人HIF-1α基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的构建人缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因的重组腺病毒载体,并观察其对HepG2细胞的转染情况。方法采用基因工程技术,经过亚克隆将人HIF-1α基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用pAdEasy系统进行细菌内同源重组后,经脂质体转染HEK293细胞,进行重组腺病毒的包装、扩增。采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,进行病毒滴度的测定和对HepG2细胞感染效率的监测。结果酶切鉴定及PCR结果证明重组腺病毒载体成功,人HIF-1α重组腺病毒滴度达1.15×1010pfu/ml,阴性对照腺病毒的滴度为8×1010pfu/ml,并对HepG2细胞具有很强的感染力。结论应用细菌内同源重组法成功构建了含人HIF-1α基因的重组腺病毒载体。

HIF-1α基因沉默对人肺腺癌细胞A549裸鼠移植瘤生长及survivin表达的影响

目的观察缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因沉默对肺癌的抑瘤效应和survivin表达的影响。方法将实验用肺腺癌A549细胞分为空白对照组、无意义序列转染组和实验组,接种裸鼠,建立裸鼠荷瘤模型,观测HIF-1α-MiRNA对裸鼠皮下移植瘤的生长抑制作用和对survivin表达的影响。采用免疫组化SP法,检测HIF-1α和survivin蛋白在裸鼠移植瘤中的表达。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测HIF-1α和survivin mRNA的表达。采用原位末端标记(TUNEL)法检测肿瘤组织中细胞凋亡。结果实验组裸鼠肿瘤的生长速度较空白对照组、无意义序列转染组明显减慢(P<0.05)。接种60 d后处死裸鼠,实验组裸鼠的肿瘤重量为(0.59±0.28)g,明显轻于空白对照组[(1.90±0.18)g]和无意义序列转染组[(1.66±0.24)g,P<0.01]。实验组肿瘤组织中HIF-1αmRNA和蛋白的相对表达量分别为(0.45±0.04)%和(24.56±5.83)%,survivin mRNA和蛋白的相对表达量分别为(0.32±0.02)%和(29.08±3.99)%,均明显低于空白对照组、无意义序列转染组(P均<0.05)。但实验组肿瘤组织中凋亡细胞的数量显著高于对照组。结论以HIF-1α为靶点的基因治疗,可能通过下调靶基因survivin的表达促进肺癌细胞凋亡,发挥抑制肿瘤生长的作用。

siRNA沉默HIF-1α基因对人卵巢癌细胞SKOV3/DDP耐药的影响

卵巢癌的治疗主要以手术与化疗相结合,化疗在其治疗中占据重要位置,而耐药的产生往往成为临床治疗的障碍。研究表明缺氧诱导因子-1α表达与肿瘤的耐药密切相关[1],应用抑制HIF-1α的表达可增加乏氧肿瘤细胞系对依托泊甙的化疗敏感性[2]。

藏羊HIF-1α基因CDS区多态性及生物信息学分析

应用DNA混池测序法检测藏羊HIF-1α基因CDS区的多态性,并采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、二级结构等方面进行预测和分析。结果表明,在藏羊群体中发现HIF-1α基因CDS区有4个SNP,其中901G→A为错义突变,其余为同义突变;HIF-1α基因包含1个2 295 bp的开放阅读框,编码764个氨基酸,其编码蛋白属于亲水性蛋白;二级结构主要以无规则卷曲和α基因螺旋为主;HIF-1α基因编码产物氨基酸同源分析表明,藏羊HIF-1α编码的氨基酸与山羊、牦牛的遗传距离较近,具有高度同源性。

高原鼠兔HIF-1α基因真核表达载体的构建及细胞表达和定位

利用PCR从克隆质粒PMD18-T-pHIF-1α中扩增鼠兔HIF-1α;构建重组质粒pcDNA3.0/6Xmyc-p HIF-1α,用重组质粒转染HEK-293T,HeLa和COS-7细胞,通过免疫印迹分析,检测HIF-1α表达蛋白在细胞中的分布。EcoRI和XhoⅠ酶切鉴定和序列分析表明,构建的pcDNA3.0/6Xmyc-pHIF-1α真核表达载体序列正确;HIF-1α在真核细胞中能够正确表达,且其表达产物主要存在于细胞核中。

