HGPRT缺陷型Lewis肺癌细胞株的筛选及其生物学特征

目的 为细胞融合等实验提供次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (HGPRT)缺陷细胞株。方法 用 8 氮杂鸟嘌呤 ( 8 AG)对Lewis肺癌细胞株L3 8进行长期渐进式给药 ,从中克隆筛选出HGPRT缺陷细胞株 ,并观察其体内成瘤和肺转移特性。结果 经过 1年的筛选鉴定 ,获得了在 2 0mg/L 8 AG和 16 40培养液中能长期稳定生长 ,在HAT选择性培养基中不能形成克隆的AL990 1细胞株。AL990 1和L3 8的染色体众数分别为5 8和 6 2 ,在C5 7BL/ 6小鼠体内成瘤率均为 10 0 % ( 10 / 10 ) ,肺转移率分别为 30 % ( 3/ 10 )和 70 % ( 7/ 10 )。结论 HGPRT缺陷型AL990 1细胞株基本保持了L3 8细胞的生物学特征 ,可作为制备Lewis肺癌DC融合疫苗的亲本抗原细胞。

伊氏锥虫体外培养株的建立及其HGPRT活性测定

用带虫培养法和带虫传代法建立了伊氏锥虫体外培养株，无论有、无饲养细胞，虫体均能快速增殖。培养７０ｄ以上，虫体仍保持原有生物学特性，对小鼠有感染性，活力旺盛，在体外能连续培养传代。虫数最高达２．４８×１０６／ｍＬ，群体增倍时间为８．８６～１０．８ｈ。液氮保存、复苏后的虫体可在饲养细胞上立即增殖。培养中发现由巨噬细胞转化的巨核母细胞对虫体生长有促进作用，经胰酶消化能与虫体一道连续传代。通过ＨＡＴ选择性培养液测定，伊氏锥虫对氨基喋呤不敏感，试验组虫体与对照一样生长良好，证明伊氏锥虫具有次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（ＨＧＰＲＴ）

应用RNA干扰技术体外抑制兔成纤维细胞HGPRT的表达及其核移植研究(英文)

次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hypoxanthine guaninephos phoribosyltransferase,HGPRT)的功能缺失与痛风、肾结石和雷纳综合症(Lesch-Nyhan Syndrome)等疾病相关.制作HGPRT基因表达降低的模式动物,将有利于人们对这种疾病的发病机理和治疗做进一步的研究.构建了针对HGPRT基因表达的shRNA干扰载体,并将质粒转染兔成纤维细胞,获得携带该干扰片段的转基因细胞系,经PCR鉴定转基因成纤维细胞克隆阳性率为83.3%.RT-PCR及Western blot检测结果表明转基因干扰成纤维细胞系HGPRT mRNA和蛋白质表达量明显降低.最后,以转基因成纤维细胞进行核移植,囊胚率为27.8%,与正常来源的成纤维细胞囊胚率相比较差异不显著.说明,通过RNAi可稳定干扰兔成纤维细胞HGPRT基因的表达,为进一步通过核移植技术建立HGPRT RNAi转基因兔模型创造条件.

日本血吸虫真核表达质粒pcDNA3/HGPRT的构建及序列测定

目的应用基因工程技术,对日本血吸虫次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase,HGPRT)进行亚克隆,试图构建真核重组DNA质粒pcDNA3-HGPRT。方法通过筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,克隆HGPRT基因片段,然后将目的片段亚克隆入真核表达载体pcDNA3。结果成功构建了真核重组DNA质粒pcDNA3-HGPRT,为进一步研究HGPRT的功能奠定了基础。

