吉西他滨对人子宫颈癌HeLa细胞系的放射增敏作用

目的 探讨化疗药物吉西他滨对人子宫颈癌 (HeLa)细胞系的放射增敏作用。方法 MTT法确定细胞抑制率≤ 1 0 %的吉西他滨 (dFdC)浓度 (IC1 0 ) ,用该浓度吉西他滨分别孵育细胞 4、8、1 2及 2 4h ,于弃药前、弃药后立刻及弃药后 1 2h ,分别行 2、4及 6Gy60 Coγ线照射。计数细胞存活分数 ,计算增敏比。结果 吉西他滨IC1 0 浓度为 0 .0 1 μmol/L ,该浓度吉西他滨分别作用于细胞 4、8、1 2及 2 4h ,弃药后立刻照射 ,增敏比分别为 1 .1 9、1 .35、1 .72、1 .93。作用 2 4h ,弃药前、弃药后立刻及弃药后 1 2h照射 ,增敏分别为 1 .91、1 .93、1 .5 2。结论 吉西他滨对HeLa细胞具有放射增敏作用。增敏作用随药物作用时间的延长而增加 ,持续作用短时间 (4h)就可产生放射增敏作用 ,作用 2 4h效果显著。弃药前照射及弃药后立刻照射 ,增敏效果好于弃药后 1

维生素C对Hela细胞系增殖及细胞周期的影响

目的 探讨维生素C对Hela细胞系增殖及细胞周期的影响。方法 采用MTT测定 ,观察不同浓度维生素C( 1 μmol/L～ 35 0 0 μmol/L)对Hela细胞系增殖的抑制作用 ;运用流式细胞仪检测用药后细胞周期分布及增殖指数的变化。结果 各个浓度的维生素C对Hela细胞系增殖均有抑制作用 ,并呈剂量依赖性 ,35 0 0 μmol/L时 ,抑制率为 66.1 5 %。维生素C能使Hela细胞系阻滞于G0 /G1 期 ,抑制DNA的合成 ,使细胞增殖指数明显下降。且此作用随用药浓度的增加而增强。结论 维生素C在体外对Hela细胞系有明显的抑制作用 ,使细胞阻滞于G0 /G1 期。

诱导表达人活性型颗粒酶B的Hela细胞系的建立

目的 :构建人颗粒酶B基因的可诱导表达载体 ,并将其在Hela细胞中诱导表达 .方法 :用PCR法获取人活性型颗粒酶B基因序列 ,克隆入pIND诱导表达载体中。将其与辅助质粒pVgRXR通过脂质体法共转染Hela细胞后 ,用G4 18和zeocin筛选建系。通过免疫细胞化学染色法 ,确定蜕皮激素A最佳的诱导浓度及诱导时间 ,并通过MTT比色法检测及细胞骨架染色等方法观察 ,表达的活性型颗粒酶B对Hela细胞形态和生长的影响。结果 :获得可诱导表达人活性型颗粒酶B基因的Hela细胞系。免疫细胞化学染色表明 ,30 μmol/L蜕皮激素诱导 5d时目的蛋白表达最强 ,同时观察到Hela细胞的形态发生变化 ,出现多核大细胞及固缩小细胞 ,并且细胞生长受到抑制。骨架分析进一步显示 ,多核大细胞的骨架发生异常。结论 :活性型颗粒酶B的可诱导表达系统的建立 。

稳定表达Cas9蛋白的HeLa细胞系的建立

为建立基于CRISPR-Cas9技术的基因敲除细胞文库,本研究利用慢病毒载体pMD2.G、pSPAX2(HIV-1的gag-pol表达质粒)和lentiCRISPR v2-Hyg包装慢病毒,感染HeLa细胞2 d后用400μg/mL潮霉素培养液筛选两周,获得稳定表达Cas9蛋白的多克隆细胞系。利用流式细胞分选系统分选及western blot鉴定获得9株HeLa-Cas9单克隆细胞系。为获得具有高效率敲除内源基因的HeLa细胞系,利用同时表达绿色荧光蛋白(GFP)和GFP sgRNA的慢病毒感染HeLa-Cas9单克隆细胞系,经1μg/mL嘌呤霉素培养液筛选一周,流式细胞术检测表达绿色荧光蛋白细胞的百分比,以计算HeLa细胞株的敲除效率,进而建立了一株稳定表达Cas9蛋白的具有高敲除效率的HeLa单克隆细胞系。该细胞的Cas9敲除效率为87%,CCK-8检测结果表明其具有很好的细胞活性。本研究获得的具有高敲除效率的稳定表达Cas9蛋白的HeLa细胞系可以用于CRISPR敲除文库的转导,建立基因敲除细胞文库,为筛选参与特定功能的未知蛋白提供细胞平台。

