瑞马唑仑调节HIF-1α/BNIP3信号通路对OGD/R诱导神经细胞自噬和凋亡的影响

目的探讨瑞马唑仑对OGD/R诱导的神经细胞自噬和凋亡的影响及作用机制。方法体外培养小鼠海马神经元细胞(HT22)并进行神经细胞氧糖剥夺/再复氧(OGD/R),筛选实验用瑞马唑仑浓度;将HT22细胞分为对照组、OGD/R组、瑞马唑仑组、2-ME2组、瑞马唑仑+2-ME2组;CCK8法检测5组HT22细胞活力;流式细胞术检测5组HT22细胞凋亡率;透射电子显微镜观察5组HT22细胞自噬小体的形成;Western blot检测5组HT22细胞HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达。结果确定实验用瑞马唑仑浓度为50μg/mL;与对照组比较,OGD/R组HT22细胞OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平下调,凋亡率上调(P<0.05);与OGD/R组比较,瑞马唑仑组HT22细胞自噬小体增加,OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平上调,凋亡率下调(P<0.05);2-ME2组HT22细胞OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平下调,凋亡率上调(P<0.05)。与瑞马唑仑组比较,瑞马唑仑+2-ME2组HT22细胞自噬小体数量减少,OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平下调,凋亡率上调(P<0.05);与2-ME2组比较,瑞马唑仑+2-ME2组HT22细胞OD450值、HIF-1α、BNIP3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平上调,凋亡率下调(P<0.05)。结论瑞马唑仑可通过激活HIF-1α/BNIP3信号通路促进OGD/R诱导的神经细胞自噬,抑制细胞凋亡,从而减轻OGD/R诱导的神经细胞损伤。

中风活心软胶囊通过靶向微小RNA-126诱导缺氧诱导因子-1α/促凋亡调节蛋白BNIP3信号通路促进自噬减轻脑缺血再灌注损伤大鼠神经损伤的作用机制研究

目的探讨中风活心软胶囊通过靶向微小RNA(miRNA)-126诱导缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)/促凋亡调节蛋白BNIP3信号通路促进自噬减轻脑缺血再灌注损伤大鼠神经损伤的作用机制。方法选取30只无特定病原体(SPF)级雄性SD大鼠,随机分为空白组、模型组与治疗组,每组10只。采用Zea Longa法建立右侧大脑中动脉缺血(MCAO)大鼠模型。治疗组给予中风活心软胶囊。采用改良神经功能损害评分(mNSS)评估大鼠神经功能缺损情况,透射电镜观察缺血半暗区皮质神经元及自噬囊泡超微结构,蛋白质免疫印迹(WB)法和实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)法分别检测缺血半暗区皮质雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、HIF-1α蛋白及其mRNA和miR-126的表达水平。结果模型组、治疗组mNSS评分均高于对照组,但治疗组低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组、治疗组缺血半暗区皮质mTOR、HIF-1α蛋白表达水平均高于对照组,但治疗组低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组、治疗组缺血半暗区皮质mTOR、HIF-1αmRNA表达水平均高于对照组,miR-126表达水平低于对照组,但治疗组mTOR、HIF-1αmRNA表达水平低于模型组,miR-126表达水平高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗组缺血半暗区皮质神经元及电镜下自噬囊泡数量明显增加,细胞结构损坏减轻。结论中风活心软胶囊可显著提高脑缺血大鼠缺血半暗区皮质mTOR、HIF-1α因子表达,其作用机制可能是通过激活miR-126表达进而靶向调控mTOR/HIF-1α信号通路,促进自噬,从而发挥其脑保护效应。