hif-1α基因沉默对宫颈癌HeLa细胞增殖及对顺铂敏感度的影响

目的研究靶向干扰hif-1α基因表达后,对HeLa细胞增殖及其对顺铂敏感度的影响。方法构建针对hif-1α基因的干扰载体并转染HeLa细胞,G418筛选阳性克隆,经RT-PCR与Western blot鉴定抑制效果,用MTT法观察抑制hif-1α基因表达后,HeLa细胞增殖的变化,RT-PCR检测在低氧培养条件下HeLa/shRNA-i细胞葡萄糖转运蛋白1mRNA的水平,利用MTT法观察抑制hif-1α表达后HeLa细胞对顺铂敏感性的改变。结果 HeLa/shRNA-i细胞与对照细胞组相比,hif-1α基因mRNA表达降低了62%,蛋白表达明显降低,MTT显示细胞吸光度值降低,低氧条件下葡萄糖转运蛋白1mRNA表达降低,对顺铂药物的敏感度增高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 hif-1α基因的沉默可以抑制HeLa细胞的增殖并且能够增强HeLa细胞对顺铂的敏感度。

短发夹状RNA使骨肉瘤细胞缺氧诱导因子HIF-1α基因沉默

目的 构建低氧诱导因子HIF-1α发夹状小干涉RNA真核表达载体,观察发夹状双链小干涉RNA对骨肉瘤细胞HIF-1的转录后的基因沉默效果。方法 体外合成两对互补的寡核苷酸链,分别针对缺氧诱导因子HIF-1αmRNA序列的两个靶位点。退火形成双链,插入pSilencer^(TM)neoU_62.1真核表达载体。将构建好的载体经脂质体介导转染骨肉瘤SaOS-2细胞,观察HIF-1α基因的沉默效果。半定量RT-PCR检测HIF-1αmRNA的抑制程度,免疫荧光和免疫印迹(Western Blot)检测HIF-1α蛋白表达情况。结果 测序证实成功构建HIF-1α发夹状小干涉RNA真核表达载体。转录生成的发夹状小干涉能够特异抑制HIF-1α表达。RT-PCR结果显示针对HIF-1αmRNA序列的两个靶位点的沉默效果分别为69％和92％,免疫荧光显示转染后荧光强度显著降低,免疫印迹显示两个靶位点的发夹状小干涉RNA分别使HIF-1α蛋白表达下降66％和90％。结论 通过体内转录生成的发夹状小干涉RNA能够使骨肉瘤细胞缺氧诱导因子HIF-1α基因沉默。

HIF-1α基因多态性与VCI及MRI表现的相关研究

目的 探讨血管性认知障碍各亚型患者间及其与正常对照组的认知功能、MRI表现期HIF-1α基因多态性的差异.方法 采用简易智能状态检查量表.认知能力筛查量表和简易智能-认知能力联合检查量表对68例血管性认知障碍患者(无痴呆型血管性认知障碍43例.血管性痴呆25例)和50例正常对照者的认知功能进行评价,通过磁共振成像分析其影像学参数的差异,检测HIF-1α基因多态性.结果 与对照组比较,血管性认知障碍各亚组患者认知功能评分呈递减趋势(P<0.05),血管性认知障碍各亚组患者皮质下白质疏松和腔隙性脑梗死评分均高于对照组(P<0.05),其影像学异常改变在进展为痴呆后更为明显.两组rs4899056基因频率和基因型分布频率差异有统计学意义(P<0.05),VCI组TT基因型分布频率较正常组低,rs10873142基因型分布频率差异有统计学意义(P<0.05),VCI组CC基因型分布频率较正常组低.正常组连锁不平衡分析发现单倍型(rs3783752-rs4899056-rs1957757)高度连锁(D'>0.9,r2>0.8),在两组中定义单倍型块(rs3783752-rs4899056-rs1957757-rs10873142)的单倍型频率在两组间分布存在差异,其中ATTC,GCCC,GCCT单倍体基因型两组差异有统计学意义(P<0.05).结论 血管性认知障碍患者的影像学异常改变和HIF-1α基因多态性的差异可部分反映不同亚型的病理改变,但对认知障碍程度的反映尚缺乏敏感性.