胆固醇衍生物阳离子脂质体复合EGFP-IL-1Ra质粒体外转染HELA细胞系的研究

目的研究胆固醇衍生物阳离子脂质体复合EGFP-IL-1Ra质粒体外转染HELA细胞系的效率,为类风湿性关节炎治疗提供新的选择。方法制备新型胆固醇衍生物脂质体及EGFP-IL-1Ra质粒,两者结合转染HELA细胞系,通过体外凝胶阻滞试验检测阳离子脂质体与质粒DNA的最佳配比关系,MTT法检测脂质体细胞毒性,荧光免疫法检测HELA细胞的转染效率。结果实验中所用脂质体的IC50为650μg/mL,较对照组有更低的细胞毒性。脂质体/DNA质量比为50∶1作为最适比例,荧光显微镜观测脂质体结合EGFP-IL-1Ra质粒转染HELA荧光强度高于单纯EGFP-IL-1Ra质粒转染组。结论胆固醇衍生物阳离子脂质体复合EGFP-IL-1Ra质粒可高效的转染HELA细胞系,有望成为类风湿性关节炎治疗的新方法。

Lipofectamine2000降低HeLa细胞系中DNMT1的表达

DNA甲基化是一种非常重要的表观遗传修饰，在基因的表达调控、基因组的稳定性和发育过程中都发挥着重要的作用［1］。DNA甲基化的维持由DNA甲基化转移酶家族成员DNA甲基转移酶1（DNMT1）催化完成。DNA甲基化水平的改变，通常与DNMT1密切相关［3-4］。而Lipofectamine2000是一种常用的阳离子脂质体转染试剂，广泛地应用于特定基因的表达和敲低对细胞影响的研究。而阳离子脂质体对细胞有一定的毒性作用［5］。转染试剂Lipofectamine2000会影响细胞中DNMT1的表达，Lipofectamine2000对细胞的毒性作用可能是通过DNMT1实现的。因此本研究通对DNMT1在Lipofectamine2000处理Hela和395-9B-1（小鼠胚胎成纤维细胞）细胞不同时间后的表达情况进行检测，并探讨Lipofectamine2000对细胞的毒性作用。

紫铆因对宫颈癌细胞系Hela细胞的影响

目的研究紫铆因对宫颈癌细胞系Hela细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响,探讨其可能的作用机制。方法体外培养Hela细胞,MTT法检测20μM紫铆因作用Hela细胞不同时间(24、48和72h)和不同浓度(0、5、10、20、40和80μM)作用48h对Hela细胞活性的影响;流式细胞仪检测不同浓度紫铆因对Hela细胞凋亡和周期的影响;Western blot检测细胞周期蛋白cyclinB的表达。结果 20μM紫铆因分别作用Hela细胞24h细胞存活率为(73.25±9.48)%、48h为(56.20±4.60)%、72h为(32.98±6.75)%,Hela细胞的存活率随着作用时间的延长而下降(P均<0.05)。不同浓度的紫铆因作用于Hela细胞48h后,Hela细胞的存活率分别是(90.83±4.45)%、(68.97±3.53)%、(56.20±4.60)%、(38.48±5.17)%、(12.64±2.65)%,与对照组(0μM)比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。流式细胞仪检测结果示:各组的早期凋亡率(第二象限)、晚期凋亡率(第四象限)及总凋亡率均高于对照组(P均<0.05)。10、20和40μM紫铆因分别孵育Hela细胞48h后,各组的晚期凋亡率和总凋亡率分别是(28.00±2.52)%和(48.8±6.59)%、(38.77±2.30)%和(66.46±4.69)%、(56.80±2.56)%和(81.02±1.17)%,组间比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论紫铆因可以抑制Hela细胞的增殖,促进其凋亡,该作用可能与cyclinB参与的细胞周期调控相关。

