镉诱导HEK293细胞凋亡及其线粒体凋亡途径

本课题研究了氯化镉(CdCl_2)诱导HEK293细胞(人胚胎肾细胞系)的凋亡,初步探讨了凋亡过程中Caspase-3、Bcl-2的变化和凋亡诱导因子(AIF)的转移以及它们的意义。MTT法检测CdCl_2对HEK293细胞增殖的抑制作用;通过倒置显微镜、电镜、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术、激光共聚焦观察细胞凋亡;应用Western blot法和荧光免疫法测定Caspase-3酶原、Bcl-2蛋白的变化以及检测AIF蛋白在细胞中的定位。结果显示:CdCl_2对HEK293细胞具有显著的生长抑制作用,并呈明显的剂量和时间依赖性。在琼脂糖凝胶电泳中,显示有凋亡细胞特有的DNA梯状条带,其中30μmol/L作用6-9h梯状条带最为清晰,时间过长或浓度过高则梯状条带逐渐模糊,表明镉浓度过高或处理时间过长,细胞有坏死。流式细胞仪检测也印证了这一结果。形态学观察可见明显的细胞凋亡特征。同时线粒体膜电位明显下降,发现Caspase-3酶原蛋白、Bcl-2蛋白含量减少,并具有时间依赖性;另外检测到线粒体AIF向细胞核转移。而Bcl-2转染后有一定的抑制凋亡作用。实验结果提示,CdCl_2能够诱导HEK293细胞凋亡,线粒体损伤导致AIF转移与细胞色素c释放,从而引发的非Caspases与Caspases凋亡途径可能在镉引发的细胞凋亡过程中起重要作用,而Caspase-3, Bcl-2起着重要的调控作用。

大鼠μ型阿片受体的pIRES2-EGFP质粒构建及其在HEK293细胞中的表达

提取大鼠脑组织总RNA,通过逆转录巢式PCR,扩增μ型阿片受体全长cDNA,克隆至pMD20-T载体中,测序鉴定,纠正点突变后,经酶切连接克隆入pIRES2-EGFP中,测序及酶切结果表明μ基因正确,μ-pIRES2-EGFP质粒构建成功.用脂质体法将μ-pIRES2-EGFP转染入HEK293细胞中,在荧光显微镜下,转染细胞可以观察到绿色荧光,应用免疫组化荧光可以观察到μ基因的高强度表达.

猪β防御素-2基因在HEK293T细胞中的表达

用Trizol试剂提取猪血白细胞总RNA,根据已发表的序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增出猪β防御素-2(pBD-2)基因,并将该基因插入到真核表达载体pcDNA3.1A中,构建成猪β防御素-2基因的真核表达载体pcDNA3.1A/pBD-2,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:本试验扩增的pBD-2基因与已发表的序列完全一致。表达产物经Western-blot检测,证明pBD-2能够在真核细胞HEK293T中表达。

利用CRISPR/Cas9技术构建CYP2E1基因敲除的HEK293FT细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9系统在HEK293FT细胞系中敲除CYP2E1基因并探讨其在检测化学物毒性中的应用。方法:设计3对分别靶向CYP2E1基因第2、第3和第7外显子的sg RNA序列并构建PX461表达载体;将携带靶向CYP2E1的sg RNA表达载体转染至HEK293FT细胞中,通过SURVEYOR检测分析sg RNA的切割效率;利用有限稀释法获得CYP2E1敲除细胞株,通过实时荧光定量PCR和蛋白印迹检测细胞株中CYP2E1的敲除效果;并检测其对N-(4-羟基苯基)乙酰胺和1,2-二氯乙烷的细胞毒性效应的影响。结果:SURVEYOR检测分析靶向CYP2E1基因第3外显子的sg RNA的切割效率为23%;成功构建了2株CYP2E1基因敲除的细胞株,实时荧光定量PCR结果显示CYP2E1 m RNA表达下降,蛋白印迹结果显示CYP2E1蛋白无表达;CYP2E1基因敲除会显著降低N-(4-羟基苯基)乙酰胺和1,2-二氯乙烷的细胞毒性。结论:通过CRISPR/Cas9构建出CYP2E1稳定敲除的肾细胞系,为研究CYP2E1的功能和作用机制提供了有效的工具。

