基于HGF/PI3K/Akt信号轴研究赤芍-附子药对促进慢加急性肝衰竭肝细胞再生的作用机制

基于肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)/磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信号轴研究赤芍-附子药对对慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)大鼠的治疗作用及对肝细胞再生的影响。采用牛血清白蛋白皮下及尾静脉注射联合脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)+D-氨基半乳糖(D-galactosamine,D-GalN)腹腔注射构建ACLF大鼠模型,实验设置正常对照(NC)组、模型(vehicle)组、赤芍-附子药对(SFYD,5.85 g·kg^(-1))组、促肝细胞生长颗粒(HGFG,4.05 g·kg^(-1))组。苏木素-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色观察大鼠肝组织病理变化。全自动生化分析仪检测血清谷丙转氨酶(alanineamino transferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate transa-minase,AST)、总胆红素(total bilirubin,TBIL)。ELISA法检测白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)炎症因子水平。免疫荧光染色检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、细胞增殖相关抗原(antigen identified by monoclonal antibody,Ki67)及细胞周期蛋白(cell cycle protein B1,CyclinB1)阳性表达。实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)法、蛋白免疫印迹(Western blot)法检测HGF、结合蛋白Gab1(grb2 associated binding protein 1,Gab1)、PI3K、Akt、磷酸化PI3K(phosphorylation PI3K,p-PI3K)、磷酸化Akt(phosphorylation Akt,p-Akt)mRNA及蛋白表达水平。结果显示,与vehicle组比较,SFYD组大鼠肝组织病理评分降低,肝功能及炎症反应改善,PCNA、Ki67、CyclinB1荧光表达增强。同时与模型组相比,SFYD组HGF、Gab1蛋白表达上调,PI3K、Akt磷酸化激活。以上研究表明赤芍-附子药对通过减轻肝细胞炎症损伤以及促进肝细胞再生来达到抗肝衰竭的效应,其具体调控机制可能与激活HGF/PI3K/Akt信号通路有关。

益智仁-乌药药对调控PI3K/Akt/mTOR通路介导细胞自噬保护肾小球足细胞的作用机制研究

目的研究益智仁-乌药药对通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路促进足细胞自噬治疗糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)的作用。方法60只造模成功的C57BL/KSJ-db/db(以下简称db/db)小鼠随机分为模型组、二甲双胍组、缬沙坦组、益智仁-乌药药对(低、中、高剂量)组,每组10只;另取10只C57BL/KSJ-db/m(以下简称db/m)小鼠为正常组,正常组和模型组给予生理盐水,治疗组小鼠分别给予相应药物,给药8周后检测小鼠肾脏病理学改变,足细胞自噬体数量、结构及相关蛋白表达。结果与模型组相比,益智仁-乌药药对组可显著减轻糖尿病肾病小鼠肾小球基底膜增厚情况,增加足细胞自噬体数量,显著升高自噬相关蛋白表达(P<0.05),降低PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达(P<0.05)。其中益智仁-乌药药对高剂量组各指标改善优于益智仁-乌药低、中剂量组。结论益智仁-乌药药对通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路激活,提高足细胞自噬水平,减轻足细胞损伤,发挥治疗糖尿病肾病的作用。

自拟平衡针灸通过调控PI3K-AKT信号通路及血清GABA水平对老年失眠的治疗作用

目的探讨自拟平衡针灸通过调控磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)信号通路及血清氨基丁酸(GABA)水平对老年失眠的治疗作用。方法以老年失眠患者120例作为研究对象,按照随机分组原则分为研究组及对照组,各60例。两组均采取阿普唑仑进行治疗,研究组在此基础上联合采取自拟平衡针灸进行治疗,两组均治疗4 w。比较两组治疗效果、临床改善指标、PI3K-AKT信号通路及GABA、多导睡眠监测仪指标、睡眠质量之间的差异。结果研究组治疗总有效率显著高于对照组(P<0.05)。治疗后,两组睡眠潜伏期、睡眠总时间及觉醒次数均显著改善,且研究组睡眠潜伏期、觉醒次数显著低于对照组(P<0.05),睡眠总时间显著高于对照组(P<0.05)。两组PI3K、AKT及GABA均显著改善,且研究组PI3K、AKT显著低于对照组,GABA显著高于对照组(P<0.05)。两组总睡眠时间(TST)、睡眠效率(SE),第一(TS1)、二(TS2)、三(TS3)及四期(TS4)睡眠、快速眼动睡眠时间(REM)、觉醒期时间(WASO)、睡眠潜伏期时间(SL)均显著改善,且研究组以上指标改善均显著优于对照组(P<0.05)。两组日间功能障碍、睡眠质量、睡眠时间、睡眠障碍及入睡时间均显著改善,且研究组日间功能障碍、睡眠质量、睡眠时间、睡眠障碍及入睡时间显著优于对照组(P<0.05)。结论自拟平衡针灸通过调控PI3K-AKT信号通路及血清GABA水平,有效降低局部炎性反应,优化神经系统的递质传递,有效改善患者的治疗效果。

