余庆花椒精油挥发性成分分析及其对红白血病HEL细胞分化和凋亡的影响

目的研究余庆花椒精油(Yuqing Zanthoxylum bungeanum essential oil,YZBO)的挥发性成分及YZBO对红白血病HEL细胞分化和凋亡的影响。方法采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)分析YZBO的挥发性成分,并以不同质量浓度YZBO处理HEL细胞24 h后,采用MTT和台酚蓝计数分析细胞存活,流式细胞仪检测HEL细胞CD71、CD235a、CD41的分化情况,流式细胞仪和Hoechst33258染色法检测HEL细胞凋亡情况。结果YZBO含有99种化学成分,包括28种醇类物质、7种酯类物质、1种醛类物质、6种酸类物质、4种酮类物质、37种烯烃类、7种烷烃类物质、2种炔烃类物质、2种酚类物质和5种其他物质。橙花叔醇、榄香醇和τ-杜松醇是主要的醇类物质,乙酸苯乙酯和异乔木萜醇乙酸酯是其主要酯类物质。YZBO对HEL细胞的半抑制浓度(median inhibitory concentration,IC_(50))值为2.94386μg/mL,可促进CD71(45.6%)和CD235a(38.8%)的分化,而对CD41的分化不明显,可诱导HEL细胞程序性凋亡,凋亡数目呈剂量和时间依赖性,镜下和染色观察发现细胞体积变小,核固缩以及呈高亮蓝色等典型细胞凋亡形态学改变。结论YZBO的主要挥发性成分是烷烃类、醇类、烯烃类化合物,YZBO具有抗红白血病HEL细胞的生物活性,可促进分化未成熟的HEL细胞向成熟细胞方向分化,抑制向巨核细胞方向分化,并诱导其凋亡。

血小板生成素是人红白血病HEL细胞自分泌因子的证据

为了研究人红白血病HEL细胞有自分泌血小板生成素(Tpo)的能力,采用细胞原位杂交检测mRNA,采用免疫荧光方法、生物素亲和素系统检测蛋白质,采用细胞传感器检测细胞电化学行为。结果表明:Mpl是细胞膜受体;HEL细胞内存在Tpo蛋白质;在培养基中加入rhTpo后HEL细胞增殖;可溶性受体融合蛋白可以阻断HEL细胞增殖,阻断后HEL细胞的电子传递数减少,但细胞数高于接种细胞数。实验结论提示Tpo可能是HEL细胞的自分泌因子。

HCMV感染对HEL细胞HOXB2,HOXB3,HOXB4及HOX8基因表达的影响

目的 :研究人胚肺 (HEL)细胞HOXB2 ,HOXB3,HOXB4及HOXB8基因的表达状态及人类巨细胞病毒(HCMV)感染对HEL细胞HOXB2 ,HOXB3,HOXB4及HOXB8基因表达的影响。方法 :采用半定量逆转录 -聚合酶链反应 (RT -PCR)技术。结果 :HEL细胞表达HOXB2 ,HOXB3,HOXB4及HOXB8;HOXB2基因于HCMV感染后 15h表达增加 ,4 8h达高峰 ,随后回落 ,至 12 0h再达高峰。HEL细胞HOXB3和HOXB4基因的表达在HCMV感染后不同时间无明显变化。HOXB8基因于HCMV感染后 15～ 4 8h表达轻微下调 ,72h回升 ,96h表达增加 ,12 0h达高峰 ;ATRA能轻微上调HCMV感染晚期HEL细胞HOXB8基因的表达 ,但对HCMV感染后HOXB2和HOXB4基因的表达无明显调节作用。结论 :HCMV能诱导HOXB2及HOXB8基因表达异常 ,这可能在先天性HCMV感染导致胚胎发育畸形中起重要作用。

