6×His-tag在抗菌肽表达纯化中的应用及其对抗菌肽活性的影响

为方便抗菌肽的体外表达和纯化,以蝎子防御素为对象,在其编码基因末端加入6×His-tag,在酵母表达系统中表达,获得有活性的防御素Sd和融合蛋白Sd-His。进一步纯化、体外抑菌活性及热酸稳定性等试验发现,6×His-tag不但没有降低防御素的抑菌活性,反而有稍微的增强趋势。结果表明,6×His-tag可用于抗菌肽的融合表达且不影响其活性,为抗菌肽的表达纯化提供了一个更简便有效的方法。

MS-302三道测量分析系统的应用及HI-6在离体膈神经-膈肌上抗梭曼的作用机制探讨

目的探讨抗神经毒化合物HI-6在离体膈神经-膈肌上抗梭曼的作用机制。方法采用MS-302三道测量分析系统,观察大鼠离体膈神经-膈肌的收缩功能,同时,测定膈肌乙酰胆碱酯酶(AChE)活性,观察药物对膈肌AChE活性的直接影响。结果(1)采用MS-302三道测量分析系统对膈神经-膈肌标本强直收缩曲线下的面积进行测量,较为直接地反映了膈神经-膈肌标本的生理功能,结果精确。(2)HI-6 10和100μmol/L对正常膈神经-膈肌收缩功能影响不明显,1 mmol/L对正常膈神经-膈肌收缩功能有抑制作用。HI-6 10μmol/L预防和治疗给药时,对梭曼抑制的标本收缩功能既没有保护作用也没有拮抗作用;100μmol/L给药有一定的保护和拮抗作用;剂量增加到1 mmol/L时,保护作用和拮抗作用都明显增强,且保护作用在30 min内最佳。(3)预先给予HI-6不能减弱梭曼对大鼠离体膈肌AChE的抑制,梭曼中毒后给予HI-6对梭曼抑制的膈肌AChE活性无显著影响。结论HI-6对梭曼抑制的离体膈神经-膈肌收缩功能的恢复可能是直接生理对抗作用,在本实验条件下未见膈肌酶活力有明显的恢复。

利用N-端融合(His)_6标签观察家蚕核型多角体病毒泛素蛋白的亚细胞定位

为了给家蚕核型多角体病毒(BmNPV)泛素蛋白(UB)的功能研究提供亚细胞定位信息,利用Red重组系统和BmN-PV的bacmid系统,进行2次同源重组,成功地将(His)6标签编码序列引入到BmNPV泛素基因(ub)起始密码子ATG和第2个密码子CAA之间,使得表达的BmNPV UB的N-端融合(His)6标签。通过对(His)6的免疫荧光分析观察到BmNPV UB在BmN细胞中呈现3种方式的亚细胞定位:均匀地分布于整个细胞;主要分布于细胞核;分布于细胞核,同时在细胞质中出现零星的点分布。BmNPV UB具有多种不同的亚细胞定位方式,提示其功能的多样性。

HI-6对梭曼染毒大鼠膈肌胆碱酯酶的重活化作用

目的研究HI-6对膈肌局部梭曼染毒大鼠膈肌胆碱酯酶的重活化作用。方法将大鼠麻醉后固定,沿腹正中线切开腹腔,暴露膈肌。梭曼局部染毒膈肌1和10 min后,局部或全身给予HI-6,于给药后24和72 h处死大鼠,取出中毒部位膈肌,用硫胆碱酶法显示终板的AChE活性,观察HI-6对胆碱酯酶的重活化作用。结果膈肌局部梭曼中毒1和10 min后,局部给予HI-6 24和72 h对局部中毒膈肌胆碱酯酶均没有重活化作用,在光镜下观察不到棕褐色椭圆形的运动终板;而膈肌局部梭曼中毒1和10 min后,全身给予HI-6对局部中毒膈肌胆碱酯酶有明显的重活化作用,在光镜下可见到肌纤维上又出现了棕褐色椭圆形的运动终板。结论HI-6全身给药对早期膈肌局部中毒的神经运动终板胆碱酯酶有重活化作用。