溴化乙锭诱导无线粒体DNA宫颈癌HeLa细胞系的构建和鉴定

[目的]构建和鉴定由溴化乙锭(EB)诱导的无线粒体DNA(mtDNA)宫颈癌ρ~0HeLa细胞系,探讨mtDNA与宫颈癌发生的关系。[方法]采用含50ng/ml溴化乙锭、100μg/ml丙酮酸钠和50μg/ml尿嘧啶核苷的高糖DMEM完全培养基中传代培养HeLa细胞。低剂量EB连续诱导60d后,采用营养缺陷鉴定、PCR和WesternBlot鉴定无mtDNA的ρ~0HeLa细胞系;采用透射电子显微镜观察ρ~0HeLa细胞内线粒体形态变化;采用CCK8法测定ρ~0HeLa细胞增殖曲线。[结果]经溴化乙锭诱导60d,可以培养出具有尿嘧啶核苷依赖性的无mtDNA宫颈癌HeLa细胞系。普通PCR和qPCR结果均显示,低剂量EB诱导60d的ρ~0HeLa细胞中mtDNA完全缺失。WesternBlot结果显示,HeLa细胞中能表达核编码的NDUFA9蛋白,也能表达线粒体编码MT-ND1蛋白。而ρ~0HeLa细胞中已无MT-ND1蛋白表达,但核编码的NDUFA9蛋白能够正常表达。透射电子显微镜观察显示,ρ~0HeLa细胞内部分出现空泡改变,线粒体嵴被破坏。CCK8细胞增殖实验结果显示,ρ~0HeLa细胞系生长速度显著低于正常HeLa细胞系,且差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]无mtDNA的宫颈癌HeLa细胞系的建立,为后续研究mtDNA突变和线粒体功能在宫颈癌发生发展中的作用及机制奠定了基础。

反义PARP基因真核表达重组体的构建及其HeLa转化细胞系的建立

利用DNA体外重组技术将PARP基因cDNA部分序列反向克隆到真核表达载体pMAMneo上，构建成重组质粒pMAMneo－C1．4和pMAMneo－C0．3．将重组质粒pMAM－neo－C1．4转染HeLa细胞，经G418筛选，建成细胞系HeLa－C1．4－neo，Southern杂交结果表明，外源PARP基因cDNA部分序列已稳定整合到受体细胞基因组中，该细胞系的建立为研究聚ADP核糖基化作用在细胞内的功能打下了基础．

瓜蒌含药血清对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

目的研究瓜蒌水煎剂含药血清对宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制作用,探讨其抗癌作用机制。方法采用血清药理学方法制备瓜蒌含药血清,MTT法检测含药血清对HeLa细胞生长的抑制作用,Wright's-Giemsa染色和吖啶橙-EB染色在倒置显微镜和荧光显微镜下观察细胞的形态学变化;琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞DNA Ladder。结果 HeLa细胞经不同剂量的瓜蒌含药血清作用24,48 h后,细胞体外抑制作用明显,呈量效、时效关系;倒置显微镜观察可见HeLa细胞膜皱缩,细胞核固缩,核染色质边缘化,并出现凋亡小体;荧光显微镜下可见晚期的凋亡细胞被染成红色,细胞固缩成球状;琼脂糖凝胶电泳显示凋亡细胞发生了DNA断裂,呈梯状条带。结论瓜蒌含药血清对HeLa细胞具有明显的增殖抑制作用,其作用机制与诱导细胞凋亡相关。

鲍曼不动杆菌外膜蛋白A真核表达载体构建及其诱导Hela细胞不完全自噬

目的构建鲍曼不动杆菌ATCC19606(Acinetobacter baumannii ATCC 19606)外膜蛋白A(outer membrane protein A,OmpA)的真核表达载体pEGFP-OmpA,研究OmpA对Hela细胞自噬的影响。方法采用PCR方法扩增鲍曼不动杆菌ATCC19606的OmpA基因,将其克隆至真核表达载体pEGFP-N1,以构建重组质粒pEGFP-OmpA;用脂质体转染法将其转染Hela细胞;流式细胞术、细胞免疫荧光和Western blot检测OmpA表达水平;激光共聚焦显微镜检测OmpA在Hela细胞中的定位;Western blot及透射电子显微镜检测OmpA对Hela细胞自噬的影响。结果经双酶切及测序鉴定表明pEGFP-OmpA质粒构建成功;OmpA可以大量表达于Hela细胞的细胞质和细胞核中;OmpA可导致Hela细胞中自噬相关蛋白LC3BⅡ、p62和Beclin-1表达升高,而且在Hela细胞中发现自噬小体;OmpA会干扰p62降解,引发不完全自噬。结论本研究成功构建pEGFP-OmpA真核表达载体,它可以在Hela细胞中高效表达,并可导致Hela细胞不完全自噬,这为将来进一步研究鲍曼不动杆菌OmpA引起自噬的机制奠定基础。