高三尖杉酯碱联合AG490对HEL细胞JAK2-STAT5相关信号通路的影响

本研究旨在探讨高三尖杉酯碱(homoharringtonine,HHT)联合AG490对HEL细胞JAK2-STAT5信号通路的影响及其机制,为临床应用新方案治疗慢性骨髓增殖性肿瘤(MPN)提供理论依据。以20 ng/ml的HHT,100μmol/L AG490,20 ng/ml HHT+100μmol/L AG490处理HEL细胞24、48、72小时以后,用MTT法和流式细胞术检测细胞生长抑制率和凋亡率,药物处理细胞24小时后用WB法检测JAK2突变激活的信号蛋白P-JAK2,P-STAT5以及BCL-xL表达的变化。结果表明,HHT以及AG490作用HEL 24小时均能抑制其增长,Annexin V-PI双染流式细胞图显示均能明显诱导HEL早期凋亡,HHT更为明显;免疫电泳分析显示,P-JAK2和P-STAT5表达下调,而JAK2和STAT5总蛋白水平稳定。结论:HHT联合AG490能明显抑制HEL细胞增殖并诱导凋亡,两者具有协同作用,其作用机制是HHT作为一种广谱的蛋白酪氨酸激酶抑制剂,协同AG490抑制JAK2突变引起的信号蛋白的酪氨酸位点的磷酸化,从而下调STAT5反应性基因的转录。

COX-2抑制剂对人红白血病HEL细胞增殖、凋亡及迁移的影响

目的 :探讨环氧化酶(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制剂塞来昔布对人红白血病HEL细胞增殖、凋亡及迁移的影响及其作用机制。方法:不同浓度的塞来昔布处理HEL细胞,CCK-8法检测细胞增殖抑制率;Hoechst33342荧光染色检测细胞凋亡;Transwell小室检测细胞迁移率;RT-PCR检测COX-2及JAK2 mRNA水平;Western blot检测COX-2及p-JAK2蛋白表达。结果:塞来昔布能够时间和剂量依赖性抑制HEL细胞增殖,不同浓度(25、75、125μmol/L)的塞来昔布在48 h时对细胞生长抑制率分别为(9.96±0.82)%、(18.46±2.01)%、(21.36±2.48)%(P<0.05);Hoechst33342凋亡细胞染色显示125μmol/L塞来昔布处理HEL细胞后,凋亡细胞明显增多;细胞迁移实验结果显示75μmol/L塞来昔布处理细胞24 h后漏出细胞为(22.13±7.51)个,明显低于对照组(77.89±6.94)个,P<0.05;RT-PCR结果显示不同浓度塞来昔布处理HEL细胞48 h后COX-2 mRNA呈剂量依赖性减低,而对JAK2 m RNA无明显影响;Western blot结果显示塞来昔布处理HEL细胞COX-2蛋白表达明显减低(P<0.05),而对p-JAK2无明显影响。结论:塞来昔布能够抑制HEL细胞增殖,可能与抑制COX-2表达有关,而对JAK2信号通路无明显影响。

重组人血小板生成素对人红白血病HEL细胞增殖的影响

为了进一步阐明血小板生成素(thrombopoietin,Tpo)的生物学作用,我们研究了rhTpo(recombinant human Tpo)对人红白血病(human erythroleukemia,HEL)细胞增殖的影响。采用血浆凝块集落培养法和5-溴-2’-脱氧尿核苷(5-BrdU)掺入HEL细胞DNA-ELISA法。培养基中加入rhTpo,HEL细胞集落数量和吸光度值明显高于未加rhTPo对照组。当rhTPo浓度为10,50,100,200ng/ml时,实验组集落数分别是对照组集落数的1.5,2.07,2.34,2.46倍;实验组A值分别是对照组A值的1.28,1.84,2.25,2.31倍。研究结果表明,rhTpo促进HEL细胞增殖和DNA合成。