WIN55212-2通过调控mTOR/HIF-1α/PFKFB3信号通路抑制糖酵解并减轻脓毒症小鼠急性肺损伤

目的:探究大麻素受体激动剂WIN55212-2(WIN)对脓毒症小鼠急性肺损伤(ALI)的影响,并探讨其通过糖酵解发挥作用的可能机制。方法:采用腹腔注射脂多糖(LPS)创建小鼠脓毒症ALI模型。将雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组:对照(control)组、LPS组(腹腔注射10 mg/kg LPS)、LPS+WIN组(注射LPS前30 min腹腔注射1 mg/kg WIN)和LPS+WIN+MHY1485[哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)活化剂]组(LPS造模前1 d腹腔注射10 mg/kg MHY1485,并在造模前30 min腹腔注射1 mg/kg WIN和10 mg/kg MHY1485),每组6只。造模24 h后取材,计算肺指数;HE染色观察肺组织病理变化;ELISA检测肺组织炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)和IL-10表达水平,以及血清乳酸和乳酸脱氢酶A(LDHA)水平;Western blot检测mTOR/缺氧诱导因子1α(HIF-1α)/6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-双磷酸酶3(PFKFB3)信号通路相关蛋白水平。结果:相比于control组,LPS组小鼠肺指数增加,HE染色显示肺组织受损,肺组织中IL-10水平降低(P<0.05),IL-1β水平升高(P<0.05),血清乳酸和LDHA水平升高(P<0.05),磷酸化mTOR(p-mTOR)、HIF-1α和PFKFB3蛋白水平升高(P<0.05)。相较于LPS组,LPS+WIN组肺指数降低(P<0.05),HE染色显示肺组织受损减轻,肺组织IL-1β水平降低(P<0.05),IL-10水平升高(P<0.05),血清乳酸和LDHA水平降低(P<0.05),p-mTOR、HIF-1α和PFKFB3蛋白水平降低(P<0.05)。相较于LPS+WIN组,LPS+WIN+MHY1485组肺指数增加,HE染色显示肺组织受损,肺组织IL-1β水平升高(P<0.05),IL-10水平降低(P<0.05),血清乳酸和LDHA水平升高(P<0.05),p-mTOR、HIF-1α和PFKFB3蛋白水平升高(P<0.05)。结论:WIN55212-2可以减轻脓毒症小鼠ALI,其机制可能是通过调控mTOR/HIF-1α/PFKFB3信号通路,抑制糖酵解,减轻炎症反应。

紫草素调节HIF-1α/NLRP3信号通路对蛛网膜下腔出血大鼠神经功能损伤的影响

目的探究紫草素调节缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)/NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)信号通路对蛛网膜下腔出血(SAH)大鼠神经功能损伤的影响。方法大鼠随机分为假手术组、模型组、YC-1(HIF-1α抑制剂,5 mg/kg)组、紫草素低剂量组(4 mg/kg)、紫草素高剂量组(25 mg/kg)、紫草素高剂量(25 mg/kg)+AG1(HIF-1α激活剂,10 mg/kg)组,每组15只。采用颈内动脉刺破法制备SAH模型。采用Zea-Longa评分法评估6组大鼠神经功能;ELISA法检测血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和IL-1β水平;HE染色观察大鼠海马组织形态学变化,TUNEL染色法检测海马神经元凋亡率;伊文思蓝染色检测血脑屏障通透性;商品化试剂盒检测大鼠脑组织超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(MDA)、丙二醛(CAT)水平,Western blot检测大鼠脑组织Bax、Bcl-2、HIF-1α、NLRP3蛋白表达。结果假手术组大鼠海马神经元形态结构正常;与假手术组相比,模型组大鼠海马神经元有大量水肿、结构模糊,有细胞核溶解,变型固缩,部分细胞核消失,大鼠神经功能评分、血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平、海马神经元凋亡率、伊文思蓝渗出量、脑组织MDA水平、Bax、HIF-1α、NLRP3水平显著增加,脑组织SOD、CAT水平、Bcl-2蛋白水平显著降低(P<0.05);与模型组比较,紫草素低剂量组、紫草素高剂量组和YC-1组鼠海马神经元病理损伤显著改善,大鼠神经功能评分、血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平、海马神经元凋亡率、伊文思蓝渗出量、脑组织MDA水平、Bax、HIF-1α、NLRP3水平显著降低,SOD、CAT水平、Bcl-2蛋白水平显著升高(P<0.05);与紫草素高剂量组比较,紫草素高剂量+AG1组大鼠海马神经元病理损伤显著加重,大鼠神经功能评分、血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平、海马神经元凋亡率、伊文思蓝渗出量、脑组织MDA水平、Bax、HIF-1α、NLRP3水平显著增加,SOD、CAT水平、Bcl-2蛋白水平显著降低(P<0.05)。结论紫草素抑制HIF-1α/NLRP3信号通路以降低氧化应激和炎性反应,进而改善SAH大鼠神经功能损伤。

紫癜肾煎剂对过敏性紫癜性肾炎大鼠PI3K/AKT及HIF-1α/VEGFA信号通路的影响

目的 观察紫癜肾煎剂对过敏性紫癜性肾炎(Henoch Schonlein purpura nephritis, HSPN)模型大鼠的治疗作用,并基于PI3K/AKT和HIF-1α/VEGFA信号通路探讨其作用机制。方法 随机选7只SD大鼠分为正常对照组,其余大鼠应用“BSA+LPS+CCL4”联合干姜建立HSPN大鼠模型,12周后随机抽取正常对照组和造模组的大鼠各1只,取肾组织固定包埋,采用免疫荧光检测造模组大鼠肾组织中IgA沉积并伴有蛋白尿,正常组无上述表现,提示造模成功。将造模成功的HSPN大鼠模型随机分模型组、紫癜肾煎剂低、高剂量(6.10、24.40 g/kg)组和西药(3.93 mg/kg)组,每组6只。给药结束后,采用溴甲酚紫法测定尿蛋白浓度,计算24 h尿蛋白定量;各组大鼠肾组织病理和免疫荧光检测;采用Western blotting法检测SD大鼠肾组织PI3K、AKT、HIF-1α、VEGFA蛋白表达情况。结果 紫癜肾煎剂可以显著降低24 h尿蛋白(P<0.05),减少肾小球系膜区免疫复合物沉积;与模型组比较,中药方组和西药组大鼠肾组织PI3K、AKT、HIF-1α、VEGFA蛋白表达明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 紫癜肾煎剂能减少HSPN大鼠24 h蛋白尿,改善肾功能及肾组织病理损伤,延缓HSPN病情进展,其机制可能与调控PI3K/AKT和HIF-1α/VEGFA信号通路有关。