达沙替尼基于PI3K/AKT信号通路调节乳腺癌细胞生物学行为

目的:基于PI3K/AKT信号通路探讨达沙替尼(dasatinib,DAS)对乳腺癌MCF-7细胞生物学行为的影响。方法:分别使用噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法、Transwell法、流式细胞术和Western blotting法检测DAS不同浓度(0、2、6、10μmol/L)作用下MCF-7细胞增殖、侵袭和迁移、细胞凋亡以及PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达情况。同时设置对照组(溶媒对照)、DAS组(DAS 10μmol/L)、PI3K抑制剂组(LY29400220μmol/L)、联合组(DAS 10μmol/L+LY29400220μmol/L),比较各组细胞增殖、侵袭和迁移、细胞凋亡以及PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达情况。结果:随着DAS作用浓度的升高,MCF-7细胞增殖抑制率和细胞凋亡率升高(P<0.05),侵袭细胞数、迁移细胞数和PI3K、p-PI3K、p-AKT蛋白表达降低(P<0.05)。与对照组相比,DAS组、PI3K抑制剂组、联合组MCF-7细胞增殖抑制率和细胞凋亡率升高(P<0.05),PI3K、p-PI3K、p-AKT蛋白表达降低。与PI3K抑制剂组、DAS组相比,联合组MCF-7细胞增殖抑制率和细胞凋亡率升高,PI3K、p-PI3K、p-AKT蛋白表达降低(P<0.05)。结论:DAS能抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖、侵袭和迁移能力,诱导细胞凋亡,其机制可能与调控PI3K/AKT信号通路有关。

栀子苷调节PI3K/AKT/mTOR信号通路在动脉粥样硬化形成过程中对Th17/Treg功能的影响

目的:观察栀子苷对载脂蛋白E缺乏(ApoE^(-/-))小鼠Th17/调节性T(Treg)细胞失衡的影响及其作用机制。方法:将50只纯合子ApoE^(-/-)雌性小鼠随机分为对照组、模型组和栀子苷低剂量组、栀子苷中剂量组、栀子苷高剂量组。对照组小鼠喂养普通饲料,模型组和栀子苷组小鼠喂养高脂饲料。从第8周开始,栀子苷各剂量组每日灌胃栀子苷(25、50、100 mg/kg),连续8周。试验结束时,采用油红O染色评估主动脉及其根部动脉粥样硬化(AS)病变面积比。采用定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析主动脉组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-17A和IL-10 mRNA表达;采用流式细胞仪分析脾脏中Th17和Treg细胞百分比;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测主动脉组织磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路相关蛋白表达。结果:油红O染色病变显示,栀子苷中剂量组、栀子苷高剂量组病变百分比低于模型组(P<0.05)。与对照组比较,模型组主动脉TNF-α、IL-6和IL-17A mRNA表达水平升高(P<0.05);栀子苷各剂量组主动脉TNF-α、IL-6和IL-17A mRNA表达水平降低(P<0.05)。与对照组比较,模型组主动脉抗炎细胞因子IL-10 mRNA表达水平降低(P<0.05);栀子苷各剂量组主动脉抗炎细胞因子IL-10 mRNA表达水平升高(P<0.05)。与对照组比较,模型组小鼠脾脏中Th17细胞百分比升高,Treg细胞百分比降低(P<0.05)。栀子苷处理恢复了AS小鼠Th17和Treg细胞的平衡。栀子苷抑制PI3K的表达及AKT和mTOR的磷酸化,MHY1485(mTOR活化剂)减弱了栀子苷对T细胞分化的影响。结论:栀子苷抗AS作用机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号引起的Treg细胞增多和Th17细胞减少有关。