吉非替尼和拉帕替尼对HEL细胞增殖的抑制作用

本研究探讨两种分子靶向治疗药物酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼和拉帕替尼对JAK2 V617F阳性的骨髓增殖性疾病(MPD)的潜在治疗作用。吉非替尼(0.5、1、5、10、25μmol/L)和拉帕替尼(0.5、1、2、4、8、16μmol/L)分别作用于携带JAK2 V617F突变的人红白血病细胞株(HEL细胞系)。用MTT法检测2种药物对HEL细胞增殖的影响,流式细胞术检测其对细胞凋亡和细胞周期的影响。结果表明,吉非替尼可明显抑制HEL细胞的增殖,呈浓度依赖性(24和48 h的相关系数为0.991和0.895),48 h的IC50为5.4μmol/L。拉帕替尼作用48 h抑制细胞增殖的IC50为19.6μmol/L。吉非替尼对HEL细胞有显著的诱导凋亡作用,呈浓度依赖性(相关系数为0.896),随药物浓度的增加,凋亡细胞比例的增加。此外,吉非替尼明显地影响细胞周期,将细胞周期阻滞于G0/G1期。结论:吉非替尼和拉帕替尼对HEL细胞有显著的抑制增殖作用,可进一步用于JAK2 V617F阳性的MPD靶向治疗的研究。

siRNA特异性抑制HEL细胞evi1基因的实验研究

本研究探讨小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默人红白细胞白血病细胞(HEL)的evi1基因后对细胞evi1基因表达的抑制作用及细胞生物学特征变化及其作用机制。体外合成3条evi1基因特异性的siRNA(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)并转染HEL细胞,并设对照。用四甲基偶氮唑蓝法评价细胞增殖抑制情况,半定量逆转录聚合酶链反应(semiquantitative RT-PCR)检测evi1基因mRNA的表达,台盼蓝染色试验测定细胞活性的变化,流式细胞术检测细胞周期变化和凋亡率。结果显示,细胞转染24、48、72小时后,以siRNA-1作用最强,转染后48小时抑制作用最明显。siRNA浓度为120nmol/L时,抑制率达到最大。转染48小时后siRNA-1对HEL细胞的增殖抑制率为(72.22±2.80)%,evi1-mRNA相对表达率为(27.31±1.11)%,HEL细胞活率为(26.05±2.49)%,与其他各组相比有显著性差异(p<0.001)。siRNA可使细胞周期阻滞在G0/G1期,S期细胞明显减少,凋亡率明显增高(p<0.01)。结论:evi1基因特异性siRNA可抑制HEL细胞增殖,使evi1-mRNA表达水平降低,细胞活性下降,HEL细胞周期阻滞在G0/G1期,抑制细胞的有丝分裂,促进细胞凋亡。

人巨细胞病毒蛋白IE1及pp65在HEL细胞中表达的时空特性

目的 研究HCMV感染HEL细胞后，病毒蛋白IE1及pp65在不同时间点的亚细胞分布及其表达量-时效变化相关性。方法 HCMV感染HEL细胞后，吸附2h，维持培养0、2、4、6、10、22及46h后，用病毒蛋白IE1的单克隆抗体及蛋白pp65的单克隆抗体做免疫细胞化学染色，检测此两种蛋白的胞内分布；同时运用图像分析系统对此检测结果进行灰度值测定，并利用方差分析分析此测定结果。结果 IE1蛋白仅在核内检测到；表达趋势是：4～6hp．i．呈表达上升趋势，6～8hp．i．又下降。pp65首先于仅在核内被检测到，之后也分布于胞浆中。pp65表达于2～8hp．i．表达增多，8～24hp．i．呈胞内稳定表达，24-48hp．i．表达降低。结论 IE1蛋白及pp65表达的亚细胞分布具有时空特异性；两种蛋白的表达量上都表现为量-时效相关性；本研究间接反映了病毒复制增殖的连续过程。

青黛提取物对HEL细胞增殖、凋亡和分化的影响

目的研究青黛有效成分在体外对HEL细胞的增殖、凋亡和分化作用。方法应用MTT法检测青黛有效成分对HEL细胞的增殖抑制效应;流式细胞术检测CD14和CD11B,观察HEL细胞单核系分化趋势;流式细胞术AnnexinV-FITC/PI双标记法检测青黛有效成分对HEL细胞的早期凋亡诱导作用。结果与阴性对照组相比25,50,75和100μg/mL青黛有效成分作用下HEL细胞均出现单核系分化趋势,其中100μg/mL的分化趋势最明显;MTT结果显示25,50,75及100μg/mL药物对HEL细胞的生长抑制率分别为16.01%,39.12%,50.06%和59.28%;青黛有效成分可诱导HEL细胞凋亡:25,50,75及100μg/mL药物对HEL的早期凋亡率分别是5.60%,13.7%,17.8%和18.4%,明显高于对照细胞的自发凋亡率(2.70%)(P<0.05)。结论青黛有效成分对体外培养的HEL细胞具有显著抑制增殖作用,且可诱导细胞早期凋亡和单核系分化。