基于PI3K/AKT/HIF-1α信号通路研究易层敷贴缓解TGF-β1诱导的膝骨关节炎大鼠滑膜纤维化的机制

目的探讨易层敷贴对膝骨关节炎(KOA)大鼠滑膜纤维化TGF-β1、α-SMA、COL1A1表达的影响以及对PI3K/AKT/HIF-1α信号通路的调控作用。方法将30只SPF级SD大鼠随机分为空白组、模型组和易层组,膝关节腔注射200 ng转化生长因子-β1重组蛋白(TGF-β1)建立膝关节滑膜纤维化动物模型,2 d 1次,持续3次,造模14 d后给予易层敷贴外用治疗28 d后取滑膜组织。HE和Masson染色观察滑膜病理变化;免疫组化检测滑膜p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、TGF-β1、α-SMA、COL1A1的表达水平。提取雄性SD大鼠膝关节成纤维样滑膜细胞(FLSs),以10 ng·mL-1 TGF-β1诱导24 h建立KOA滑膜纤维化细胞模型,易层冻干粉干预24 h,Western blot检测PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、HIF-1α、TGF-β1、α-SMA、COL1A1的蛋白表达,qPCR检测HIF-1α、TGF-β1、α-SMA、COL1A1 mRNA表达。结果与空白组相比,模型组HE染色滑膜炎加重(P<0.01),Masson染色滑膜纤维化占比显著增加(P<0.01),免疫组化中p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、TGF-β1、α-SMA、COL1A1表达均增加(P<0.01);滑膜细胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、HIF-1α、TGF-β1、α-SMA、COL1A1蛋白表达均升高(P<0.05,P<0.01),HIF-1α、TGF-β1、α-SMA、COL1A1 mRNA表达均上升(P<0.01)。与模型组相比,易层组滑膜炎和滑膜纤维化状况改善,p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、TGF-β1、α-SMA、COL1A1的表达均减少(P<0.05,P<0.01);滑膜细胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、HIF-1α、TGF-β1、α-SMA、COL1A1蛋白表达均降低(P<0.05),HIF-1α、TGF-β1、α-SMA、COL1A1 mRNA表达均下调(P<0.05,P<0.01)。结论易层敷贴通过调控PI3K/AKT/HIF-1α信号通路,降低TGF-β1、α-SMA、COL1A1的表达,有效改善TGF-β1诱导的KOA大鼠滑膜纤维化。