新型真核表达质粒pcDNA6/myc-his-EGFP B的构建及其在重组基因表达中的应用(英文)

增强型绿色荧光蛋白(EGFP, enhanced green fluorescent protein)、myc抗原和6×His已在众多真核表达载体中用作重组蛋白的表达标记,EGFP能发出的绿色荧光,myc抗原能用相应的抗体检测,6×His能被相应的树脂特异吸附。但目前为止,没有一个质粒表达载体能够同时整合三者的功能。本研究构建了一个能够同时整合EGFP、myc抗原和6×His功能的新型真核质粒表达载体,我们将其命名为pcDNA6/myc-his-EGFP B。值得注意的是,为确保目的基因与EGFP基因融合表达后,融合表达产物各组成部分能够保持原有的生物活性,我们运用LINKER程序在EGFP基因的5’端设计了一段编码八肽的连接DNA序列。将一段含有人白细胞介素2(IL-2, humaninterleukin 2)信号肽编码序列的基因亚克隆进pcDNA6/myc-his-EGFP B的多克隆位点中,使之与EGFP、myc抗原和6×His融合表达,构建成质粒pMHES。用pcDNA6/myc-his-EGFP B和pMHES转染2.2.15细胞,48h后成功观察到绿色荧光;用pcDNA6/myc-his-EGFP B尾静脉注射Balb/c小鼠,8h后在小鼠肝脏冰冻切片中同样观察到绿色荧光。用同源建模软件Modeller8V2模拟IL-2与EGFP、myc抗原和6×His融合表达产物的三维结构,结果表明:IL-2、EGFP、myc和6×His各部分互不干扰,连接八肽具有一定的柔性。以上结果表明pcDNA6/myc-his-EGFP B可望作为外源基因在哺乳动物细胞中表达研究和基因治疗的新型载体。

双吡啶单肟HI-6药代动力学的动物种间相关性

给5种哺乳动物iv双吡啶单肟HI—6 20mg/kg,其药物代谢动力学均呈二室开放模型,部分药动学参数可表示为体重的指数函数。将5种动物的采血时间转换为生理等价时间,建立了预测人血浆中HI—6浓度的经验函数式。经人体资料验证,预测值与实测值基本一致。

应用6-σ方法分析薄型覆铜板Hi-Pot试验失败原因与改进方案

应用6-σ方法、工具研究分析了薄型覆铜板Hi-Pot试验失败的原因并提出了针对性的改进方案。

基于Fe_3O_4@SiO_2/Ni-NTA磁性微球的His-tag融合蛋白纯化体系的建立

合成了表面共价结合Ni-氨基三乙酸(Ni-NTA)基团的Fe3O4@SiO2微球,这种磁性微球可用于分离含有His-tag标签的融合蛋白.微球中心由尺寸约402 nm的Fe3O4微粒组成,赋予了微球极好的磁性分离和离心分离的特性.应用Fe3O4@SiO2/Ni-NTA磁性微球对含有6×His-tag(6聚组氨酸)标签的蛋白进行了分离纯化,结果表明,10 mg Fe3O4@SiO2/Ni-NTA微球能够从10 mL重组蛋白裂解液中纯化出约1 mg带有6×His-tag标签的融合蛋白.微球的高效分离效果使其能够用于含量较低的带有6×His-tag标签蛋白的分离纯化.

His-tag对亚油酸异构酶在大肠杆菌中可溶性表达的影响

为了研究6×His-tag对来源于痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶(PAI)可溶性重组表达的影响,我们构建了三种大肠杆菌重组菌株,表达了三种重组PAI:C端带有His-tag亲和标签、N端带有His-tag亲和标签和不加His-tag亲和标签。通过SDS-PAGE和Westernblot分析重组蛋白表达情况,并利用气相色谱检测酶活。实验结果表明:在相似的诱导表达条件及生长状态下,三种大肠杆菌重组菌株均成功表达了具有亚油酸异构酶活性的重组蛋白质,三种重组PAI的表达总量相当,6×His-tag的融合表达促进了PAI蛋白质包涵体的形成,而C端6×His-tag带来的影响最大。