大鼠kir2.1通道重组质粒的构建及其在HEK293细胞中的表达

内向整流钾电流（IK1）是心肌最主要的背景外向电流,参与静息电位的维持和心肌动作电位3 期终末的复极,进而调控心肌的兴奋性和传导性[1,2].已知心肌细胞IK1通道主要由Kir2 亚家族（Kir2.x） 中的Kir2.1、Kir2.2 和Kir2.3 构成,它们的编码基因分别是KCNJ2、KCNJ12 和KCNJ4.其中,Kir2.1是最重要的亚型[3], 也是组成人类心肌细胞IK1电流的主要亚单位[4],大量研究表明IKir2.1减弱或增强均可导致严重的心律失常[1,2].基于此,国内外众多学者在抗心律失常药物筛选过程中将目光投向了Kir2.1 通道,Kir2.1 通道电流克隆细胞模型成为必备的研究工具.本研究利用分子克隆技术, 构建pEGFP-N1-Kir2.1 真核表达质粒, 并对其在人胚胎肾细胞（HEK293）中的表达进行检测.

SHP-2在三氧化二砷诱导HEK293T细胞凋亡中的作用

目的探讨蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2在三氧化二砷(As2O3)诱导HEK293T细胞凋亡中的作用。方法将pIRES-GFP空载体、pIRES-GFP-SHP-2野生型和pIRES-GFP-SHP-2C459S突变体载体通过磷酸钙方法转染HEK293T细胞;在5μmol.L-1的As2O3孵育48 h后,用流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot方法检测Cyt-C、Caspase-3、p-ERK、ERK、p-JNK及JNK的表达变化。结果5μmol.L-1As2O3可诱导HEK293T细胞凋亡,SHP-2能抑制其作用;SHP-2C459S突变体组Cyt-C和Caspase-3表达均高于空载体组,SHP-2野生型组则低于空载体组;SHP-2野生型组p-ERK表达高于空载体组,SHP-2C459S突变体组则相反;p-JNK的表达,SHP-2C459S突变体组高于空载体组,而SHP-2野生型组低于空载体组。结论SHP-2可抑制As2O3诱导的HEK293T细胞凋亡,其机制可能与激活ERK和抑制JNK途径有关。

过表达Sprouty2分子促进HEK293T细胞增殖与存活

目的构建表达人Sprouty 2(SPRY2)基因的重组表达载体pDC315/hSPRY2,转染人胚肾(HEK)293T细胞表达目的蛋白,初步探讨其对HEK293T细胞增殖与存活的影响。方法构建hSPRY2重组腺病毒表达载体,体外转染HEK293T细胞,以Western blot法检测目的蛋白的表达,以CCK-8法检测SPRY2对HEK293T细胞增殖或去血清条件下细胞存活的影响。结果成功构建重组表达载体pDC315/hSPRY2,在转染的HEK293T细胞中检测到目的蛋白hSPRY2的表达,转染pDC315/hSPRY2组HEK293T细胞的增殖率及存活率均明显高于对照组即转染pDC315/EGFP组(P<0.05)。结论成功构建了hSPRY2重组表达载体,过表达hSPRY2可促进HEK293T细胞的增殖与存活。