紫杉醇脂质体对宫颈癌HeLa细胞作用的实验研究

目的探讨注射用紫杉醇脂质体对人宫颈癌细胞系的杀伤作用。方法以0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L浓度梯度的含注射用紫杉醇脂质体培养基作用于人宫颈癌细胞系HeLa细胞,并设对照(普通培养基,不含药物),通过MTT、显微镜观察细胞形态、流式细胞分析技术检测该药对细胞生长的影响;以Westernblot分析细胞外信号调节激酶(ERK)、磷酸化细胞外信号调节激酶(P-ERK)蛋白表达情况。结果经上述不同浓度紫杉醇脂质体作用48h后,细胞存活率下降;镜下观察显示部分细胞皱缩变形,崩解坏死,细胞脱壁悬浮;流式细胞结果显示细胞凋亡率逐渐增加,分别为(14.16±4.78)%、(43.68±16.21)%、(63.70±3.74)%、(63.51±2.29)%、(72.84±10.77)%和(74.69±7.52)%;细胞周期各时相中,S期比例减少;Westernblot显示HeLa细胞的P-ERK蛋白表达逐渐减弱(0.7645±0.0198、0.7592±0.0072、0.2655±0.0356、0.3232±0.0229、0.1467±0.0091)。结论紫杉醇脂体可抑制宫颈癌HeLa细胞的生长,对HeLa细胞的作用可能通过抑制MAPK信号转导通路达到抑制肿瘤的目的。

弯齿琵甲含药血清对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

目的探讨弯齿琵甲含药血清对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响及其抗肿瘤的作用机制。方法采用血清药理学方法制备不同浓度的弯齿琵甲含药血清,MTT法检测不同浓度含药血清对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响;显微镜下观察W right's-G iem sa染色和吖啶橙-EB染色后细胞的形态学变化;DNA琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞DNA断裂情况。结果宫颈癌HeLa细胞经不同剂量的弯齿琵甲含药血清分别作用24、48 h后,细胞增殖明显受到抑制,且呈时效、量效关系;倒置显微镜下观察可见细胞膜皱缩,细胞核固缩,核染色质边缘化,并出现凋亡小体;荧光显微镜下可见早期凋亡细胞呈黄绿色球状,晚期凋亡细胞呈红色球状;凋亡细胞经琼脂糖凝胶电泳可观察到DNA梯形条带。结论弯齿琵甲含药血清对宫颈癌HeLa细胞增殖具有明显的抑制作用,其作用机制与诱导细胞凋亡相关。

细胞同步化对肿瘤坏死因子诱导Hela细胞凋亡的影响

目的 研究细胞周期时相对肿瘤坏死因子 (TNF)诱导Hela细胞凋亡的影响。方法 应用胸腺嘧啶核苷 (TdR )双阻断法将培养的Hela细胞同步化 ,采用MTT法、流式细胞术和荧光染色 ,分析同步化的Hela细胞和正常培养的Hela细胞对TNF(加放线菌酮增效 )诱导凋亡的敏感性。结果 同步化Hela细胞较正常培养的Hela细胞对TNF诱导凋亡的敏感性增强。

宫颈癌HeLa细胞抗顺铂作用的Notch1机制研究

目的利用宫颈癌He La细胞系探讨宫颈癌的抗化疗机制。方法利用球形成试验(sphere forming assay)和Western blot法检测顺铂对癌症干细胞形成的影响以及Notch1在He La细胞系的表达。基因沉默试验分析Notch1基因是否在宫颈癌He La癌症干细胞中发挥关键作用。结果顺铂能促进球结构(意味着癌症干细胞形成)的形成。5μmol/L顺铂较1μmol/L顺铂能促进更多球结构形成(P<0.05)。10μmol/L顺铂会抑制球结构形成。5μmol/L顺铂还能提高He La中Notch1的表达(P<0.05),而沉默He La细胞的Notch1后,He La细胞中形成的球数量降低1.7倍(P<0.05)。结论宫颈癌He La细胞系具有抗顺铂治疗的特性,尤其是5μmol/L的顺铂,该抗化疗作用与宫颈癌He La细胞中的Notch1表达升高,最终促进癌症干细胞自我更新有关。

