证HPV16E7mRNA和蛋白在真核细胞内有表达。