伊氏锥虫HGPRT缺陷株驯化及生物学特性观察

为了获得伊氏锥虫次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（ＨＧＰＲＴ）缺陷株，用不同浓度的８－氮鸟嘌呤（８－ＡＧ）和８－ＡＧ加紫外线照射的方法，对伊氏锥虫体外培养株进行了为期６０～１０１ｄ诱导驯化。结果，以每毫升含８－ＡＧ４０μｇ的培养液培养驯化，再配合紫外线照射，以及以每毫升含８－ＡＧ６０μｇ的培养液培养驯化，均获得了伊氏锥虫ＨＧＰＲＴ缺陷株。试验表明，培养虫体经过２～３个死亡期后逐步进入适应期，虫数升高到（１．５～２．５）×１０６／ｍＬ，饲养细胞通常于２～５ｄ变黑、崩解，应适时更换。培养驯化的１３株克隆虫株，经６－巯基鸟嘌呤（６－ＴＧ）抗性测定，１０株存活。克隆株在３倍量氨基喋呤的ＨＡＴ选择性培养液中死亡。生物学试验表明，ＨＧＰＲＴ缺陷株在无ＨＴ的培养液中生长良好，对小鼠致病力有下隆的趋势，虫血症和小鼠死亡时间比对照组延长１倍多。抗体凝集试验表明，ＨＧＰＲＴ缺陷株未发生抗原变异现象。超微结构显示，ＨＧＰＲＴ缺陷株的动基体、核和核仁比对照组明显增大，核膜电子密度区也明显增宽。

伊氏锥虫HGPRT基因的RT-PCR扩增及克隆

参照布氏锥虫次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ( HGPRT)基因的核苷酸序列 ,设计合成了 1对引物 ,引物间距为 63 0 bp,包含完整的 HGPRT基因。以伊氏锥虫湖北水牛株总 RNA为模板进行 RT-PCR扩增 ,琼脂糖凝胶电泳显示 ,获得 1条长约 63 0 bp的特异性条带 ,符合设计要求。扩增片段克隆于 p GEM-T Easy载体 ,经筛选鉴定 ,证明已获得了 HGPRT基因阳性克隆。核苷酸序列分析表明 ,克隆的 HGPRT基因在重组质粒中的连接向位和阅读框架是正确的。二级结构和疏水性分析表明 ,HGPRT基因产物具有复杂的空间结构 。

抗血吸虫DNA疫苗pcDNA3／SjHGPRT局部肌肉刺激与全身过敏实验

目的评价日本血吸虫DNA疫苗pcDNA3/Sj HGPRT的安全性。方法同体左右侧自身对比法对3只家兔进行局部肌肉刺激实验,22只豚鼠随机分为4组:无菌生理盐水阴性对照组、牛血清白蛋白阳性对照组、pcDNA3/Sj HGPRT低剂量组、pcDNA3/Sj HGPRT高剂量组,进行全身过敏试验。结果日本血吸虫DNA疫苗pcDNA3/Sj HGPRT对家兔局部肌肉刺激反应轻微,对豚鼠无全身过敏反应。结论日本血吸虫DNA疫苗pcDNA3/Sj HGPRT在该实验条件下安全。

Lesch-nyhan综合征1例报道——来自HGPRT基因突变的中国家庭

Lesch-nyhan综合征（Lesch-Nyhan syndrome, LNS）是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase, HGPRT）基因突变导致的一种先天性遗传病,该病由缺乏HGPRT酶引起.主要临床症状包括高尿酸血症、幼年型痛风性关节炎和神经系统发育障碍.相关研究报道了超过400个HPRT基因的突变位点,但Lesch-nyhan综合征在中国人口的发病率极低.本研究报道了一个16岁的伴有神经功能障碍和幼年型痛风性关节炎的男性患者,通过从外周血淋巴细胞中提取患者及其家族成员的DNA,并采用标准方法对HPRT基因的编码区和内含子-外显子侧翼进行测序,发现患者和他的母亲的HPRT基因的外显子3突变（Exon3：c.143G〉 A）,导致编码蛋白质中的精氨酸被组氨酸（p.R48H）取代,在红细胞中没有检测到酶的活性.目前,有研究报道了在几个欧洲家庭中存在相同的突变,但首次在中国家庭中发现.由于该病在中国的发病率低,因而临床医师在诊断LNS病例方面的经验不足.因此,应对高尿酸血症、痛风性关节炎和神经功能障碍的婴儿或青少年进行LNS筛查.