NT4-TAT-His-PR39融合基因cDNA的构建及意义

目的:探讨PR39对急性缺血心肌的保护作用,构建可分泌表达PR39的神经生长因子4(NT4)-TAT-His-PR39融合基因cDNA。方法:采用互为模板、引物的PCR技术,制备两端含有酶切位点的PR39 cDNA片段。通过常规分子生物学方法,将其与编码NT4信号肽及引导肽、TAT及6×His基因序列用T4 DNA连接酶相连,将NT4-TAT-His-PR39装入质粒pBV220中。结果:融合基因NT4-TAT-His-PR39的长度为421 bp,限制性内切酶切图谱显示,目的带的大小略超过marker的400 bp的位置,证实已经成功地将PR39 cDNA重组到NT4-TAT-His序列的下游。基因测序结果及DNAsis软件分析结果表明,NT4-TAT-His-PR39的全序列与实验设计的序列完全一致。结论:成功地构建能分泌表达PR39、并具穿膜功能和标签的融合基因NT4-TAT-His-PR39。

新型1,6-二(1,2,4-三唑-1-基)己烷的Ag(Ⅰ)配合物合成及其对阴离子污染物吸附性能的表征

为了获得高效去除阴离子污染物的新型金属有机框架材料,首先制备1个具有良好柔韧性的1,2,4-三唑类多齿衍生物功能配体1,6-二(1,2,4-三唑-1-基)己烷(L),在此基础上采用水热合成法制备了1个结构新颖的Ag(Ⅰ)配合物,即{[Ag(H_2O)(L)]·NO_3}n,产率为53%.对该配合物的晶体学结构进行表征,并且使其与Cr_2O_7^(2-)和MnO_4^-发生阴离子交换,考查配合物去除阴离子污染物的性能.研究结果表明,配合物{[Ag(H_2O)(L)]·NO_3}n具有新颖的一维链状结构.吸附2种阴离子后配合物的颜色变深,而对应的阴离子溶液颜色变浅.吸附24 h后Cr_2O_7^(2-)和MnO_4^-浓度分别下降了53%和67%,配合物的NO_3^-离子浓度也出现降低.这一结果证实了该配合物确实能够通过离子交换反应有效捕获溶液中的Cr_2O_7^(2-)和MnO_4^-阴离子污染物.

缺血缺氧脑损伤大鼠IL-6和TNF-α的变化及其临床意义

目的:探讨缺血缺氧脑损伤大鼠白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的动态变化及其临床意义。方法:90只Wistar大鼠随机分为对照组和实验组,再将实验组按造模后4h、8h、12h、24h和48h不同时点分为5个亚组。利用夹闭双侧颈总动脉,并进行缺氧的方法制备模型。以放射免疫分析(RIA)测定血清和脑组织中IL-6和TNF-α的变化。结果:造模后48h内,血清和脑组织中IL-6和TNF-α的水平呈动态变化。实验组中各亚组的两者含量均明显高于对照组(P<0.01或P<0.05)。血清和脑组织中两者分别在24h和12h时达到峰值。结论:缺血缺氧后不同时点IL-6和TNF-α的含量呈动态变化;两者可作为缺血缺氧后脑组织损伤程度及修复的临床指标。

苯基-(3,5-二叔丁基-4-羟基苄基)丙二酸二(1,2,2,6,6-五甲基-4-哌啶)酯的合成

以苯基丙二酸二乙酯、N-甲基-2,2,6,6-四甲基-4-哌啶醇和2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚为主要原料,合成了紫外线吸收剂苯基-(3,5-二叔丁基-4-羟基苄基)丙二酸二(1,2,2,6,6-五甲基-4-哌啶)酯。重点考察了苯基丙二酸二乙酯和N-甲基-2,2,6,6-四甲基-4-哌啶醇的酯交换反应、苯基丙二酸双(1,2,2,6,6-五甲基-4-哌啶)酯与4-羟基-3,5-二叔丁基苄基氯的烃基化反应。结果表明,微纳米碳酸钾具有较好的催化作用,产品总收率达到80%。化合物的结构通过1HNMR和13CNMR进行了表征。