异莲心碱通过PI3K/Akt/mTOR信号通路影响结肠癌SW480细胞增殖、凋亡和自噬

目的:探讨异莲心碱(Iso)通过PI3K/Akt/mTOR信号通路对结肠癌SW480细胞增殖、凋亡和自噬的影响。方法:用10、20和40μmol/L的Iso处理结肠癌SW480细胞,CCK-8法、流式细胞术和WB法分别检测Iso对细胞增殖活力、凋亡和自噬相关蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62表达的影响。然后,用20μmol/L的Iso和25μmol/L的PI3K激活剂740 Y-P分别处理SW480细胞,将细胞分为对照组、740 Y-P组、Iso组和Iso+740 Y-P组,流式细胞术、WB法检测Iso和740 Y-P对各组细胞凋亡及细胞中LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62、PI3K、p-PI3K、mTOR和p-mTOR蛋白表达的影响。结果:10、20和40μmol/L的Iso处理后,SW480细胞增殖活力均显著下降(均P<0.05),细胞凋亡率均显著升高(均P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达均显著上调(均P<0.05),p26蛋白表达显著下调(P<0.05)。Iso和740 Y-P处理后,与对照组相比,740 Y-P组细胞凋亡率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达均显著下降(均P<0.05),p26、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR表达均显著升高(均P<0.05);Iso组细胞凋亡率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达升高(均P<0.05),p26、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR表达均显著下降(均P<0.05);与740 Y-P组相比,Iso+740 Y-P组细胞凋亡率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达升高(P<0.05),p26、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR表达均显著下降(均P<0.05);与Iso组相比,Iso+740 Y-P组细胞凋亡率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达下降(均P<0.05),p26、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR表达均显著升高(均P<0.05)。结论:Iso通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制结肠癌SW480细胞增殖并诱导细胞凋亡和自噬。

茯苓酸调控PI3K/AKT/mTOR通路介导葡萄糖代谢促进结直肠癌细胞凋亡的机制研究

目的 研究茯苓酸对结直肠癌细胞葡萄糖代谢及细胞凋亡的调控作用。方法 通过细胞活性测定(Cell Counting Kit-8,CCK8)、克隆形成等实验检测茯苓酸对结直肠癌细胞增殖与细胞活性的影响;采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞凋亡实验检测茯苓酸对结直肠癌细胞凋亡的影响;使用细胞氧气消耗率和细胞外酸化率测定仪器及细胞葡萄糖代谢水平测定试剂盒检测茯苓酸对结直肠癌细胞葡萄糖代谢的影响;通过蛋白免疫印迹(Western blotting, WB)实验验证凋亡、糖酵解、磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)/丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶(AKT Serine/Threonine Kinase 1,AKT)/雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin, mTOR)通路相关蛋白表达情况。结果 茯苓酸能够有效抑制结直肠癌细胞增殖与细胞活性,并能够通过抑制其糖酵解水平促进其细胞凋亡,同时显著抑制PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白表达水平。结论 茯苓酸可通过调控PI3K/AKT/mTOR通路介导葡萄糖代谢促进CRC细胞凋亡,可作为未来结直肠癌代谢靶向治疗的潜在药物。

重楼皂苷Ⅰ预防给药对心肌缺血再灌注损伤大鼠调节PI3K/AKT信号通路的作用研究

目的 从磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路探讨重楼皂苷I预防给药对心肌缺血再灌注损伤(MI/IR)大鼠的干预机制。方法 将购买的72只SPF级SD大鼠按照随机数字法分为假手术组、模型组、阿司匹林组、重楼皂苷I低、中和高剂量组,每组12只。分组后即给予相应药物干预2周,2周后构建MI/IR模型。模型构建成功24 h后先采用动物彩色多普勒超声仪检测心脏功能,后处死大鼠收集相关组织采用HE染色观察心肌病理学、TTC法检测心肌梗死面积,试剂盒检测心功能指标[乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)和谷草转氨酶(AST),抗氧化指标丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)],TUNNEL染色检测心肌细胞凋亡特点,Western blot检测心肌PI3K、AKT、B细胞淋巴瘤/因子2(Bcl-2)、Bcl-2相关蛋白(Bax)蛋白表达。结果 假手术组心肌纤维排列整齐、无水肿,模型组有心肌纤维断裂,重楼皂苷I低、中、高剂量组和阿司匹林组明显改善心肌纤维断裂情况。与假手术组相比,模型组大鼠心肌梗死面积、LVEDP、LDH、CK-MB、AST和MDA明显升高(P<0.05),LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、SOD和GSH明显降低(P<0.05);相较于模型组,阿司匹林组和重楼皂苷I低、中、高剂量组干预后,心肌梗死面积、LVEDP、LDH、CK-MB、AST和MDA明显降低(P<0.05),LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、SOD和GSH则明显升高(P<0.05)。Tunnel染色可见,假手术组几乎没有心肌细胞凋亡,而模型组呈现出明显的大量的细胞凋亡;与模型组相比,阿司匹林组和重楼皂苷I低、中、高剂量组凋亡情况明显好转。此外,与假手术组相比,模型组大鼠心肌PI3K、AKT和Bcl-2蛋白表达均明显降低,Bax明显升高(均P<0.05);相较于模型组,重楼皂苷I低、中、高剂量组以及阿司匹林组PI3K、AKT和Bcl-2蛋白表达均明显升高,Bax蛋白表达明显降低(均P<0.05)。结论 重楼皂苷I对心肌缺血再灌注损伤有一定的预防作用,其作用机理可能与其能够调节PI3K/AKT信号通路有关。