心痛泰含药血清干预PI3K/Akt/HIF-1α通路抑制兔主动脉平滑肌细胞凋亡的作用机制

目的通过生信分析和细胞实验探讨心痛泰含药血清干预PI3K/Akt/HIF-1α对兔主动脉平滑肌细胞(Aortic vascular smooth muscle cell,VSMC)凋亡的作用机制。方法采用ox-LDL诱导实验兔主动脉平滑肌细胞凋亡,构建动脉粥样硬化的细胞模型。采用细胞增殖与活性检测(Cell counting Kit8,CCK8)法筛选心痛泰含药血清最佳作用浓度。在中药药理数据分析平台中收集心痛泰的主要化学成分,通过PubChem数据库收集各活性化合物成分信息,SwissTargetPrediction数据库预测活性化合物相关靶点,通过GeneCards和DisGeNET数据库收集“动脉粥样硬化”、“细胞凋亡”的作用靶点,STRING平台构建蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein interaction network,PPI)网络,DAVID在线分析GO分析和KEGG分析。VSMC分为空白血清组、模型组、心痛泰含药血清组、磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)抑制剂(LY294002)组、心痛泰含药血清+LY294002组。分别采用原位末端标记(TdT mediated dUTP Nick End Labeling,TUNEL)法和流式细胞术检测VSMC凋亡,计算凋亡率;聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)法测定PI3K、丝/苏氨酸蛋白激酶(Phospho-Alpha serine/threonine-protein kinase,Akt)、缺氧诱导因子(Hypoxia-Inducible factor 1-Alpha,HIF-1α)、caspase-3、caspase-9的mRNA表达;蛋白质免疫印迹(Western blot)法测定磷酸化的PI3K(p-PI3K)/PI3K、磷酸化的Akt(p-Akt)/Akt、HIF-1α、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9的蛋白表达;细胞免疫荧光法检测VSMC中收缩型特异性标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的荧光定量。结果CCK-8筛选出最佳干预浓度为20%心痛泰中剂量含药血清;TUNEL法和流式细胞术表明,与空白组相比,模型组的VSMC凋亡阳性细胞百分比、早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率均明显升高(P<0.01),PI3K、Akt、HIF-1α、caspase-3、caspase-9 mRNA表达明显增加(P<0.01),p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、HIF-1α、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白表达明显增加(P<0.01),α-SMA明显减少(P<0.01)。与模型组相比,心痛泰含药血清组、LY294002组、心痛泰含药血清+LY294002组的VSMC凋亡阳性细胞百分比、早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率均降低(P<0.01或P<0.05),PI3K、Akt、HIF-1α、caspase-3、caspase-9 mRNA表达减少(P<0.01或P<0.05),p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、HIF-1α、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白表达下调(P<0.01或P<0.05),α-SMA明显增加(P<0.01或P<0.05)。与心痛泰含药血清组比,心痛泰含药血清+LY294002组的VSMC凋亡阳性细胞百分比、早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率均无明显差异(P>0.05),PI3K、Akt、HIF-1α、caspase-3、caspase-9的mRNA表达,以及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、HIF-1α、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白表达无差异(P>0.05),α-SMA的荧光强度无差异(P>0.05)。结论心痛泰含药血清可能通过下调PI3K/Akt/HIF-1α信号通路及下游的凋亡相关因子,改善ox-LDL诱导的VSMC凋亡,从而达到稳定动脉易损斑块的作用。

黄芪-莪术协同作用调节SIRT3/HIF-1α通路对人肺腺癌A549细胞侵袭迁移的影响

目的观察黄芪-莪术药对通过调节SIRT3/HIF-1α信号通路对人肺腺癌A549细胞增殖、凋亡及侵袭和迁移能力的影响。方法复制C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤模型,观察黄芪-莪术不同配比(1:1、2:1、3:1)干预14 d后对移植瘤重和肺转移的影响,计算抑瘤率,以抑瘤率优选黄芪-莪术配比;体外培养人肺腺癌A549细胞,采用CCK-8法检测不同浓度黄芪-莪术提取物对A549细胞增殖的抑制作用,筛选其最佳给药浓度和作用时间,流式细胞仪检测A549细胞凋亡率,细胞划痕实验和Transwell实验检测A549细胞移动性及侵袭能力变化,Western-blot检测侵袭相关蛋白(COX-2、CD44v6、MMP-9)的表达水平,Western-blot及RT-PCR检测SIRT3/HIF-1α通路蛋白和mRNA表达。结果黄芪-莪术不同配比干预后,小鼠瘤重和肺转移灶数明显减少(P<0.05),其中3:1配比抑瘤作用最显著(P<0.05);黄芪-莪术提取物0.4~0.8 mg/mL干预48 h对A549细胞增殖的抑制作用明显,应用0.4、0.6、0.8 mg/mL浓度处理48 h后,A549细胞凋亡率较空白对照组明显提升,迁移能力减弱,创面愈合率明显降低,侵袭细胞数明显减少(P<0.05),细胞COX-2、CD44v6、MMP-9的蛋白表达显著降低(P<0.05),同时明显下调了HIF-1α的蛋白和m RNA表达,上调了SIRT3的蛋白和m RNA表达(P<0.05)。结论黄芪-莪术药对可有效抑制肺癌肿瘤的生长和转移,并能通过调节SIRT3/HIF-1α信号通路发挥对A549细胞的促凋亡和抗侵袭、迁移作用。

银杏内酯B对体外培养神经干细胞内HIF-1α及PI3K/Akt信号通路的影响

目的探讨银杏内酯B(GKB)对体外培养神经干细胞(NSCs)内低氧诱导因子-1α(HIF-1α)及磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/Akt信号通路表达的影响。方法在建立谷氨酸对神经干细胞损伤的模型基础上,给予银杏内酯B、PI3K/Akt特异性抑制剂wortmannin进行干预,将实验分为两大组:即正常细胞组、谷氨酸损伤组,各组下又分为4个小组:(1)GKB组;(2)对照组;(3)wortmannin+GKB组;(4)wortmannin组。采用Western blot印迹来检测各组NSCs中HIF-1α、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)蛋白水平的表达。结果无论正常细胞组还是谷氨酸损伤细胞组,NSCs经GKB处理后HIF-1α、p-Akt表达均较对照组明显增高,差异有统计学意义(P<0.05);经wortmannin处理后HIF-1α、p-Akt蛋白表达受抑制,较对照组明显减弱(P<0.05);wortmannin+GKB组和wortmannin组比较,HIF-1α、p-Akt表达上调,差异有统计学意义(P<0.05)。NSCs经谷氨酸处理后,HIF-1α、p-Akt表达较未受损的NSCs表达增强(P<0.05)。结论银杏内酯B是神经干细胞保护作用机制之一,可能与激活PI3K/Akt信号通路、进一步上调HIF-1α表达有关。