B（α）P诱导的V79细胞HGPRT位点突变的检测

在加与不加Ｓ９两种情况下，用Ｖ７９中国仓鼠细胞检测了Ｂ（α）Ｐ诱导的ＨＧＰＲＴ突变频率和细胞毒性。结果表明，无论加与不加Ｓ９混合液，Ｂ（α）Ｐ对Ｖ７９细胞都具有明显毒作用，但在不加Ｓ９时，不会导致６—巯基鸟嘌呤抗性细胞发生率的明显增加．在存在Ｓ９混合液时，Ｂ（α）Ｐ诱导的ＨＧＰＲＴ突变频率随Ｂ（α）Ｐ浓度的加大而明显增加。剂量在０．５—８μｇ／ｍｌ范围时，每１μｇ／ｍｌＢ（α）Ｐ诱发的Ｖ７９细胞ＨＧＰＲＴ位点突变频率为７—２４／１０６细胞。

氨利酮诱发V_(79)细胞HGPRT位点突变研究

本文观察了国产抗心血管疾病新药氨利酮在V_(79)细胞HGPRT位点（hgpoxanthine-guanine phos-phoribosyl transferase locus，次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酸位点）正向突变试验系统中的诱变作用。结果表明：氟利酮在-S9情况下，各浓度组突变体频率（mutant frequency、MF）与对照组相比均未达到MF≥3SMF的标准，也无剂量反应关系；但相同浓度在+S9情况下，除高浓度组（200μg/ml）外，其余三组MF随浓度增加而升高，且次高浓度组（100μg/ml）MF是对照组的3.8倍，故在本试验条件下氨利硐是需活化的诱变剂。

HGPRT试验在检测卷烟焦油诱变性中的研究

本文用中国仓鼠肺成纤维细胞(V_(79)细胞)进行次黄嘌呤-乌嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)位点试验,检测卷烟焦油的诱变性。结果发现牡丹,良友,大金狮和醒宝4种卷烟焦油的T/C值,分别为2.85、3.17、3.37、4.25。卷烟焦油量和诱变性之间,存在着剂量-反应关系,以125μg/ml为最大反应。经代谢活化后,cpm值均有增高趋势,提示卷烟焦油对哺乳类动物细胞的诱变性,属直接和间接诱变剂。

V_（79）细胞HGPRT位点正向突变试验方法探讨

本文在－Ｓ９或＋Ｓ９实验条件下，用ＥＭＳ或ＡＦＢ_１在Ｖ_（７９）细胞ＨＧＰＲＴ位点测试系统中获得良好的剂量反应关系。分别从未染毒组、ＥＭＳ或ＡＦＢ１染毒组分离１０个ＴＧ抗性突变克隆。经鉴定，抗性突变细胞是ＨＧＰＲＴ位点突变的Ｖ_（７９）细胞；所建立的诱变性测试方法是可靠的。此外，本文对选择开始后不同时间（０、６、１２或２４小时）加入选择剂的情况进行了研究。结果表明，６小时加入选择剂突变体频率略有升高，但升高无显著性；２４小时加入选择剂突变体频率明显下降，经统计分析差异有显著性。

C6细胞HGPRT缺陷株诱变的试验研究

通过N-甲基-N′-硝基亚硝基胍、8-氮鸟嘌呤、6-巯基鸟嘌呤紫外线照射的联合作用,试图建立C6细胞的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶缺陷株,为建立大鼠垂体促性腺激素杂交瘤细胞株奠定基础,但最终未能获得预期的能够被HAT培养基筛选的HGPRT-缺陷株,提示C6细胞株的HGPRT基因非常稳定,诱变方法难以使其突变缺失。

