应用基因表达谱芯片筛选高能X射线诱导HFL-1细胞胶原相关基因

目的 探讨高能X射线对人胚肺成纤维细胞（HFL-1）细胞胶原表达产生影响,并筛选胶原相关基因,为临床放射性肺纤维化的治疗提供理论依据.方法 将体外培养的HFL-1细胞随机分为对照组和放射组,放射组细胞予6 MV X射线5 Gy单次照射.照射后24 h以消化法检测两组细胞羟脯氨酸（HYP）表达情况,RT-PCR及蛋白印迹法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原基因及蛋白表达情况,采用基因芯片技术分析基因表达谱改变情况.结果 照射后24 h放射组细胞HYP表达显著高于对照组（1834μg/ml：4912μg/ml,P=0000）.放射组照射后24 hⅠ、Ⅲ型胶原基因及蛋白表达均明显高于对照组（18535：186779,P=0000;4337：24425,P=0000）.两组细胞差异表达的基因为1879个,其中放射组上调基因771个、下调基因为1108个.参与纤维化的基因上调5倍以上的有TGF-β1、TGF-β3、MMP28、MMP26、MMP27和SMAD6.结论 高能X射线能诱导HFL-1细胞产生胶原,表达谱基因芯片技术可有效筛选高能X射线诱导胶原相关基因.放射性肺纤维化的发生发展由多个类型基因参与调控.

丹参酮ⅡA对大鼠肺纤维化细胞TGF-β1/Smads信号通路的影响

目的观察丹参酮ⅡA对TGF-β1诱导大鼠肺成纤维细胞TGF-β1/Smads信号通路的影响,探讨丹参酮ⅡA干预肺纤维化的机制。方法体外培养大鼠肺成纤维细胞(HFL-1),选取生长状态良好的对数期细胞分为正常组、TGF-β1组及丹参酮ⅡA低(L)、中(M)、高(H)剂量组。除正常组外,余四组予以10ng/m L TGF-β1诱导HFL-1纤维化24h,同时丹参酮ⅡA低、中、高剂量组分别予2μmol/L、5μmol/L和10μmol/L丹参酮ⅡA处理24h,ELISA法测定各组细胞中TGF-β1受体表达,荧光定量PCR法及免疫印迹法检测Smad2、Smad7表达情况。结果与正常组比较,HLF-1细胞经10ng/m L TGF-β1诱导后细胞TGF-β1受体和Smad2表达量增加[(0.19±0.23)比(1.41±0.12)、(1.00±0.12)比(1.90±0.12),P<0.01],Smad7表达量降低[(1.00±0.15)比(0.57±0.09),P<0.01];与TGF-β1组比较,10μmol/L丹参酮ⅡA处理后TGF-β1受体和Smad2的表达量均有下降趋势[(1.90±0.23)比(1.53±0.12),(1.90±0.12)比(1.38±0.06),P<0.01],Smad7表达量升高[(0.57±0.08)比(0.74±0.11),P<0.01]。结论丹参酮ⅡA可以抑制TGF-β1诱导的大鼠肺成纤维细胞增殖和Smad2及TGF-β1受体表达,增强抑制性信号蛋白Smad7的表达,从而发挥抑制肺纤维化的作用。