PTA1在人巨核母细胞系HEL细胞和血小板的表达及分布

应用抗人血小板和Ｔ细胞活化抗原１（ＰＴＡ１）单克隆抗体（ｍＡｂ）间接免疫荧光染色和流式细胞仪（ＦＣＭ）分析，以及胶体金免疫电镜技术，检测了人巨核母细胞系ＨＥＬ细胞和血小板膜表面ＰＴＡ１分子的表达水平，并对静止与活化血小板膜表面ＰＴＡ１分子的表达和分布进行了比较。结果表明，ＨＥＬ细胞与人血小板膜表面均表达高水平ＰＴＡ１分子，活化血小板膜表面ＰＴＡ１分子表达水平有所降低，但胞膜内陷所形成的胞浆空泡膜内侧可见密度较高的ＰＴＡ１分子。

HCMV感染对HEL细胞MCM装载因子Cdt1的影响

目的研究人类巨细胞病毒(HCMV)感染对人胚肺成纤维(HEL)细胞的MCM装载因子Cdt1表达的影响,从分子水平上探讨HCMV的发病机制。方法用血清饥饿法同步化HEL细胞于G0/G1期,用HCMV感染同步化的HEL细胞作为感染组,同时设模拟感染组为对照组。于感染后12、24、48、72和96h收获细胞,用免疫细胞化学法检测两组细胞核内HCMVCdt1蛋白。结果 12、24、和96h两组HEL细胞Cdt1蛋白水平均差异有显著性(P<0.05),而48、72h两组HEL细胞Cdt1蛋白水平无明显差异(P>0.05)。12和96h感染组较模拟感染组明显降低,24h感染组较模拟感染组明显升高。模拟感染组在感染后12h时Cdt1蛋白表达水平最高,然后逐渐下降,至24h时达最低水平,96h又稍有回升;感染组在感染后12hCdt1蛋白表达水平较低,24h达到最高峰,48h时急剧下降,一直维持较低的稳定水平。结论 HCMV诱导Cdt1蛋白表达延迟,从而影响了MCM复合物的装载和pre-RC的形成,使细胞停滞在G1期,阻止DNA的复制。

直接接触骨髓基质HS-5细胞可降低HEL细胞对药物的敏感性

本研究探讨与骨髓基质HS-5细胞直接接触对HEL白血病细胞耐药性的诱发作用及其机制。采用人急性红白血病HEL细胞株与HS-5细胞共培养模式模拟体内白血病细胞及其周围的造血微环境,应用CCK-8法检测HEL细胞对Ara-C,DNR,VP16,MTX等化疗药物的敏感性,流式细胞术检测HEL细胞周期时相分布,实时RT-PCR方法检测p19、p21、p27、MDR1、ABCG2、Bcl-2等基因的mRNA表达,Western blot方法检测p-AktSer473、p-GSK3βSer9、p-STAT3Tyr705、Bcl-2、cleaved-Notch1V1754及Hes1等蛋白表达。结果表明,与HS-5细胞共培养后的HEL细胞对4种化疗药物的敏感性均显著降低。在共培养24 h时,HEL细胞阻滞于G0/G1期,G0/G1期的细胞比例明显增多。PCR结果显示,p21基因的转录水平随着共培养时间的延长逐渐上调;p19基因的mRNA水平在12 h时明显下调,随后又恢复;其它基因的改变均无统计学意义。Western blot结果表明,共培养后HEL细胞的p-AktSer473、p-GSK3βSer9、cleaved-Notch1V1754蛋白及Bcl-2蛋白表达上调,Hes1蛋白表达下调,p-STAT3Tyr705表达无明显变化。结论:直接接触骨髓基质HS-5细胞可增强HEL细胞对化疗药物的抵抗作用。