茵陈素调控HIF-1α/BNIP3通路对高胆红素血症新生大鼠模型神经损伤的保护作用

目的探讨茵陈素调控HIF-1α/BNIP3通路对高胆红素血症新生大鼠模型神经损伤的保护作用,以期探索新生儿高胆红素血症的治疗机制。方法通过腹腔注射胆红素建立高胆红素血症新生大鼠模型,随机分为模型组、茵陈素组、BAY87-2243[缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)抑制剂]组、茵陈素+BAY87-2243组,每组12只,另取12只SD新生大鼠腹腔注射等量生理盐水,设为对照组。分组处理后,用横木行走测试检测大鼠运动协调及整合能力,检测大鼠小脑神经元凋亡情况、血清中枢神经特异性蛋白(S100β)及神经元特异性烯醇化酶(NSE)水平、小脑组织凋亡蛋白(caspase-3、Bax)及自噬蛋白(Beclin-1、LC3B)、HIF-1α/BCL2/腺病毒E1B相互作用蛋白3(BNIP3)通路蛋白(HIF-1α、BNIP3)的表达水平。结果各组大鼠小脑神经元凋亡率及caspase-3、Bax、Beclin-1、LC3B、HIF-1α及BNIP3蛋白表达水平差异均有统计学意义(F值分别为101.447、76.904、94.253、113.717、112.062、109.716、128.531,P<0.05)。两两比较显示,模型组大鼠小脑神经元凋亡率及caspase-3、Bax、Beclin-1、LC3B、HIF-1α、BNIP3蛋白表达水平均高于对照组;茵陈素组大鼠小脑神经元凋亡率及caspase-3、Bax蛋白表达水平均分别低于模型组、茵陈素+BAY87-2243组,Beclin-1、LC3B、HIF-1α、BNIP3蛋白表达水平分别高于模型组、茵陈素+BAY87-2243组;BAY87-2243组小脑神经元凋亡率及caspase-3、Bax蛋白表达水平均分别高于模型组、茵陈素+BAY87-2243组,大鼠Beclin-1、LC3B、HIF-1α、BNIP3蛋白表达水平均分别低于模型组、茵陈素+BAY87-2243组,上述差异均有统计学意义(P<0.05)。结论茵陈素可激活HIF-1α/BNIP3通路,促进自噬作用,抑制胆红素诱导的新生大鼠小脑神经元凋亡。

黄芪甲苷与人参皂苷Rg1配伍对PC12细胞氧糖剥夺复糖复氧后细胞自噬和PI3K信号通路的影响

目的:探讨黄芪甲苷和人参皂苷Rg1配伍对PC12细胞氧糖剥夺后再复糖复氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)诱导的细胞自噬的影响及作用机制。方法:以PC12细胞建立OGD/R自噬性损伤模型,观察黄芪甲苷与人参皂苷Rg1配伍对细胞自噬的影响,并通过PI3KⅠ/Akt/m TOR和PI3KⅢ/beclin-1/Bcl-2信号通路研究黄芪甲苷与人参皂苷Rg1配伍的作用机制。结果:氧糖剥夺2 h复糖复氧24 h后,PC12细胞内LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值增加。黄芪甲苷、人参皂苷Rg1及黄芪甲苷与人参皂苷Rg1配伍均能下调OGD/R后PC12细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值,且配伍组的效应强于药物单用组。机制研究表明,人参皂苷Rg1单用及黄芪甲苷和人参皂苷Rg1配伍能升高PI3KⅠ、Akt、m TOR蛋白磷酸化水平,配伍的效应强于药物单用;黄芪甲苷单用及黄芪甲苷和人参皂苷Rg1配伍均能抑制PI3KⅢ、beclin-1蛋白表达,而配伍还能上调Bcl-2蛋白表达,且配伍的效应强于药物单用组。结论:PC12细胞在缺糖缺氧2 h再复糖复氧24 h后,细胞出现自噬;黄芪甲苷和人参皂苷Rg1均能减轻OGD/R诱导的PC12细胞自噬,且2者配伍对细胞自噬具有协同抑制作用,其机制可能与调节PI3KⅠ/Akt/m TOR和PI3KⅢ/beclin-1/Bcl-2信号通路有关。