人HIF-1α基因重组减毒沙门氏菌载体的构建及稳定性检测

利用RT-PCR方法从低氧预处理的A549细胞中获得HIF-1α基因片段,将其定向插入pIRES-SEQ质粒NheⅠ、MLuⅠ2个酶切位点之间,得到真核表达载体pIRES-HIF-1α;采用电转化方法将其电转化入减毒沙门氏菌Ty21α中,获得重组减毒沙门氏菌菌株TPH;转染A549细胞,RT-PCR法检测HIF-1α基因表达,ELISA方法检测HIF-1α蛋白表达;TPH菌株在氨苄青霉素(+)和氨苄青霉素(-)LB培养板上分别传代40代,每10代提取质粒进行PCR及酶切鉴定.结果表明:试验成功构建了携带HIF-1α基因的重组减毒沙门氏菌TPH,其可在体外细胞中稳定表达HIF-1α基因及蛋白,TPH可稳定遗传.

中甸牦牛HIF-1α基因表达差异分析

[目的]以云南省迪庆州香格里拉市高山放牧和昆明市东郊小哨示范牧场圈养育肥1.5年以上的成年中甸牦牛为研究对象,比较两种饲养条件下组织器官中HIF-1α基因mRNA表达差异。[方法]采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测HIF-1α基因在不同饲养条件下中甸牦牛不同组织中的表达水平。[结果]结果表明:中甸牦牛不同器官组织HIF-1α基因的相对表达量差异极显著(P<0.01);在不同饲养条件下相对表达量差异显著,高山放牧显著高于异地圈养育肥(P<0.05);在高山放牧的中甸牦牛肝脏中相对表达量显著高于圈养育肥的(P<0.05)。[结论]中甸牦牛不同组织器官中HIF-1α基因广泛表达且具有组织特异性,在不同海拔饲养的相对表达量具有显著差异,为牦牛的耐低氧机制研究提供了理论依据。

利用CRISPR/Cas9系统构建人HIF-1α基因敲除细胞株

在人源HIF-1α的PAS结构域内设计特异性靶点,构建Cas9-gRNA-HIF-1α敲除质粒,并将其转染至细胞后经嘌呤霉素筛选出21个单克隆细胞株,随后通过酶切、测序分析及下游基因验证等方法检测,最后得到一株特异性敲除HIF-1α的纯合子细胞(H20)。所设计的靶点能够有效地编辑HIF-1α,将为在其他细胞中通过CRISPR/Cas9系统特异性敲除HIF-1α提供方法借鉴。与此同时,也将为后续揭示HIF-1在由正常排卵事件演变成卵巢肿瘤过程中的作用机制奠定基础。

运用随机森林分析糖尿病视网膜病变的影响因素与HIF-1α基因多态性的关系

目的采用随机森林算法分析糖尿病人群合并视网膜病变的影响因素以及与HIF-1α基因多态性的关系。方法选取糖尿病合并视网膜患者病变200例（DR组）和糖尿病不合并视网膜病变患者200例（NDR组）,收集各临床及生化指标,并行HIF-1α基因多态性检测,利用随机森林方法进行降维,logistic回归对降维后的变量进行分析。结果两组HIF-1α基因多态性基因型频率比较差异有统计学意义（χ^2=9.88,P=0.01）,经随机森林算法筛出6个重要性得分最高且错误率最低的变量纳入logistic回归模型进行分析,年龄（OR=1.03,95%CI：1.01-1.06）,GG基因型（OR=16.20,95%CI：1.98-132.55）,肌酐（OR=1.02,95%CI：1.00-1.03）,糖化血红蛋白（OR=4.46,95%CI：3.35-5.96）为危险因素,行ROC曲线分析logistic回归模型拟合能力高,AUC=0.926,95%CI：0.901-0.952。结论糖尿病合并视网膜病变与HIF-1α基因多态性相关。