基于网络药理学与实验验证研究荜茇抗肺纤维化的作用机制

目的:通过网络药理学及分子对接技术初步预测荜茇抗肺纤维化的活性成分、作用靶点及信号通路,并通过体外实验进行初步验证荜茇抗肺纤维化的作用机制。方法:从TCMSP、Swiss Target Prediction和Pub Chem等数据库中获取药物的有效成分及对应靶点。使用Gene Cards和OMIM数据库收集疾病的相关靶点。利用jvenn在线工具筛选出药物与疾病的交集靶点,通过String数据库及Cytoscape3.9.1软件构建“药物-成分-靶点”与PPI网络图。使用微生信平台对交集靶点进行GO及KEGG富集分析,将富集KEGG前20条通路、核心靶点、药物成分,构建“成分-靶点-通路”网络并进行可视化。利用分子对接技术将药物成分与靶点进行对接,并对其部分对接结果可视化。培养HFL-1细胞,采用MTT法检测各浓度对细胞活力的影响,计算抑制率,从而筛选出最佳的药物浓度。将体外培养的HFL-1细胞分为4组,即对照组、TGF-β1组、TGF-β1+LD组(联合LD组)、TGF-β1+HD组(联合HD组)。采用CCK-8试剂检测24、48、72 h的细胞增殖活性。采用平板克隆形成实验来观察药物对HFL-1细胞克隆形成能力的影响。采用RT-qPCR和Western blot实验观察各组细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(COI-Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(COI-Ⅲ)的m RNA和PI3K-Akt信号通路蛋白表达水平。结果:共获得荜茇与抗肺纤维化交集靶点为197个。经拓扑学分析获得核心PPI网络,包含29个节点与199条边;GO功能分析显示,荜茇治疗肺纤维化(PF)生物学过程包括:凋亡过程负调控、信号转导、蛋白质磷酸化等。细胞成分包括:细胞质、核浆、等离子体膜。分子功能包括相同的蛋白结合、丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白结合等。KEGG信号通路被155条富集,而其中已被证实,与PF密切相关为PI3K-Akt信号通路,富集排名第四“。成分-靶点-通路”网络中PIK3CA、MAPK3、MAPK1、MTOR、SRC、CCND1、EGFR、PRKCA、BCL2、GSK3B链接度最高。荜茇宁、N-(2,5-二甲氧基苯基)-4-甲氧基苯甲酰胺、四氢丹参酮、豌豆素和胡椒碱是关键化合物。分子对接结果显示,除N-(2,5-二甲氧基苯基)-4-甲氧基苯甲酰胺外,其余化合物与10个链接度高的蛋白质结合活性较好。体外实验显示,48、72 h联合LD组增殖能力明显低于TGF-β1组(P<0.05),24、48、72 h联合HD组又显著低于联合LD组。各药物组克隆数量显著减少(P<0.05)。联合LD和联合HD组α-SMA、COl-I、COl-Ⅲm RNA和蛋白表达水平明显低于TGF-β1组。与TGF-β1组相比,两个剂量组中p-PI3K/PI3K、pAKT/AKT蛋白表达显著减少(P<0.01)。结论:荜茇抗PF作用,其机制可能通过调控PI3K-Akt信号通路而发挥治疗PF作用。

溶血磷脂酸对人肺成纤维细胞Ⅰ型胶原合成的影响

目的探讨溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)对人肺成纤维细胞(HFL-1)Ⅰ型胶原(procollagen typeⅠ,PCOLⅠ)合成的影响。方法将HFL-1培养后置于6孔板中,随机分为6组:对照组,LPAⅠ、Ⅱ、Ⅲ组(用1μmol.L-1的LPA刺激6、12、24h后收集细胞),IL-13组(用100μg.L-1的IL-13作用48h后收集细胞),LPA+IL-13组(用1μmol.L-1的LPA刺激12h、100μg.L-1的IL-13刺激48h后收集细胞),每组3孔。用RT-PCR方法检测PCOLⅠmRNA的表达;用免疫组化方法检测PCOLⅠ蛋白的表达。结果免疫组化与RT-PCR方法均显示LPA刺激后,PCOLⅠ的表达降低,IL-13刺激后,PCOLⅠ的表达增高,且LPA+IL-13组PCOLⅠ表达比LPA组较高,比IL-13组较低。结论LPA可以下调HFL-1PCOLⅠ的合成。

补阳还五汤冻干粉对HFL1细胞HMGB1/RAGE/CDc42信号通路的干预作用

目的观察补阳还五汤冻干粉对高迁移率族蛋白B1(High Mobility Group box-1 Protein,HMGB1)诱导的HFL1细胞中晚期糖基化终产物受体(receptor of advanced glycation end-product,RAGE)/细胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42,CDc42)信号通路的影响。方法采用MTT法检测补阳还五汤冻干粉对A549、HFL1增殖的影响;采用Western blot法检测细胞总蛋白中CDc42的表达,采用ELISA法检测细胞外RAGE、TNF-α的表达。结果补阳还五汤冻干粉对HFL1细胞的IC50为11%。在HFL1细胞中,5%、10%、15%冻干粉均能下调CDc42、RAGE、TNF-α的表达,以5%冻干粉组下调最明显。结论补阳还五汤冻干粉可通过对HFL1细胞中HMGB1/RAGE/CDc42信号通路的干预从而调节肺纤维化的发生发展。

马蹄皮多酚的抗氧化活性及其对HepG-2细胞增殖的抑制

目的研究马蹄皮多酚的抗氧化活性,并探讨其对人肝癌HepG-2细胞增殖的影响。方法利用超声波提取法制备马蹄皮多酚;采用硫代巴比妥酸法、邻苯三酚氧化法研究马蹄皮多酚的抗氧化活性;MTT法测定其对HepG-2细胞增殖的抑制作用。结果马蹄皮多酚可抑制大鼠红细胞溶血,影响大鼠脑组织脂质过氧化,降低肝组织中丙二醛的含量,并对大鼠超氧阴离子自由基、羟基自由基有极强的清除作用。0.35~1.15 mg·mL^(-1)马蹄皮多酚可抑制HepG-2细胞的增殖,且不影响人胚肺成纤维细胞HFL-1的增殖;浓度为1.15、1.55 mg·mL^(-1)时,HepG-2细胞失去完整结构。结论马蹄皮多酚具有抗氧化活性和抑制HepG-2细胞增殖的作用。