(Pyr1)Apelin-13对布比卡因诱导停搏乳鼠心肌细胞PI3K/Akt通路的干预

目的:探讨Apelin/APJ系统在逆转布比卡因心肌毒性中的作用及机制。方法:提取乳鼠心肌细胞进行原代培养,随机分为4组:空白培养基组(DMSO组)、布比卡因1 mmol/L(Bup组)、(Pyr1)Apelin-132μmol/L组(Apl组)和布比卡因1 mmol/L+(Pyr1)Apelin-132μmol/L组(BAp组)。记录各组细胞基础自主搏动次数后,按照相应分组给药处理6 h。处理完毕后时间记为T0,记录T0至T12不同时间的细胞搏动次数;电镜下观察T12时心肌细胞线粒体形态;比色法检测T12时细胞培养液乳酸脱氢酶(LDH)含量;ELISA检测T12时心肌细胞中Apelin-13浓度;Western blot检测T12时心肌细胞中APJ、PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白的表达。结果:T0时Bup组全部心肌细胞停止搏动。与DMSO组比较,Bup组细胞搏动次数显著减少(P<0.05),线粒体肿胀空泡化,培养液LDH含量明显上升(P<0.05),心肌细胞中Apelin-13、APJ、p-PI3K和p-Akt蛋白表达均下调(P<0.05)。与Bup组比较,BAp组细胞搏动次数显著增加(P<0.05),线粒体结构明显改善,培养液LDH含量明显下降(P<0.05),心肌细胞中Apelin-13,APJ、p-PI3K和p-Akt蛋白表达均上调(P<0.05)。结论:(Pyr1)Apelin-13可逆转布比卡因诱导的心肌细胞停搏,机制也许与激活PI3K/Akt蛋白磷酸化有关。

基于PI3K/Akt通路研究蛇伤胶囊调节血小板活化功能治疗竹叶青蛇伤凝血障碍机制

目的基于PI3K/Akt通路研究蛇伤胶囊调节血小板活化功能治疗竹叶青蛇伤凝血障碍机制。方法24只新西兰大白兔被随机分为正常对照组、模型组、蛇伤胶囊组,每组8只雌雄各半,根据前期研究方法模型组和蛇伤胶囊组以兔耳缘静脉注射0.75 mg/kg竹叶青蛇毒液,建立竹叶青蛇伤兔模型,正常对照组注射等量生理盐水。注射后6 h后予正常对照组和模型组以10 ml/(kg·d)生理盐水灌胃,蛇伤胶囊组予10 ml/(kg·d)蛇伤胶囊所配药液灌胃。以上3组连续灌胃1周后兔耳缘静脉采血5 ml,血小板分离提取后Western blot检测各组血小板细胞PTEN、PI3K、Akt蛋白表达,qPCR检测各组血小板活化指标CD62P mRNA表达。结果与正常对照组相比,模型组血小板细胞PTEN蛋白表达增加(P<0.01),PI3K、Akt蛋白及CD62P mRNA表达减少(P<0.01);与模型组相比,蛇伤胶囊组血小板细胞PTEN蛋白表达减少(P<0.01),PI3K、Akt蛋白及CD62P mRNA表达增加(P<0.01)。结论蛇伤胶囊可通过上调PI3K/Akt通路,改善竹叶青蛇伤导致的血小板活化功能受抑制,从而治疗竹叶青蛇伤凝血障碍。