猪HIF-1α基因启动子区及编码区的生物信息学分析

利用生物信息学方法,对NCBI中公布的猪缺氧诱导因子HIF-1α基因的5′端上游2000 bp长度的候选启动子区进行了核心启动子及转录结合位点的预测;同时对其所编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、跨膜结构域、信号肽、高级结构及进化关系进行了分析。结果显示:猪HIF-1α基因5′端上游存在潜在启动子区,存在CpG岛,存在多个转录因子结合位点,编码的蛋白为亲水性蛋白;蛋白质等电点为5.11,共由824个氨基酸组成,含量最高的为亮氨酸。HIF-1α蛋白主要定位于细胞核内,不存在跨膜结构域,为非跨膜蛋白,不存在信号肽,二级结构主要为α螺旋及无规卷曲。此外通过对猪HIF-1α基因序列的同源性比较发现,与猪HIF-1α基因同源性最近的是绵羊,同源性最远的是原鸡。此研究为猪HIF-1α基因结构和功能的探索提供了一定的理论依据。

siRNA干扰沉默HIF-1α基因在舌癌Tca8113细胞侵袭和迁移中的作用机制

目的探讨利用siRNA技术特异性阻断缺氧诱导因子(HIF)-1α基因表达对舌癌Tca8113细胞侵袭和迁移的影响。方法取指数生长期细胞消化计数后按2×105个/孔接种于6孔细胞培养板中,待细胞融合至40%~50%时,将针对HIF-1α的siRNA序列应用LipofectamineTM2000转染入Tca8113细胞(siRNA HIF-1α组,干扰组)。半定量RT-PCR及Western印迹法检测HIF-1α的m RNA及蛋白,四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡率,细胞侵袭实验和划痕实验检测细胞的侵袭和迁移能力。结果 siRNA可以有效沉默Tca8113细胞HIF-1α基因;干扰组细胞增殖较对照组明显受到抑制,且与细胞凋亡有关,凋亡率显著高于对照组(P<0.05);,siRNA HIF-1α基因转染后的Tca8113细胞黏附能力降低,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);侵袭能力也下降。结论 siRNA能够有效沉默HIF-1α基因,抑制舌癌Tca8113细胞侵袭和迁移,在某种程度上可以改善舌癌细胞的恶性表型,为舌癌的治疗提供思路。

Hif-1α在斑马鱼吞噬细胞迁移及发育中的生物学功能

探究斑马鱼低氧诱导因子-1α(Hif-1α)基因在中性粒细胞和巨噬细胞的发育和迁移中所起的作用。将斑马鱼分为野生对照组和Hif-1α基因突变组。使用CRISPR/Cas9技术对斑马鱼的Hif-1α基因进行突变。随后,通过苏丹黑B染色法观察了野生对照组和Hif-1α基因突变组中性粒细胞的染色情况,以及通过中性红染色法观察了巨噬细胞的染色情况并对结果进行了统计分析。结果显示成功构建缺失8个碱基的斑马鱼Hif-1α基因突变体,且Hif-1α基因突变的斑马鱼幼鱼发育3 d后,中性粒细胞迁移到急性损伤部位的数量显著减少,突变型斑马鱼后脑室中的小胶质巨噬细胞数量比野生型显著增多。综上,本研究成功构建了斑马鱼Hif-1α基因纯合突变体,同时表明Hif-1α基因具有抑制中性粒细胞向炎症区域迁移的作用,并促进脑室巨噬细胞的生长发育,为后续研究急性损伤模型提供基础。

