卵巢癌肿瘤标记物HE4基因的分子克隆与蛋白表达

目的构建HE4基因及蛋白表达系统,用于卵巢癌的早期诊断。方法提取卵巢癌细胞H08910的总RNA,利用RT-PCR技术扩增HE4基因,然后将该片段进行T-A克隆并测序鉴定,纯化回收后亚克隆于原核表达载体PGEX-4T-1中,然后提取质粒,酶切鉴定,最后经IPTG诱导,原核表达重组子在TOP10宿主菌进行表达,并进行SDS-PAGE、WesternBlot分析与鉴定。结果应用RT-PCR技术,从卵巢癌HO8910的总RNA中扩增到一条大小约为400bp的片段,经T-A克隆与测序鉴定,证实此片段为HE4基因,将PGEX-4T-1重组子转化入宿主菌,用IPTG诱导菌体表达HE4重组蛋白,经SDS-PAGE电泳和WesternBlot鉴定证实,在相对分子量约39000处可见明显的特异性的高表达条带。结论已成功克隆HE4基因,并经IPTG诱导在TOP10宿主菌中表达了相应的蛋白,为进一步制备卵巢癌的早期诊断试剂奠定基础。

HE4融合蛋白基因的构建、表达及鉴定

目的重组及表达人附睾上皮分泌蛋白4(HE4)的融合蛋白,为建立一种新的卵巢癌的诊断方法奠定基础。方法提取人卵巢癌细胞株SKOV3中总RNA,应用RT-PCR技术扩增出HE4基因,将其与PUCm-T载体连接,转化入TOP10菌中进行克隆并测序鉴定。进一步构建PET28a-HE4表达体系,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,最终在BL21菌中表达HE4融合蛋白(含有His-Tag),并进行SDS-PAGE及western blot鉴定。结果SKOV3细胞株提取的RNA经RT-PCR扩增后得到一条400bp左右的DNA片断,经测序鉴定含HE4基因序列;成功构建了HE4融合蛋白的重组表达质粒;并在大肠杆菌中实现了可溶性高表达,经western blot鉴定为HE4融合蛋白。结论采用原核表达方法可获得高纯度的HE4融合蛋白,为进一步开发HE4诊断试剂打下基础,为卵巢癌的诊断开辟新途径。