猪瘟病毒E2-GM-CSF融合蛋白在HEK293T细胞中的表达和免疫原性分析

【目的】设计构建分泌表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞,并评估表达的E2-GM-CSF融合蛋白的免疫原性,为猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的防控提供新的候选亚单位疫苗。【方法】利用PCR方法扩增E2-GM-CSF基因并克隆入慢病毒表达载体pCDH,将得到的重组慢病毒质粒pCDH-E2-GM-CSF包装成E2-GM-CSF慢病毒颗粒,转导HEK293T细胞,经嘌呤霉素加压筛选获得分泌表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞,纯化表达的E2-GM-CSF融合蛋白经小鼠免疫试验验证其免疫原性。【结果】pCDH-E2-GM-CSF质粒经酶切鉴定,得到大小分别为8172 bp的载体片段和1521 bp的E2-GM-CSF基因片段,表明E2-GM-CSF基因成功克隆入pCDH载体;细胞基因组DNA PCR扩增结果为一条大小为1686 bp的条带,表明E2-GM-CSF基因成功整合至HEK293T细胞基因组;Western blotting分析获得约70 ku的条带,证明E2-GM-CSF融合蛋白在HEK293T细胞中成功分泌表达;SDS-PAGE验证显示,纯化后的E2-GM-CSF融合蛋白为单一条带,纯度较高,大小约70 ku;小鼠免疫血清ELISA检测结果表明,表达的E2-GM-CSF融合蛋白具有良好的免疫原性,免疫后第14天在小鼠血清中检测到效价为1∶300的E2特异性抗体,免疫后第21天E2特异性抗体效价达1∶900,免疫后第28天小鼠血清中的E2特异性抗体效价最高达到1∶8100,远高于E2蛋白的1∶1800。【结论】利用慢病毒载体构建的表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞可正确分泌表达具有免疫原性的E2-GM-CSF融合蛋白,为CSFV的防控提供了新的候选亚单位疫苗,同时其构建、开发与评估过程也可为其他亚单位疫苗在哺乳动物细胞中的快速表达提供借鉴。

质粒转染对HEK293和DDT1-MF2细胞天然β2-肾上腺素受体表达的影响

目的 :观察质粒转染对细胞天然 β2 肾上腺素受体 (β2 AR)表达量的影响。方法 :将不携带外源目的基因的 pREP4质粒和携带α1B AR或 β1 ARcDNA的 pREP4质粒 ,采用脂质体和磷酸钙沉淀法转染HEK2 93和DDT1 MF2细胞。结果 :相同质粒载体 ,无论有无外源目的基因 ,或目的基因是否相同 ,均可使HEK2 93细胞天然表达的β2 AR密度及其介导的cAMP蓄积效应增加。而用同样方法在DDT1 MF2细胞转染 pREP4质粒则对 β2 AR表达无影响。结论 :转染携带或不携带目的基因的质粒对HEK2 93细胞天然表达 β2 AR的密度及其介导的功能效应均有影响 ,且提示这种效应可能具有细胞特异性。

脑心肌炎病毒pCMV-HA-VP2表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的:构建脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis Virus,EMCV)衣壳蛋白VP2基因的真核表达载体pCMV-HA-VP2,并在HEK293细胞中表达.方法:提取EMCV的总RNA,RT-PCR扩增VP2基因,酶切后构建带HA标签的真核表达质粒pCMV-HA-VP2,运用脂质体介导法将其转染至HEK293细胞中,分别进行过表达检测、Westernblotting分析及IFA检测来验证VP2基因的转录及表达情况.结果:重组表达载体pCMV-HA-VP2构建成功,转染至HEK293细胞中,VP2蛋白和HA标签融合表达成功.结论:EMCV衣壳蛋白VP2基因的真核表达载体pCMV-HA-VP2在HEK293细胞中的成功表达,为EMCV衣壳蛋白的功能研究提供理想的实验材料,同时也为EMCV感染机制及其受体研究奠定基础.

重组人pEGFP-C2-NPHS2表达载体的构建及其在人胚胎肾293细胞中的表达

目的:构建人pEGFP-C2-NPHS2表达载体,并观察其在人胚胎肾(HEK)293细胞中的表达。方法:应用基因重组技术,构建增强绿色荧光蛋白与NPHS2的融合表达载体,经PCR、限制性内切酶酶切和测序鉴定,应用基因转染技术将其转入HEK293细胞中,荧光显微镜和免疫印迹检测NPHS2的表达产物podocin。结果:经鉴定目的基因NPHS2全长插入重组质粒,HEK293细胞不表达NPHS2基因,转染后可以检测到绿色荧光蛋白分布于细胞的膜周部,免疫印迹证实为编码蛋白podocin。结论:成功构建重组人pEGFP-C2-NPHS2表达载体,有助于进一步研究podocin在足细胞疾病中的作用。