益气化瘀方减轻HIF-1α条件性基因敲除小鼠膝关节软骨退变的研究

目的:观察低氧诱导因子-1α(HIF-1α)条件性基因敲除(HIF-1αcKO)小鼠膝关节软骨退变情况,以及中药复方益气化瘀方对减缓HIF-1αcKO小鼠椎间盘软骨退变的作用。方法:①将杂交繁殖获得同窝的HIF-1α+/+小鼠和HIF-1α-/-小鼠,分为HIF-1α+/+小鼠4月龄组、HIF-1α-/-小鼠4月龄组,HIF-1α+/+小鼠6月龄组、HIF-1α-/-小鼠6月龄组,每组3只。在4、6月龄依次处死相应的小鼠,取膝关节软骨,分别进行Mankin评分、藏红固绿、HE及免疫组化相关指标染色及分析,研究软骨组织的改变情况。②将2月龄HIF-1α-/-小鼠随机分为生理盐水组和益气化瘀方组,以生理盐水组小鼠作为正常对照,每组6只,共12只。灌胃给药2个月后,取各组小鼠的膝关节,分别进行Mankin评分、HE染色和藏红固绿染色,ColⅡ、ColX、VEGF、MMP-13和Sox9免疫组化染色及分析。结果:①HIF-1α-/-小鼠4月龄组膝关节软骨组织出现破损和骨化,细胞分布不均匀,软骨细胞减少。HIF-1α-/-小鼠6月龄组膝关节软骨损伤更加严重。HIF-1α-/-小鼠4月龄组椎间盘软骨中Ⅱ型胶原(ColⅡ)和Sox9表达降低,X型胶原(ColX)、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、VEGF蛋白表达增加。HIF-1α-/-小鼠6月龄组ColⅡ蛋白与Sox9表达进一步降低,ColX、MMP13、VEGF蛋白表达进一步上升。②与生理盐水组比较,益气化瘀方干预后膝关节软骨部位的骨化和缺损减轻,软骨细胞分布较均匀,细胞总数增加。免疫组化染色显示,益气化瘀方组ColⅡ和Sox9蛋白的表达升高,ColX、VEGF、MMP-13蛋白表达减少。结论:HIF-1α基因敲除小鼠出现了膝关节软骨退变,并且这种退变随着小鼠增龄而加重;益气化瘀方可以减轻HIF-1α基因敲除小鼠的膝关节软骨退变。

TLR4基因在宫颈癌组织中的表达及其与HIF-1α的相关性

目的探讨TLR4基因与宫颈癌发生的关系及其与HIF-1α的相关性。方法采用RT-PCR法,检测80例HPV阳性宫颈病变标本中TLR4和HIF-1α表达情况。结果随着宫颈病变程度地加重,TLR4和HIF-1α基因水平逐渐上升,差异有显著性意义(F/P值分别为16.23/0.0041和15.42/0.0072);且宫颈癌组织中,TLR4表达与HIF-1α表达呈正相关性(γ=0.491,P<0.05)。结论 TLR4基因参与了宫颈癌的发生发展,且其表达与HIF-1α表达相关。

Anti-HIF-1α-pEGFP重组质粒的构建及表达

目的构建EGFP-HIF-1α反义重组质粒,转染人宫颈癌Hela细胞,用以探讨HIF-1α蛋白在宫颈癌的生长、转移中的作用。方法应用基因重组技术构建EGFP-HIF-1α反义重组质粒,通过脂质体介导将其转染入Hela细胞,倒置荧光显微镜观察转染效果,Western blot检测HIF-1α蛋白的表达。结果酶切鉴定结果显示含EGFP-HIF-1α反义重组质粒构建成功,并能在Hela细胞中封闭HIF-1α蛋白的表达。结果 EGFP-HIF-1α反义重组质粒构建及转染成功,封闭Hela细胞中HIF-1α蛋白的表达,为进一步研究HIF-1α蛋白在宫颈癌的生长、转移中的作用提供试验基础。

缺氧诱导因子-1α过表达通过葡萄糖转运载体-4介导缺氧大鼠骨髓间充质干细胞对葡萄糖的摄取

目的探列缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因转染是否提高骨髓间充质干细胞（MSC）缺氧状态下的葡萄糖摄取能力以及这种能力是否与葡萄糖转运载体-4（GLUT-4）的表达和易位有关。方法将MSCs分为常氧非转染组（即对照组）、常氧转染组、缺氧非转染组和缺氧转染组，分别于常氧（5％CO2，37℃）和缺氧（94％N2、1％0z和5％CO2，37℃）条件下孵育8h。放射同位素法检测。H—G摄取量，免疫细胞化学和Western-blot检测GLUT-4的表达。结果①与缺氧非转染组相比，缺氧转染组显著提高细胞摄取。H—G量（P〈0．01），但二者均显著低于对照组和常氧转染组对。H—G的摄取（P〈0．01）；②与缺氧非转染组相比，缺氧转染组显著提高细胞和细胞膜GLUT-4蛋白的表达（P〈0．01），2组均显著低于对照组GLUT-4蛋白的表达和移位（P〈0．01）；③。H—G摄取量与细胞膜中GLUT-4表达呈正相关（r=0．437，P=0．001）。结论HIF-1a基因提高MSCs的葡萄糖摄取能力，此机制与HIF-1α基因提高GLUT-4的表达和易位相关。