基于HIF-1α/BNIP3信号通路调控线粒体自噬探讨通脉开窍丸治疗血管性痴呆大鼠的机制

目的:观察通脉开窍丸对血管性痴呆(VD)大鼠海马体缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)/腺病毒E1B19kD相互作用蛋白3(BNIP3)信号通路及线粒体自噬的影响。方法:将90只雄性SD大鼠适应性喂养1周后,随机抽选10只作为假手术组,仅分离颈总动脉不结扎,剩余大鼠将采用颈总动脉分次结扎法制作VD大鼠模型。剔除死亡和造模不成功的大鼠后,将造模成功的大鼠随机分为模型组、通脉开窍丸高、中、低剂量组(27.6、13.8、6.9 g·kg^(-1))、盐酸多奈哌齐组(0.45 mg·kg^(-1))、联合组(通脉开窍丸高剂量27.6 g·kg^(-1)+HIF-1α抑制剂YC-12.5 mg·kg^(-1)),各组对应治疗4周后取材。尼氏染色法观察海马区神经元丢失情况;苏木素-伊红(HE)染色观察海马区病理学变化;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测海马组织HIF-1α、BNIP3、自噬效应蛋白-1(Beclin-1)、微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)蛋白表达水平;透射电镜观察海马组织线粒体超微结构及自噬小体数量;免疫荧光(IF)观察海马组织HIF-1α、BNIP3、LC3B的荧光强度。结果:与假手术组比较,模型组大鼠逃避潜伏期延长(P<0.01),穿越平台次数减少(P<0.01),海马区神经元层次减少,数量骤减,结构排列不齐,尼氏小体数量减少,丢失严重,线粒体嵴紊乱,线粒体双模结构破坏,损伤加重,自噬小体数量增加,HIF-1α、BNIP3、Beclin-1、LC3B蛋白表达增加(P<0.05,P<0.01),HIF-1α、BNIP3、LC3B的荧光强度增强(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,通脉开窍丸各治疗组、盐酸多奈哌齐组大鼠寻找平台时间缩短(P<0.01),穿越平台次数增加(P<0.01),HE染色显示,海马神经元细胞数量增多,形态正常,排列整齐,尼氏小体丰富,丢失减少,损伤减轻,自噬小体数量增多,HIF-1α、BNIP3、Beclin-1、LC3B蛋白表达明显增加(P<0.05,P<0.01),HIF-1α、BNIP3、LC3B的荧光强度增强(P<0.05,P<0.01)。与通脉开窍丸高剂量组比较,联合组大鼠逃避潜伏期显著延长(P<0.01),穿越平台次数显著降低(P<0.01),海马神经元细胞数量减少,损伤加重,尼氏小体数量下降,自噬小体数量有所减少,HIF-1α、BNIP3、Beclin-1、LC3B蛋白表达显著降低(P<0.01),HIF-1α、BNIP3、LC3B的荧光强度显著下降(P<0.01)。结论:通脉开窍丸可能通过激活HIF-1α/BNIP3信号通路,促进线粒体自噬的发生,清除功能受损的线粒体,为健康细胞提供能量,减少神经细胞死亡,促进脑功能的恢复,从而减轻大鼠海马组织的缺血性损伤,提高大鼠学习记忆能力,从而发挥对VD的治疗作用。

低氧预处理通过调控PKA/CREB及JAK1/STATA3信号通路减轻低氧暴露力竭运动小鼠心肌损伤

目的建立低氧暴露力竭运动小鼠模型,探究低氧预处理(HPC)减轻低氧暴露力竭运动小鼠心肌损伤的分子学机制。方法40只小鼠随机分为对照组(Con组)、模型组(MG组)、低氧预适应1组(HP1组)及低氧预适应2组(HP2组),采用低氧干预+力竭游泳实验建立低氧暴露运动模型。MG组小鼠进行低氧条件下力竭游泳实验建模,HP1组低氧力竭游泳造模前给予低氧预适应刺激,HP2组造模同时给予重复低氧预适应刺激,连续8周。末次实验后小鼠取血及心肌组织,ELISA法检测血清谷丙转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量,实时定量PCR和Western Blot技术检测心肌组织HIF-1αmRNA表达及PRKACA/B、CREB1、JAK1、STATA3蛋白表达。结果与Con组比较,MG组小鼠生长速率及力竭游泳时间显著降低(P<0.05),血清AST、LDH、CK水平显著上升(P<0.05),MDA含量下降(P<0.05),SOD含量上升(P<0.05),心肌HIF-1αmRNA表达升高(P<0.05),JAK1、STAT3、PRKACA/B及CREB1蛋白表达均显著下降(P<0.05)。与MG组比较,HP1组及HP2组小鼠生长速率及力竭游泳时间显著升高(P<0.05),血清AST、LDH、CK水平下降(P<0.05)。HP1、HP2组心肌组织PRKACA/B、CREB1、JAK1、STATA3蛋白表达水平显著高于MG组(P<0.05),HIF-1αmRNA表达显著低于MG组(P<0.05)。结论低氧预处理可能通过上调PKA/CREB及JAK1/STATA3信号通路相关组分蛋白,并下调心肌组织HIF-1αmRNA表达水平,以促进低氧暴露力竭运动小鼠心肌损伤的恢复进程。