人巨细胞病毒感染对HEL细胞周期及Cdt1表达的影响

目的研究人巨细胞病毒(HCMV)感染对人胚肺成纤维(HEL)细胞周期及复制允许因子Cdt1表达的影响,探讨HCMV感染可能的发病机制。方法用血清饥饿法同步化HEL细胞于G0/G1期,用HCMV感染同步化的HEL细胞作为感染组(n=106),同时设模拟感染组为对照组(n=106)。于感染后12,24,48,72,96h收获细胞。流式细胞术测细胞周期;RT-PCR法检测Cdt1 mRNA的表达水平。结果①模拟感染组在感染后12h,24h时处于G1期细胞比感染组明显增多,两组比较,差异有显著性(P(0.01)。②两组Cdt1 mRNA表达水平在12h,24h和48h时差异均有显著性(P(0.05)。模拟感染组Cdt1 mRNA表达水平的高峰出现在感染后12h,而感染组的高峰则出现在感染后48h。结论①HCMV感染影响了HEL细胞周期,使大部分细胞停滞在G1期。②HCMV感染使HEL细胞复制允许因子Cdt1 mRNA的表达水平迟滞。③HCMV感染可能通过影响复制允许因子Cdt1的生成而干扰宿主细胞周期,影响宿主细胞DNA合成,导致器官功能障碍。

BrdU标记的人巨细胞病毒感染HEL细胞的方法学研究

目的以标记在人巨细胞病毒(HCMV)DNA上的BrdU为示踪剂,研究病毒在受染HEL细胞中的移动过程;同时结合病毒蛋白pp65的表达探讨病毒复制、增殖的过程。方法以BrdU标记的HCMV(MOI=4)感染HEL细胞,分别选取感染后2h、4h、6h、24h及48h 5个时间点的细胞,用抗BrdU单克隆抗体,研究病毒核酸的胞内定位;同时用抗HCMV蛋白pp65的单克隆抗体检测此蛋白的表达及分布。结果免疫细胞荧光染色结果提示:在感染5个时间点,病毒DNA依次位于胞质、胞核及同时位于胞核和胞质;蛋白pp65的表达及分布规律为:胞内无表达、胞核分布、胞核与胞质同时分布及巨细胞和融合细胞内分布。结论以BrdU为标记物标记双链DNA病毒核酸不仅为研究HCMV．的胞内移动提供了良好的模型,同时也为其他病毒的研究提供了良好的工具;本实验结合HCMV蛋白pp65的表达和分布直观地反应了HCMV感染HEL细胞并在其中复制、增殖的过程。

HCMV感染对HEL细胞MCM装载因子Cdc6的影响

目的研究人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染对人胚肺成纤维(human embryonic lungfibroblastic,HEL)细胞的MCM装载因子Cdc6表达的影响,从分子水平上探讨HCMV的发病机制。方法用血清饥饿法同步化HEL细胞于G0/G1期,用HCMV感染同步化的HEL细胞作为感染组,同时设模拟感染组为对照组。于感染后12、24、48、72和96 h收获细胞,提取总的RNA,采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测Cdc6 mRNA的表达水平。结果12、24、48、72和96 h两组HEL细胞Cdc6 mRNA表达水平均有显著性差异(P<0.05),12、24和48 h时感染组较模拟感染组明显增加,72h和96h时模拟感染组较感染组明显升高。感染组在感染后12 h时Cdc6 mRNA表达水平最高,后逐渐下降,至72 h时达最低水平,96 h时又稍有回升;模拟感染组在感染12 h时Cdc6 mRNA表达水平最高,后逐渐下降,至48 h时达最低水平,72 h时后开始回升,96 h时继续回升。结论HCMV诱导Cdc6 mRNA过度表达,导致Cdc6的积聚,最终将影响细胞周期的进程。