伊氏锥虫HGPRT基因cDNA的克隆及其在E.coli中的表达

根据引物设计的一般原则,参照伊氏锥虫HGPRT基因的核苷酸序列设计、合成一对引物,PCR扩增伊氏锥虫HGPRT基因cDNA。低熔点琼脂糖回收PCR产物,并将其克隆至pGEM-TEasy载体中,经酶切、PCR鉴定和序列分析,获得重组中间质粒pGEM/HGPRT。重组中间质粒pGEM/HGPRT经NcoⅠ和SalⅠ双酶切,回收目的片段HGPRT,以非融合形式插入原核表达质粒pBV220构建表达质粒pBV/HGPRT,转化大肠杆菌DH5α,42℃诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳和薄层扫描分析,表达产物HGPRT的分子量约为23kD,与理论推算值相符,表达率占总菌体蛋白的19%,经间接ELISA检测,表达产物能被伊氏锥虫阳性血清所识别。

V79细胞HGPRT位点正向突变试验方法初探

~v79细胞HGPRT位点正向突变试验具有快速、灵敏、可靠、可检测的遗传学改变多等优点,已在遗传毒理学诱变机理研究,诱变剂的检测和致癌剂的筛试等领域得到越来越广泛的应用。

V79细胞HGPRT基因位点突变实验在医疗器械遗传毒性评价中的应用

目的医学研究已证明,大部分肿瘤是环境中各种致癌因素与机体基因相互作用的结果,环境化学物质是人类肿瘤发病的主要原因。较以往动物实验和细菌回复突变实验相比,V79细胞HGPRT基因位点突变实验具有快速、灵敏、可靠、可检测遗传学改变等优点,已在遗传学机制研究、诱变剂的筛选、致癌剂、抗癌剂的筛选等领域得到越来越广泛的应用。因此,引进对医疗器械或医用生物材料检测遗传毒性新实验方法用于医疗器械遗传毒性检测。

大气飘尘的致突变性检测研究——中国仓鼠V_(79)细胞HGPRT位点突变试验

本文采用中国仓鼠肺成纤维细胞(V_(79)细胞),进行次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核糖转移酶位点(HGPRT Locus)试验,检测上海市区飘尘的诱变性。发现污染物量与诱变性之间呈现剂量—反应关系,以浓度150μg/ml为最高。样品经代谢活化后其诱变性(指T/C值)均有增高的趋势,提示飘尘对V_(79)细胞具有轻微的、间接的诱变倾向。市区3个飘尘样品之间,其诱变性无本质上差异。

MAPO对CHO/HGPRT位点的致突变作用

中国仓鼠卵巢细胞/次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（CHO/HGPRT）试验已广泛应用于工业和环境化合物遗传毒理学评价和突变机理研究。 本文对CHO/HGPRT测试方法中的各种条件进行了探索,包括CHO细胞株的生物学特性;选择剂（6-TG）的毒性;表达和选择时间的选择以及S9活化系统的用量。在此基础上,选用已知直接诱变剂MNNG和间接诱变剂DMN进行了方法验证,并评价了三(2-甲基-1-氮内啶硝化氧（MAPO）对CHO/HGPRT位点的致突变作用。

应用HGPRT位点试验研究空气污染物的诱变性

本文采用中国仓鼠肺成纤继细胞(V70细胞)进行次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶位点（Hypoxanthine-guanlne Phosphoribosyltransferase locus,HGPRT LOCUS）试验,检测上海市长宁区及闸北青云、彭浦三个地区飘尘样品,四种卷烟焦油（其中3种是牡丹、醒宝、大金狮国产卷烟,1种是进口的良友牌卷烟）及以烧混合食油的烹调油烟冷凝物的诱变性。结果表示方式,以实验组与试剂对照组的3H-TdR掺入量（cpm）之比值（T/C）来表示诱变性。