HI-6和阿托品并呼吸机治疗氧化乐果中毒呼吸肌麻痹的实验研究

目的 探讨不同剂量HI- 6和阿托品联合呼吸机治疗氧化乐果中毒所致呼吸肌麻痹的疗效。方法 实验大鼠给予 2LD50 的氧化乐果染毒 ,以 1 0mg/kg阿托品对抗胆碱能症状。当大鼠出现呼吸频率减慢、呼吸困难时即行气管插管并辅助机械通气。A组阿托品继续原剂量治疗 ,B、C、D组HI- 6依次按50mg/kg、 80mg/kg、 1 0 0mg/kg于呼吸机治疗即刻及治疗后 1、 2、 3h肌肉注射 ,阿托品减至首剂量的 1 / 3～2 / 3 ,以维持阿托品化为度。经联合治疗 1、 2、 3h后试行脱机 ,以任何一次脱机超过 60min视为联合治疗成功。一次脱机后大鼠存活超过 60min或第 3次脱机后迅速死亡 ,均需取游离膈神经膈肌标本经MS - 30 2生理药理分析仪作膈肌功能测定。结果 A组膈肌功能恢复不佳 ,无一只大鼠脱机成功 ;B、C两组膈肌功能恢复良好 ,3h脱机成功率分别为 80 %和 60 % ,明显高于A组 (P <0 0 1 )。D组膈肌功能测定虽较好 ,但脱机成功率很低。外加乙酰胆碱 (ACh)后 ,B、C、D组膈肌功能均随时间延长而逐渐变小。结论 只有适量HI- 6联合阿托品并辅助呼吸机治疗氧化乐果中毒所致的呼吸肌麻痹 ,才能加速中毒大鼠膈肌功能恢复 。

江浙蝮蛇神经生长因子在大肠杆菌中的表达及纯化

将江浙蝮蛇（ＡｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎｈａｌｙｓＰａｌａｓ，Ａ．ｈ．Ｐ．）神经生长因子（Ｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＮＧＦ）基因克隆于分泌型原核表达载体ｐＥＴ２２ｂ＋，以Ｃ端融合了６个组氨酸的形式在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中进行了ＩＰＴＧ诱导表达。ＳＤＳＰＡＧＥ分析确定有一比理论值略大的诱导表达条带，其表达量占全菌蛋白质的２０％左右，且表达蛋白质主要是以包涵体的形式存在。用６ｍｏｌ／Ｌ的盐酸胍溶解包涵体后，利用固定化金属离子（Ｎｉ２＋）配体亲和层析一步纯化目的蛋白质，纯度可达８０％左右。对该重组肽进行变复性研究。利用ＰＣ１２细胞进行生物活力测定，证明表达产物具有ＮＧＦ生物活力。

重组人胰岛素制备工艺

为了提高重组人胰岛素的表达量,用E.coli发酵表达(His)6-Arg-Arg-人胰岛素原[(His)6-Arg-Arg-human proinsulin,RRhPI],并对影响RRhPI高效表达的各主要因素以及下游纯化工艺的各关键步骤进行优化。研究表明,RRhPIE.coli在最优培养基:5 g/L胰蛋白胨,2 g/L谷氨酸,7 g/L酵母浸膏,0.5 g/L酸铵,2.5 g/L葡萄糖,2.7 g/L甘油,100 mg/L氨苄青霉素,50 mg/L卡那霉素,pH7.2的条件下,用发酵罐进行发酵,在对数生长中期加入0.5 mmol/L IPTG诱导4 h,发酵过程中通过补料和转速调节,每升培养基能收获湿菌体51.2 g,包涵体16.2g。在下游纯化工艺中,初步纯化前包涵体溶解液中一定浓度的β-巯基乙醇以及复性液中一定浓度的氧化型谷胱甘肽将有助于RRhPI的复性。经过工艺条件的优化,人胰岛素最终收率可达74 mg/L培养基。