柴胡皂苷调节HIF-1α/BNIP3信号通路抑制线粒体自噬治疗肝胃不和型功能性消化不良大鼠

目的探究柴胡皂苷调节缺氧诱导因子-1α(HIF-1α/腺病毒E1B相互作用蛋白3(BNIP3)信号通路对肝胃不和型功能性消化不良(functional dyspepsia,FD)大鼠胃窦组织线粒体自噬的影响。方法采用复合因素法构建肝胃不和型FD大鼠模型,随机分为空白组、模型组、吗丁啉组、柴胡皂苷低、中、高剂量组,其中吗丁啉组以2.7 mg·kg^(-1)吗丁啉灌胃,柴胡皂苷低、中、高剂量组分别腹腔注射2、4、8 mg·kg^(-1)柴胡皂苷,模型组和空白组给予相同剂量生理盐水灌胃和腹腔注射,连续干预7 d。观察各组大鼠胃肠功能:胃排空率、小肠推进率,ELISA法检测血清胃动素(MTL)、胃泌素(GAS)含量,HE染色观察胃窦组织病理变化,透射电镜观察胃窦组织线粒体结构,试剂盒检测ROS、MDA、SOD水平,Western blot检测胃窦组织线粒体LC3、Beclin1、p62、HIF-1α、BNIP3蛋白表达。结果与空白组相比,模型组大鼠胃窦组织少量炎性细胞浸润,线粒体肿胀、变形,出现大量自噬体,胃排空率、小肠推进率、MTL、GAS、SOD、P62降低,ROS、MDA水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、HIF-1α、BNIP3蛋白表达升高(P<0.05);与模型组相比,吗丁啉组和柴胡皂苷低、中、高剂量组胃窦组织症状明显改善,线粒体嵴清晰,自噬体减少,胃排空率、小肠推进率、MTL、GAS、SOD、p62升高,ROS、MDA水平、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、HIF-1α、BNIP3蛋白表达降低(P<0.05)。结论柴胡皂苷能够改善肝胃不和型FD大鼠肠胃功能,抑制线粒体自噬,其作用机制可能与抑制HIF-1α/BNIP3信号通路有关。

盐酸纳美芬对心肌缺血再灌注大鼠缺氧诱导因子1α/B细胞淋巴瘤-2/E1B-19kDa相互作用蛋白3通路及心肌自噬的影响

目的探讨盐酸纳美芬对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)大鼠缺氧诱导因子1α(Hif-1α)/B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)/E1B-19kDa相互作用蛋白3(BNIP3)通路及心肌自噬的影响。方法2020年3—4月采用结扎冠状动脉左前降支法复制心肌缺血再灌注损伤(MIRI)大鼠模型,将造模成功的大鼠使用随机数字表法分成模型组、盐酸纳美芬低、中、高(10μg/kg、15μg/kg、20μg/kg)剂量组和氯喹组(阳性对照,0.02 g/kg),每组15只,另取15只假手术组大鼠作为对照。模型组和假手术组给予等剂量生理盐水,其余各组给予相对应剂量药物,每天1次,连续3 d。给药结束24 h后,氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法检测心肌梗死面积;苏木精-伊红(HE)染色观察心肌组织病理学变化;二氯荧光素双醋酸盐(DCFH-DA)法检测心肌组织中活性氧水平;蛋白质印迹法(Western blotting)检测心肌组织中自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ及通路蛋白Hif-1α、BNIP3表达水平。结果假手术组大鼠心肌组织结构完整,无明显病理变化。与假手术组相比,模型组大鼠心肌组织结构异常、心肌细胞坏死、心肌损伤严重,心肌梗死面积、活性氧水平、Beclin1、LC3-Ⅱ、Hif-1α、BNIP3蛋白表达水平和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值显著升高(P<0.05),其中Hif-1α和BNIP3蛋白表达水平分别为0.92±0.11和0.96±0.12,显著高于假手术组的0.10±0.02和0.08±0.01;与模型组相比,盐酸纳美芬低、中、高剂量组大鼠心肌组织病理损伤依次减轻,心肌梗死面积、活性氧水平、Beclin1、LC3-Ⅱ、Hif-1α、BNIP3蛋白表达水平和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值依次降低(P<0.05),其中盐酸纳美芬高剂量组Hif-1α和BNIP3蛋白表达水平分别为0.17±0.03和0.12±0.03,显著低于盐酸纳美芬中剂量组的0.29±0.04和0.31±0.05,盐酸纳美芬中剂量组显著低于盐酸纳美芬低剂量的0.58±0.07和0.52±0.08。盐酸纳美芬高剂量组与氯喹组大鼠各项指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论盐酸纳美芬可能通过抑制Hif-1α/BNIP3通路,减弱MIRI大鼠心肌自噬,缓解心肌损伤。