血小板生成素促进HEL细胞增殖及其c-Mpl的表达

目的 研究血小板生成素 (thrombopoietin ,TPO)对巨核细胞系 HEL细胞的增殖及其c Mpl受体表达的影响。方法 ①细胞集落计数法研究TPO对HEL细胞增殖的影响 ;②间接免疫荧光方法及流式细胞术检测TPO刺激后 ,HEL细胞TPO受体c Mpl的表达。 结果 ①TPO可促进HEL细胞集落的形成 ;②TPO上调HEL细胞c Mpl膜蛋白的表达。结论 TPO促进HEL细胞的增殖 ,其部分机制可能是通过上调TPO受体c Mpl的表达来实现。

岩藻黄质对人红白血病HEL细胞的凋亡作用及其机制

为探讨岩藻黄质对人红白血病HEL细胞株增殖抑制作用及其诱导凋亡机制,以岩藻黄质处理人红白血病细胞(HEL细胞),采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡率,分析细胞周期,测定细胞线粒体膜电位,并应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot法检测凋亡相关基因及蛋白表达的变化。结果表明,岩藻黄质呈剂量依赖性抑制HEL细胞增殖(P<0.01)。流式细胞术检测显示,岩藻黄质作用24 h后,HEL细胞早期和晚期凋亡的比率极显著增高(P<0.01),G0/G1细胞比例增多,S期和G2/M期细胞比例减少,线粒体膜电位降低;岩藻黄质通过上调促凋亡基因和下调抑凋亡基因的表达引起细胞的凋亡,Bcl-xL蛋白的表达变化不显著(P>0.05),Bcl-2蛋白的表达下调,Caspase-3和Bax蛋白的表达极显著上调(P<0.01)。由此可见,岩藻黄质能诱导HEL细胞凋亡,这为新型抗白血病功能食品的开发及白血病的治疗提供了理论依据。

雷帕霉素对人红白血病HEL细胞外泌体及PD-1/PD-L1的影响

目的探讨雷帕霉素(Rapa)对JAK2 V617F阳性HEL细胞外泌体中JAK2、ABCA3及免疫检查点PD-1/PD-L1的影响。方法体外培养人红白血病HEL细胞(JAK2 V617F阳性),分别加入浓度为10、50和100 nmol/L的Rapa,设立对照组。CCK-8检测细胞增殖抑制率,最终确定细胞增殖抑制率选用浓度为10及50 nmol/L的Rapa干预细胞。外泌体试剂盒提取外泌体,Western blot及流式细胞术鉴定外泌体,荧光定量PCR检测外泌体中JAK2、ABCA3和PD-1、PD-L1 mRNA变化,流式细胞术检测外泌体PD-1/PD-L1蛋白表达。结果外泌体试剂盒提取的外泌体均表达特征性的CD9、CD63、CD81蛋白,符合外泌体一般特征。HEL细胞外泌体中能够检测到JAK2 mRNA;Rapa能够减少HEL细胞外泌体产生,剂量依赖性降低外泌体中JAK2、ABCA3及PD-L1相对表达量,抑制外泌体PD-L1蛋白表达,对PD-1蛋白表达无明显影响。结论HEL细胞可能通过外泌体传递JAK2突变基因信号,Rapa能够减少外泌体产生,进而抑制外泌体传递JAK2突变信号,抑制PD-L1蛋白表达。

4种肾素-血管紧张素系统调节剂对人白血病HEL细胞增殖的影响

目的:探讨4种肾素-血管紧张素系统(RAS)调节剂氯沙坦、替米沙坦、阿利吉仑和血管紧张素-(1-7)(Ang-(1-7))对具有JAK2突变的人白血病HEL细胞增殖的影响。方法:用氯沙坦、替米沙坦、阿利吉仑和Ang-(1-7)分别处理HEL细胞12 d,用CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡的变化。结果:10^(-7) mol/L Ang-(1-7)可抑制HEL细胞增殖,将细胞阻滞在G_0/G_1期,诱导细胞晚期凋亡(P<0.001);10^(-5)mol/L氯沙坦及替米沙坦、10^(-4)mol/L阿利吉仑对HEL细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡均无明显影响(P>0.05)。结论:RAS抑制剂Ang-(1-7)能明显抑制HEL细胞增殖并促进其凋亡,有望成为治疗具有JAK2突变的真性红细胞增多症的潜在药物。