黄芪影响缺氧微环境中骨髓间充质干细胞增殖活性的PI3K-AKT信号通路分析

基于PI3K/AKT信号通路研究黄芪对缺氧环境中骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的细胞活性的影响。分别以黄芪冻干粉溶液低、中、高剂量(100、200和300μg·mL^(-1))干预低氧浓度(10%)环境中成骨分化培养的BMSCs,通过高内涵实时成像系统观察BMSCs动态增殖情况及分化代数;进行无标记示踪模拟细胞运动轨迹,分析各组细胞运动速度、位移距离和路程的情况;通过激光共聚焦显微镜观察细胞线粒体膜电位,通过免疫荧光和RT-PCR检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白和基因表达水平的变化。结果显示:与对照组相比,10%低氧浓度条件下BMSCs增殖减慢、分化代数减少,运动速度减慢,位移距离和路程减少,线粒体膜电位活性降低,p-PI3K、p-AKT蛋白表达降低,PI3K和AKT基因表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.01);与低氧组相比,黄芪冻干粉溶液干预后,能显著维持缺氧环境中BMSCs增殖和分化活性,运动活力升高,线粒体膜电位活性提高,p-JAK2、p-STAT3蛋白和PI3K、AKT基因表达升高,差异有统计学意义(P<0.05或0.01)。黄芪可能通过激活PI3K/AKT信号通路维持缺氧条件下BMSCs的增殖活性。

葛根芩连汤通过IRS-1/PI3K/AKT通路对胃肠湿热型2型糖尿病大鼠糖脂代谢的影响

目的探究葛根芩连汤通过胰岛素受体底物-1(IRS-1)/磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路对胃肠湿热型2型糖尿病大鼠糖脂代谢的影响。方法将40只SD大鼠随机分为正常组(2 mL生理盐水灌胃)、造模组(2 mL生理盐水灌胃)、二甲双胍组(4.17 mg/100 g二甲双胍灌胃)和葛根芩连汤组(1 g/100 g葛根芩连汤灌胃),每组10只。采用高脂高糖饲料加腹腔注射链脲佐菌素(STZ)构建2型糖尿病大鼠模型,随后喂食油脂、42°白酒及蜂蜜水构建胃肠湿热型2型糖尿病大鼠模型。测量各组大鼠不同时间节点体质量,血糖仪测定空腹血糖(FBG);ELISA检测空腹胰岛素(FINS)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平变化、计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);HE染色检测肝组织病理学变化;检测肝组织过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量变化。Western blot检测肝组织IRS-1、PI3K、p-PI3K、AKT及p-AKT蛋白变化。结果与正常组比较,造模组大鼠体质量、FBG、FINS及HOMA-IR、GSH-Px、CAT、SOD、IRS-1、p-PI3K/PI3K及p-AKT/AKT水平均明显下降(P<0.05)、TG、TC、IL-6、TNF-α及MDA含量均显著升高(P<0.05),可见局灶性肝实质损失。与造模组比较,二甲双胍组及葛根芩连汤组大鼠体质量、FBG、FINS及HOMA-IR、GSH-Px、CAT、SOD、IRS-1、p-PI3K/PI3K及p-AKT/AKT水平均明显升高(P<0.05)、TG、TC、IL-6、TNF-α及MDA含量均显著降低(P<0.05),显示正常的肝实质。结论葛根芩连汤可明显改善胃肠湿热型2型糖尿病糖脂紊乱,可能是通过IRS-1/PI3K/AKT通路发挥作用。

Yes相关蛋白(YAP)通过激活PI3K/AKT通路促进皮肤鳞状细胞癌细胞侵袭和迁移

目的探讨Yes相关蛋白(YAP)在皮肤鳞状细胞癌(cSCC)中表达及与cSCC侵袭和迁移中的作用。方法通过免疫组织化学染色法检测cSCC、鲍温病(BD)、癌旁正常皮肤组织中YAP的表达水平,并分析与临床病理参数之间的关系;利用慢病毒转染构建YAP基因敲低的A431稳定细胞株,利用四甲基罗丹明标记的鬼笔环肽检测A431细胞微丝分布和数量,Transwell TM实验检测细胞侵袭能力,划痕实验检测A431细胞的迁移能力;免疫荧光细胞化学染色法观察敲低YAP后上皮间质转化(EMT)相关标志物上皮钙黏素(E-cadherin)、锌指转录因子Snail的表达;Western blot法检测E-cadherin、Snail、β-catenin、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化的蛋白激酶B(p-AKT)、核糖体蛋白S6(S6)、磷酸化S6(p-S6)、4E结合蛋白1(4EBP1)、磷酸化的4EBP1(p-4EBP1)的表达。结果YAP在cSCC和BD中表达显著高于癌旁正常皮肤组织;cSCC中YAP高表达与肿瘤大小、分化程度、侵袭程度密切相关,与患者的性别、年龄、发病部位、形态类型、是否神经脉管侵犯不相关;敲低A431细胞中YAP后,肿瘤细胞的侵袭、迁移能力降低,细胞微丝变细、伪足变少;E-cadherin表达增加,Snail和β-catenin蛋白表达降低,p-AKT、p-S6及p-4EBP1蛋白表达降低。结论YAP在cSCC中高表达,YAP激活PI3K/AKT信号通路促进cSCC的侵袭、迁移及EMT过程。