人胰岛素原在基因工程菌中的高效表达

目的 构建RRhPI-pQE4. 0E .coliM15表达系统 ,以高效表达 (His) 6 -Arg -Arg -人胰岛素原。方法 正交法优化发酵条件 ,通过湿菌体收率、包涵体收率及发酵液A60. 0 的测定对优化结果进行评估 ,并进一步分析发酵过程中主要因素对高密度发酵和高效表达的影响。结果 发酵条件优化后 ,每升发酵培养基可得湿菌体约 4 3g ,包涵体约 14g(湿重 )。结论 优化发酵条件可使湿菌体及包涵体的收率提高。

基于边界积分方程法的六辊轧机辊系变形分析

精确的板形控制理论对提高带钢质量具有重要意义,而辊间压扁理论是板形控制理论的重要组成部分。针对半无限体模型在计算辊间压扁时的误差问题,给出一种计算辊间压扁的新模型。应用有限元法模拟有限长度半无限体两侧面的位移场,建立侧面的位移衰减函数。基于边界积分方程法,得到有限长度半无限体在表面分布力作用下的数值解,从而建立求解有限长度半无限体的解析模型,并用有限元法验证该模型的准确性。基于该压扁模型建立新型六辊轧机辊系变形模型,所得结果与有限元法,半无限体模型和费普尔公式进行对比,发现新模型所得结果与有限元法更加接近。考虑板宽和窜辊量的影响,利用新模型与半无限体模型、费普尔公式进行对比计算,发现新模型所得辊间压力和压扁优于其他两模型,特别是在轧辊边部区域比其他两模型更符合实际。

NGAL蛋白Ni^(2+)-金属鏊合层析纯化及其鉴定

背景与目的 :通过对新癌基因NGAL的原核融合表达产物进行Ni2 +_金属鏊合层析纯化及其MALDI-TOF-MS鉴定 ,最后获得一定丰度与纯度的NGAL蛋白。 材料与方法 :将 pDsbA2.0 -NGAL融合表达载体转化大肠杆菌 ,进行IPTG诱导表达 ,SDS -PAGE分析表达产物的产量与可溶性 ,然后将表达产物进行Ni2 + _金属鏊合层析纯化及其MALDI-TOF-MS鉴定。 结果 :将 pDs bA2.0 -NGAL融合表达载体进行IPTG诱导表达 ,SDS-PAGE分析显示表达的NGAL融合蛋白产量高、可溶性好 ;对表达的NGAL蛋白进行Ni2 + _金属鏊合层析纯化后其纯度>95 %,MALDI-TOF-MS鉴定结果提示纯化后NGAL蛋白分子量与其理论分子量的误差仅为0.91‰。结论 :通过对新癌基因NGAL的原核融合表达产物进行Ni2 + _金属鏊合层析纯化及其MALDI-TOF-MS鉴定 ,最后确切获得了一定丰度电泳纯的NGAL蛋白 。

新型rhNDPK-A工程菌的构建及表达产物纯化研究

目的 :为简化纯化过程 ,获得有临床研究价值的rhNDPK -A蛋白 ,构建新型rhNDPK -A基因的表达质粒 ,利用 6×His标签以Ni+ -NTA亲和层析柱纯化蛋白。方法 :将抑癌基因nm2 3-H1从质粒PBVNMH1中亚克隆于带有纯化标签的表达载体pQE4 0中。IPTG诱导表达目的蛋白。通过镍离子螯合层析柱一步纯化法纯化目的蛋白。结果 :pQE - 4 0中亚克隆的nm2 3-H1序列完全正确 ;目的蛋白在大肠杆菌M15中的表达量可达 4 9.6 % ;Ni+ -NTA亲和层析柱一步纯化后蛋白纯度为 93%。结论 :构建了带有 6×His纯化标签的新型rhNDPK -A基因表达质粒pQE -nm2 3H1,所构建质粒能高效表达目的蛋白 ,利用Ni+ -NTA亲和层析柱简便高效地纯化了表达产物。