细胞色素P450 2C9*8与CYP2C9*27慢病毒表达载体的构建及在HEK239T细胞中的稳定表达

目的构建人细胞色素P450 2C9(CYP2C9)及突变体CYP2C9*8与CYP2C9*27的慢病毒表达质粒,并于HEK293T细胞中稳定表达。方法反转录人肝总RNA获得c DNA,PCR扩增获得CYP2C9编码序列,并克隆至载体MigR1上,获得慢病毒表达重组质粒MigR1-CYP2C9。以该质粒为模板,重叠PCR方法分别引入449G>A与449G>T点突变,并分别克隆至MigR1,获得MigR1-CYP2C9*8与MigR1-CYP2C9*27慢病毒表达质粒。在HEK 293T细胞中进行病毒包装,并采用获得的慢病毒感染HEK293细胞,经流式分选和单克隆挑取获得稳定表达CYP2C9、CYP2C9*8与CYP2C9*27的细胞,命名为293T-2C9、293T-2C9*8与293T-2C9*27。实时定量PCR(qRT-PCR)与Western blot检测胞内CYP2C9表达。采用CYP2C9的特异性底物双氯芬酸对CYP2C9的活性进行评价。结果成功构建MigR1-CYP2C9、MigR1-CYP2C9*8与MigR1-CYP2C9*27表达载体。采用构建病毒感染获得的单克隆细胞293T-2C9、293T-2C9*8与293T-2C9*27在30代后荧光显微镜下观察可见绿色荧光表达率在100%,qRT-PCR与Western blot均表明有目标分子表达。提取自这三株细胞的微粒体均可催化双氯芬酸代谢为4-羟基双氯芬酸。结论成功构建稳定表达CYP2C9、CYP2C9*8与CYP2C9*27人源化细胞模型,该方法构建的细胞可用于CYP2C9*8与*27两个突变体的功能研究。

人2型大麻素受体过表达诱导宫颈癌Caski细胞凋亡

目的构建人2型大麻素受体(h CB2R)基因真核表达载体,探讨h CB2R在细胞中的表达、定位以及h CB2R对宫颈癌Caski细胞的生长的影响及机制。方法构建GV230-h CB2R质粒,经双酶切、测序鉴定后,转染HEK293细胞和Caski细胞,Western blot法及免疫荧光细胞化学染色联合激光扫描共聚焦显微镜技术检测CB2R表达及细胞定位;流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot法及实时荧光定量PCR检测h CB2R、Bcl-2、Bax、Bad的表达。结果双酶切获得1128 bp的目的片段,测序结果与h CB2R基因注册序列(NM_001841.2)的同源性为99%;转染HEK293细胞后,可表达相对分子质量(Mr)40 000的h CB2R蛋白,HEK293细胞膜和细胞质中均有CB2R表达;过表达的CB2R,可上调Bax、Bad的表达,抑制Bcl-2的表达,促进宫颈癌Caski细胞凋亡。结论上调Caski细胞h CB2R表达可增强Bax、Bad表达,抑制Bcl-2表达,诱导细胞凋亡。

人P2X7真核表达载体的构建及稳定转染细胞株的建立

目的:构建人P2X7基因的真核表达载体,并通过转染获得稳定表达P2X7分子的HEK293细胞株。方法:以人脑组织P2X7c DNA为模板扩增出P2X7基因,插入到真核表达载体p EGFP-N1中,构建重组质粒p EGFPN1/P2X7。用X-fect试剂盒将重组质粒转染HEK293细胞,通过G418辅助荧光筛选建立稳定表达P2X7-EGFP细胞株。经流式细胞仪、Western blot和激光共聚焦显微镜检测,了解人P2X7在HEK293细胞中的表达水平及细胞内定位。结果:重组质粒p EGFP-N1/P2X7构建正确,建立了稳定表达人P2X7的HEK293细胞系。Western blot和流式细胞仪检测证实,P2X7在HEK293细胞系中成功表达,激光共聚焦显微镜检测显示P2X7-EGFP定位在细胞膜上。结论:重组载体p EGFP-N1/P2X7构建成功并建立了稳定表达人P2X7的HEK293细胞系,为进一步研究P2X7离子通道结构和功能奠定基础。