基于PI3K/Akt/p53信号通路探讨白花蛇舌草乙酸乙酯萃取物诱导急性髓系白血病细胞凋亡的作用

目的通过评估白花蛇舌草乙酸乙酯萃取物(EAEHDW)对磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/p53信号通路传导调节作用,探讨其抑制急性髓系白血病M2型(AML-M2)细胞株Kasumi-1增殖及诱导凋亡的机制。方法利用乙酸乙酯从白花蛇舌草中萃取制备得到EAEHDW,高效液相色谱串联质谱装置检测样品纯度。设置空白组,将浓度分别为0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL的EAEHDW加入对数生长期的Kasumi-1细胞株,采用MTT法检测不同浓度EAEHDW作用不同时间后Kasumi-1细胞存活率,采用Annexin V/PI流式细胞术检测不同浓度EAEHDW作用24 h后Kasumi-1细胞凋亡情况,采用Western blot法检测不同浓度EAEHDW(0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL)作用24 h后Kasumi-1细胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)家族蛋白及PI3K/Akt/p53信号传导通路蛋白表达情况。结果不同浓度的EAEHDW干预后,细胞存活率较空白组明显降低,细胞凋亡率较空白组明显升高,且细胞存活率随着作用时间的延长和药物浓度的增加而下降越明显,细胞凋亡率随着药物浓度的增加而升高越明显,差异均有统计学意义(P均<0.05);不同浓度的EAEHDW作用于Kasumi-1细胞后,细胞中多聚ADP核糖聚合酶(PARP)、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、细胞色素C(Cyto-C)、p53蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、鼠双微染色体2(MDM2)、磷酸化MDM2(p-MDM2)蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)。结论EAEHDW可明显抑制髓系白血病Kasumi-1细胞增殖并诱导其凋亡,其机制可能与影响Caspase家族蛋白表达和抑制PI3K/Akt/p53信号通路导致p53激活有关。

益髓破血方对脑出血小鼠肠道菌群和PI3K/Akt信号通路调节的作用机制研究

目的:探讨益髓破血方对脑出血小鼠PI3K/Akt信号通路的调节及肠道菌群的影响。方法:SPF级C57BL/6J小鼠150只,随机分为假手术组、模型组和中药组,每组48只,模型组与中药组自体血注入法复制脑出血小鼠模型,假手术组只插入微量注射针数分钟不注血。灌胃干预后于1、3、7 d取材,观察小鼠神经功能评分,干湿重法观察脑含水量,HE染色观察脑组织病理学变化,ELISA法检测TNF-α、IL-4、IL-18含量,Western blot法检测PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表达水平,16s rDNA基因测序观察各组小鼠肠道菌群多样性、种属变化。结果:与模型组比较,中药组3 d、7 d神经功能评分与脑含水量降低(P<0.05),变性神经元减少(P<0.05),TNF-α、IL-18浓度降低(P<0.05),IL-4浓度升高(P<0.05),p-PI3K、p-Akt表达量下降,7 d较3 d更为显著(P<0.05)。模型组小鼠菌群多样性降低,瘤胃球菌科等相对丰度增加,益髓破血方可丰富菌群多样性,使乳酸杆菌属等相对丰度增加。结论:益髓破血方通过增加肠道有益菌,降低致病菌,丰富菌群多样性,以及调控PI3K/Akt通路改善脑出血继发性损伤。