弯齿琵甲粗蛋白诱导Hela细胞凋亡的实验研究

目的研究弯齿琵甲粗蛋白诱导宫颈癌Hela细胞的凋亡作用及其作用机制。方法采用硫酸铵沉淀法提取弯齿琵甲粗蛋白,分别按7.5、10和15μg.mL-1三个浓度作用于Hela细胞48h和72h,吖啶橙-EB染色后倒置荧光显微镜下观察细胞的形态变化,DNA琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞DNA断裂情况,Annexin V-FITC/PI双染法定量检测细胞的凋亡情况。结果不同浓度的粗蛋白作用于细胞48h后均出现较明显的细胞凋亡形态,10和15μg.mL-1两浓度粗蛋白作用于细胞后使DNA片断化,流式细胞术检测显示加入15μg.mL-1的弯齿琵甲粗蛋白在48h以及72h的凋亡率分别达到了10.95%和28.075%,坏死率也分别达到了2.02%和18.34%。结论弯齿琵甲粗蛋白能够抑制Hela细胞增殖,诱导Hela细胞凋亡,且呈时间剂量依赖关系。

^(32)P照射对Hela细胞杀伤效应的研究

目的 研究在不同照射条件下肿瘤细胞生物学效应的特点及不同剂量与时间组合方式对肿瘤细胞的杀灭效果。方法 采用人宫颈癌Hela细胞系体外培养 ,制作32 P放射性贴片照射细胞 ,通过观察照射后细胞增殖能力变化 ,研究不同剂量、剂量率、照射时间的细胞放射反应特点。应用克隆形成率和细胞群体倍增大小评价肿瘤细胞的增殖能力。结果 单次照射显示Hela细胞的剂量、时间、剂量率的阈值特点。照射时间在 2h以上、剂量和剂量率分别大于 14 8.0 0MBq·h、2 .78MBq·h才可以有效抑制Hela细胞增殖 ;总剂量一定时 ,一定范围内增加照射时间 ,细胞总体增殖数目减小。分次与单次照射的比较显示 ,分次照射组克隆增殖率明显低于单次照射组 (P <0 .0 5 ) ,间隔 4h的分次照射方案细胞杀伤效率最高。结论 32 Pβ射线照射Hela细胞的生物反应具有剂量、时间、剂量率的阈值特点。在一定剂量、一定剂量率范围内延长照射时间 ,可以更有效地杀伤肿瘤细胞。在现有的剂量范围内 ,一定总剂量。

Hela细胞导入TRIM45基因后的比较蛋白质组学研究

为了确定TRIM45基因的功能和作用机理,将其转入Hela细胞,分析细胞内蛋白质表达水平的变化.研究采用双向凝胶电泳的方法分别对转入pCMV-Tag2B空载体和重组质粒pCMV-Tag2B-TRIM45的Hela细胞全蛋白进行分离,利用PDQUEST7.2软件分析,鉴定得到15个差异点,包括8个上调点和7个下调点.为进一步研究TRIM45基因的功能奠定了良好的基础.

siRNA干扰对Hela细胞株VEGF表达的影响

目的:探讨血管内皮生长因子(VEGF)siRNA干扰对宫颈癌Hela细胞株VEGF的影响。方法:设计合成VEGFsiRNA1、2、3号链,体外脂质体介导转染宫颈癌Hela细胞株,半定量RT-PCR及Western blot分析转染效果。结果:转染VEGF siRNA1、2号链后,宫颈癌Hela细胞株VEGFmRNA表达明显下降,但是VEGF蛋白水平下降不明显。结论:VEGF siRNA转染宫颈癌Hela细胞株可下调细胞中VEGFmRNA的表达,不同的siRNA下调mRNA效率不同。作为基因沉默的一个重要工具,siRNA干扰有望成为治疗宫颈癌一种新方法。

Galecin-3在膜联蛋白A7表达抑制的HeLa细胞中的表达变化

目的探讨膜联蛋白A7(ANXA7)表达抑制的HeLa细胞galectin-3(gal-3)的表达改变。方法将细胞分为实验组、阴性对照组和空白对照组。采用RNA干扰技术将靶向ANXA7的siRNA和阴性对照siRNA脂质体2000转染法分别转染宫颈癌细胞系HeLa细胞,空白对照组不予任何处理。转染48h后采用Western blotting法和RT-PCR法分别在蛋白水平和mRNA水平进行抑制效果的鉴定。Western blotting和实时定量PCR法分别检测ANXA7表达抑制的HeLa细胞中galectin-3的表达改变。结果靶向ANXA7的siRNA可显著抑制ANXA7的表达;当ANXA7表达受抑后,galectin-3在HeLa细胞中的表达显著下降,与阴性对照组和空白对照组相比,差异有显著性(P<0.05)。结论 ANXA7表达抑制的宫颈癌细胞系HeLa细胞中galectin-3的表达显著下调,这可能是ANXA7表达受抑的细胞行为学发生改变的机制之一。