SIRT2稳定敲除细胞系的建立及对组蛋白修饰的影响

目的利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除SIRT2基因的HEK293细胞系,研究其对组蛋白不同位点的修饰情况。方法构建lentiCRISPR v2-sgRNA SIRT2敲除质粒,通过慢病毒包装,感染HEK293细胞,嘌呤霉素筛选出阳性克隆。对筛选的细胞株进行T7E1验证,来验证所设计的sgRNA的有效性。应用蛋白质免疫印迹检测SIRT2蛋白水平,筛选得到SIRT2稳定敲除细胞系。使用蛋白质免疫印迹的方法在蛋白水平验证SIRT2对组蛋白乙酰化、甲基化的影响。结果通过测序证明lentiCRISPR v2-sgRNA SIRT2敲除质粒正确,T7E1验证了所构建的质粒具有良好的CRISPR/Cas9活性,使基因组碱基发生突变。蛋白质免疫印迹证明SIRT2敲除细胞系中SIRT2表达显著降低。在CRISPR/Cas9系统敲除SIRT2的HEK293细胞中,组蛋白H4乙酰化在赖氨酸第16位(H4K16ac)表达显著升高,组蛋白H4乙酰化在赖氨酸第5位(H4K5ac)表达下降,组蛋白H3二甲基化在赖氨酸第79位(H3K79me2)表达升高。结论获得SIRT2稳定敲除细胞系,便于后续SIRT2对组蛋白修饰功能的研究。

高氧胁迫下Peroxiredoxin2蛋白的细胞保护作用的研究

衰老和凋亡是细胞的两个重要生理过程,一直以来都是细胞生物学领域研究的热点。Peroxiredoxin 2(Prdx2)蛋白是过氧化物酶的其中一个亚型,分布于细胞质中。为了研究它在高氧条件诱导的细胞衰老及凋亡中的保护作用,我们分别将大鼠来源的Prdx2基因转染进人间充质干细胞(Human mesenchymal stem cells,hMSCs)和HEK293T细胞中,并建立了稳定表达Prdx2蛋白的HEK293T细胞系,利用SA-β-gal染色(Senescence-Associated β-Galactosidase Assay)、TUNEL染色及磷酸化p53蛋白的免疫印迹来检测高氧处理后细胞的衰老和凋亡情况。实验结果表明,高氧处理细胞后,转染了Prdx2的hMSCs和HEK293T细胞其衰老和凋亡率与对照组相比都有较为明显的减少,暗示Prdx2蛋白在细胞抵抗氧化损伤中发挥了重要作用。

ABCC2基因过表达细胞株的建立及鉴定

目的构建携带ABCC2基因的慢病毒载体,转染HEK293细胞,筛选出稳定过表达ABCC2基因的细胞株并进行鉴定,为体外实验确定与多药耐药相关蛋白2(MRP2)外排转运相关的底物药物及其转运机制提供细胞模型。方法根据Gen Bank提供的ABCC2基因c DNA序列设计引物,PCR扩增该基因并将其连接至慢病毒载体PZE-LV105,包装病毒并感染HEK293细胞。用嘌呤霉素进行筛选得到过表达ABCC2基因的稳转细胞株,通过基因测序、实时荧光定量PCR(RTQ-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)对稳转细胞进行鉴定。结果测序结果证明重组慢病毒过表达载体所携带的ABCC2基因序列与GenBank提供的ABCC2序列一致;RTQ-PCR分析结果显示转染了ABCC2基因的HEK293细胞中MRP2的mRNA相对表达比正常HEK293细胞和空白载体对照HEK293细胞高出约320倍;蛋白免疫印迹试验显示,转染了ABCC2基因的HEK293细胞中MRP2蛋白表达水平比正常HEK293细胞和空白载体对照HEK293细胞高出约150倍。结论该实验成功构建了稳定过表达ABCC2基因的细胞株,该细胞株可用于初步筛选确定MRP2的特异性外排转运底物及其转运机制。