布比卡因通过PI3K/AKT/mTOR通路对膀胱癌细胞凋亡和铁死亡的影响

目的 探讨布比卡因对膀胱癌细胞凋亡和铁死亡的影响及其机制。方法 常规培养人膀胱癌细胞(T24和5637)和人尿路上皮细胞(SV-HUC-1),MTT实验检测布比卡因细胞毒性,筛选合适处理浓度,将T24和5637细胞分为对照组、0.25、0.5和1 mmol/L布比卡因组、布比卡因+铁死亡激动剂(Erastin)组、布比卡因+铁死亡抑制剂(Fer-1)组细胞和布比卡因+PI3K激动剂(740Y-P)组。采用流式细胞术检测细胞凋亡率,相应试剂盒检测Fe^(2+)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和活性氧(ROS)水平,Western blot检测Bcl-2、Bax、细胞色素C、xCT、GPX4和磷脂酰肌醇3/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)相关蛋白表达。结果 0.25、0.5、1、2、4、8、16 mmol/L布比卡因均可明显抑制T24和5637细胞的活性(P<0.001),选择仅对癌细胞有毒性的0.25、0.5和1 mmol/L布比卡因进行后续研究。与对照组比较,随着布比卡因浓度增加,T24和5637细胞凋亡率、Fe^(2+)、ROS和MDA水平逐渐升高,GSH水平逐渐降低,差异有统计学意义(P<0.001);与1 mmol/L布比卡因组比较,布比卡因+Erastin组Fe^(2+)水平升高,而布比卡因+Fer-1组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示,与对照组比较,布比卡因组细胞色素C蛋白表达增高,Bax/Bcl-2、xCT、GPX4表达,以及PI3K p85α/PI3K、p-AKT(Thr308)/AKT、p-AKT(Ser473)/AKT和p-mTOR(Ser2448)/mTOR比值降低,差异有统计学意义(P<0.001)。验证实验结果显示,与对照组比较,布比卡因+740Y-P组细胞活力和GSH水平升高,Fe^(2+)水平和细胞色素C蛋白表达降低(P<0.001)。结论 布比卡因可通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路激活诱导膀胱癌细胞凋亡和铁死亡。

PKM2通过调控活性氧依赖的PI3K/Akt信号通路影响膀胱尿路上皮细胞癌细胞的侵袭能力

目的 探讨PKM2通过调控活性氧(ROS)依赖的PI3K/Akt信号通路对膀胱尿路上皮细胞癌细胞侵袭能力的影响。方法 将人膀胱癌T24细胞随机分为Control组、si-NC组、si-PKM2组和si-PKM2+IGF-1组。实时PCR检测细胞中PKM2 mRNA表达;CCK-8检测细胞增殖;Transwell小室法检测细胞侵袭和转移;Hoechst 33342荧光染色和流式细胞术检测细胞凋亡;ROS荧光探针法检测细胞中ROS水平;Western blotting检测细胞中PI3K、Akt、mTOR、caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达。结果 与人正常膀胱上皮SV-HUC-1细胞相比,人膀胱癌T24细胞中PKM2 mRNA相对表达量明显增加(P <0.05)。与Control组相比,si-PKM2组T24细胞中PKM2 mRNA相对表达量、细胞增殖能力、侵袭细胞数以及细胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值和Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P <0.05),细胞凋亡率、细胞中ROS相对水平以及细胞中Bax、caspase-3蛋白表达水平明显升高(P <0.05);与siPKM2组相比,si-PKM2+IGF-1组T24细胞中PKM2 mRNA相对表达量、细胞增殖能力、侵袭细胞数以及细胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值和Bcl-2蛋白表达水平明显升高(P <0.05),细胞凋亡率、细胞中ROS相对水平以及细胞中Bax、caspase-3蛋白表达水平明显降低(P <0.05)。结论 敲减PKM2可促进膀胱尿路上皮细胞癌细胞中ROS水平升高,抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路激活,进而发挥抑制细胞侵袭和促进细胞凋亡作用。

中医滋阴潜阳法对多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗大鼠PI3K/Akt信号通路、性激素及胰岛素相关指标的影响

目的探讨中医滋阴潜阳法对多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)伴胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)大鼠的磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信号通路、性激素及胰岛素相关指标的影响。方法以来曲唑加高脂饲料诱导建立多囊卵巢及胰岛素抵抗双重大鼠模型。采用滋阴潜阳法配合达英-35及二甲双胍干预,用免疫荧光法测定卵巢PI3K、Akt通路信号,实时荧光定量PCR检测卵巢PI3K、Akt途径信号分子mRNA表达及PI3K、Akt、胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate 1,IRS-1)、胰岛素受体(insulin receptor,INSR)蛋白表达,性激素、胰岛素生长因子-1(insulin-like growth factor 1,IGF-1),胰岛素敏感指数(insulin sensitivity index,ISI),观察卵巢组织形态变化。结果中医滋阴潜阳法能显著增加卵巢PI3K、Akt mRNA相对表达量(P<0.05),并能显著增加卵巢PI3K、Akt蛋白表达,上调IRS-1、INSR,降低血清睾酮(testos teron,T)、促黄体生成素(luteinizing hormone,LH)含量,调节ISI,增加卵巢颗粒细胞层数及黄体组织数量。结论中医滋阴潜阳法可提高PI3K/Akt通路信号表达水平,改善胰岛素抵抗及卵泡颗粒细胞功能,调节促黄体生成素/卵泡刺激素(LH/FSH)比值,控制LH异常增高,调节多囊卵巢综合征及胰岛素抵抗。