大鼠嘌呤能受体P2X_4稳定表达细胞系的建立及功能的验证

目的建立大鼠嘌呤能受体P2X4(rP2X4)稳定表达细胞系,并对细胞系功能进行验证。方法构建绿色荧光蛋白rP2X4受体(pEGFP-N1-rP2X4)重组质粒,采用脂质体转染法将pEGFP-N1-rP2X4转染于人胚肾(HEK293)细胞,采用抗生素G418(1 g·L-1)压力筛选,qRT-PCR和Western蛋白质印迹法验证rP2X4受体的表达量。全细胞膜片钳技术检测稳定表达的rP2X4受体Ca2+电流。结果测序结果表明,pEGFP-N1-rP2X4重组质粒序列完全正确;采用脂质体法稳定转染HEK293细胞后,qRT-PCR和Western蛋白质印迹法结果表明,HEK293-pEGFP-N1-rP2X4稳定转染细胞系在连续传代25代后(1,3,5,10,15,20和25代)rP2X4受体均保持稳定表达;全细胞电流记录实验表明,嘌呤受体激动剂ATP 3.0μmol·L-1能激活HEK293-pEGFP-N1-rP2X4细胞上表达的rP2X4受体并产生特异性激活电流,且该电流能被非选择性P2X4受体拮抗剂三硝基苯酚(TNP)-ATP(30.0μmol·L-1)阻断。结论 HEK293-pEGFP-N1-rP2X4稳定转染细胞系上rP2X4受体表达稳定,激活后能产生特异性激活电流。该细胞系可用于rP2X4受体的药物筛选及其机制研究。

RHBDF2-shRNA慢病毒载体的构建和Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系的建立

目的:构建RHBDF2-shRNA慢病毒载体,建立Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系,并检测稳转细胞株中RHBDF2 mRNA和蛋白表达水平。方法:根据NCBI提供的RHBDF2基因序列,设计并合成针对RHBDF2基因干扰靶点的shRNA-oligo,退火后将其连接到经Eco RⅠ和AgeⅠ酶切的慢病毒载体FV067-RNAi-EGFP-Puro中,构建FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒质粒,通过PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。使用HEK 293T细胞和Neuro-2a细胞作为实验材料,FV067 Vector作为对照组,FV067-RHBDF2-shRNA作为实验组。通过Lipofectamine 2000将FV067 Vector和FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒质粒分别与慢病毒辅助质粒psPAX2和pMD2G共转染至HEK 293T细胞中,转染48 h收集并纯化慢病毒,分别将对照组FV067 Vector和实验组FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒在感染复数(MOI)为50时感染Neuro-2a细胞,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白的表达,采用2 mg·L^-1嘌呤霉素筛选出RHBDF2基因稳定沉默的细胞系。实时荧光定量PCR法检测2组细胞中RHBDF2 mRNA表达水平,免疫印迹法检测2组细胞中RHBDF2蛋白表达水平。结果:PCR和测序,RHBDF2-shRNA慢病毒载体中的干扰序列与设计合成的RHBDF2-shRNA-oligo序列完全一致。FV067 Vector慢病毒的滴度为5×10^8 TU·mL^-1,FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒的滴度为3×10^8 TU·mL^-1。实时荧光定量PCR检测,实验组稳转细胞株中RHBDF2 mRNA表达水平比对照组降低了52.26%(t=11.44,P=0.0076)。免疫印迹法检测,与对照组比较,实验组RHBDF2-shRNA稳转细胞系中RHBDF2蛋白表达水平降低了47%(t=6.374,P=0.0078)。结论:成功构建了FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒载体并建立了Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系,且Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系中RHBDF2 mRNA和蛋白表达水平明显降低。