大黄素对精神分裂症大鼠海马组织PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响

目的:探讨大黄素调节磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对精神分裂症(SP)大鼠神经损伤及认知功能的影响。方法:通过注射地卓西平(MK-801)建立SP大鼠模型,并将正常大鼠为对照组,SP大鼠随机分为SP组、不同剂量(20、40、60mg/kg)大黄素组、60mg/kg大黄素+LY294002组,刻板行为及共济失调评分标准评价大鼠行为学功能;Morris水迷宫实验评估大鼠认知功能;试剂盒检测脑组织乙酰胆碱酯酶(AchE)、乙酰胆碱(Ach)活性;HE检测海马组织病理学变化;qRT-PCR检测脑组织中脑源性神经营养因子(BDNF)mRNA、钙依赖性蛋白激酶(CaMKⅡ)mRNA表达;Western blot检测PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白表达。结果:与对照组相比,SP组穿越平台次数、Ach活性、BDNF mRNA、CaMKⅡmRNA表达、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR表达显著降低,刻板行为及共济失调评分、平均逃避潜伏期、AchE活性显著增加(P<0.05);但不同剂量大黄素干预后,穿越平台次数、Ach活性、BDNF mRNA、CaMKⅡmRNA表达、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR表达显著增加,刻板行为及共济失调评分、平均逃避潜伏期、AchE活性显著降低,组间有差异(P<0.05);60mg/kg大黄素联合LY294002较60mg/kg大黄素组穿越平台次数、Ach活性、BDNF mRNA、CaMKⅡmRNA表达、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR表达显著降低,刻板行为及共济失调评分、平均逃避潜伏期、AchE活性显著增加(P<0.05)。结论:大黄素通过调节PI3K/Akt/mTOR信号通路改善SP大鼠认知能力,发挥神经保护功能。

调补心肾方通过活化PI3K/Akt/mTOR通路促进阿尔茨海默病5xFAD转基因小鼠突触可塑性相关蛋白的合成

目的探讨调补心肾方(党参、制首乌、枸杞子、黄芪等)对阿尔茨海默病5xFAD转基因小鼠突触可塑性的影响及机制。方法取5月龄雄性野生型(WT)小鼠和5xFAD转基因小鼠各18只,分别随机分为对照组(0.9%NaCl)、调补心肾方组(颗粒剂,4.18 g·kg^(-1))、安理申组(盐酸多奈哌齐,0.625 mg·kg^(-1)),每组6只。按照上述分组灌胃给药,每日1次,共60 d。采用透射电镜观察小鼠海马组织超微结构;Western Blot法检测小鼠皮层组织中Synaptophsin、PSD-95、p-NMDAR1、NMDAR1、p-CaMKⅡa、CaMKⅡa、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR蛋白表达水平。结果与WT对照组比较,5xFAD对照组小鼠海马CA1区突触的超微结构不规则,线粒体萎缩、减少,线粒体嵴断裂、消失,突触膜弯曲不规则,突触囊泡减少,突触后致密物(PDS)变薄甚至断裂;皮层组织中Synaptophsin、PSD-95、p-NMDAR1/NMDAR1、p-CaMKⅡa/CaMKⅡa、PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达均明显下调(P<0.05)。与5xFAD对照组相比较,5xFAD调补心肾方组小鼠海马CA1区突触的超微结构有明显变化,线粒体数量增加,突触囊泡增多,突触膜完整,突触后致密物有增厚现象;皮层组织中Synaptophsin、PSD-95、p-NMDAR1/NMDAR1、p-CaMKⅡa/CaMKⅡa、PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达明显上调(P<0.05)。结论调补心肾方可能通过活化PI3K/Akt/mTOR通路,促进突触可塑性相关蛋白合成,进而改善AD的认知功能障碍。