怀中1号地黄中2-phenylethyl-beta-glucopyranoside通过调节PI3K/Akt/mTOR/HIF-1α通路对低氧性肺动脉高压的影响

研究怀中1号地黄中2-phenylethyl-beta-glucopyranoside(Phe)对低氧诱导肺动脉高压小鼠的保护作用及其机制,为临床治疗肺动脉高压提供理论依据。首先将雄性C57BL/6N小鼠随机分为正常组,模型组,阳性药波生坦组(100 mg·kg^(-1)),Phe低、高剂量(20、40 mg·kg^(-1))组。除正常组外,其余各组均在10%的低氧环境中连续造模5周,并在第3周开始灌胃给药14 d,探究各组小鼠心肺功能、右心室压力、咳喘指数、肺部损伤、细胞凋亡、氧化应激相关指标、免疫细胞及磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)/缺氧诱导因子(hypoxic inducible facter,HIF)^(-1)α通路相关蛋白或mRNA水平。接着进一步采用缺氧诱导肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cell,PASMC)合并PI3K激动剂(740Y-P)对Phe干预肺动脉高压的机制进一步探究。结果显示Phe可显著提高肺动脉高压小鼠的心肺功能,降低右心室压力、咳喘指数及肺部损伤,减少细胞凋亡、氧化应激相关指标及磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-Akt)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin,p-mTOR)入核水平,抑制HIF^(-1)α和PI3K mRNA与蛋白表达水平,并维持小鼠机体免疫细胞稳态。进一步的机制探究中发现,Phe显著降低缺氧诱导PASMC的细胞活力与迁移能力,减少HIF^(-1)α和PI3K蛋白表达及p-Akt、p-mTOR入核水平,且此作用可被740Y-P阻断。因此,推测Phe可通过减轻肺组织氧化应激失衡与凋亡,调节免疫水平来发挥抗肺动脉高压作用,其机制可能和调控PI3K/Akt/mTOR/HIF^(-1)α通路有关。该研究以期为肺动脉高压的治疗提供药物参考及研究思路。

鹿芪方调控PAM信号通路抑制HIF-1α介导的心肌细胞自噬改善病理性心肌肥大的机制研究

目的:探究鹿芪方治疗压力超负荷诱导的病理性心肌肥大(CH)的作用机制。方法:将60只C57/BL6J小鼠随机分为空白组、模型组、鹿芪方组、抑制剂组[3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制剂]。除空白组外均采用主动脉弓缩窄术诱导构建CH模型,28 d取材。明场成像观察心脏整体形态,WGA和α-actinin染色观察心肌细胞表面积,免疫荧光明确自噬标志物LC3B表达水平,Western Blot检测磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶Bα(Akt1)、磷酸化蛋白激酶Bα(p-Akt1)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、缺氧诱导因子-1α亚基(HIF-1α)、微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)、Beclin-1蛋白表达。RT-qPCR检测心房利钠肽前体A(Nppa)、心房利钠肽前体B(Nppb)mRNA的表达。结果:体内实验结果显示,鹿芪方可改善小鼠心肌肥大,缩小心肌细胞表面积;抑制自噬相关蛋白LC3B、Beclin-1的表达(P<0.01,P<0.05);多组学测序结果和实验验证显示鹿芪方显著抑制PI3K/Akt/mTOR通路(PAM信号通路)和HIF-1α蛋白表达(P<0.05)。体外实验结果显示,与模型组比较,鹿芪方组心肌细胞表面积缩小;Nppa、Nppb mRNA表达水平降低(P<0.05);LC3B、Beclin-1蛋白表达水平降低(P<0.05)。与模型组比较,鹿芪方组PAM信号通路和HIF-1α蛋白表达降低(P<0.01,P<0.05)。结论:鹿芪方通过抑制PAM信号通路介导的HIF-1α蛋白表达,抑制心肌细胞自噬,改善CH。

补阳还五汤对脑出血大鼠脑组织HIF-1α、SDF-1、CXCR-4表达的影响

目的观察补阳还五汤对脑出血大鼠脑组织内自噬相关蛋白缺氧诱导因子(HIF)-1α、基质细胞衍生因子(SDF)-1、趋化因子受体(CXCR)-4表达的影响。方法72只雄性SD大鼠随机等分为假手术组、脑出血模型组、补阳还五汤组和银杏叶片组。采用Rosenberg法建立脑出血大鼠模型,补阳还五汤26.0 g/(kg·d)灌胃干预,连续给药14 d。Western印迹法检测Beclin-1蛋白的表达,免疫组化法检测HIF-1α、CXCR-4和SDF-1α蛋白的表达,TUNEL法观察神经细胞凋亡情况。结果与模型组比较,补阳还五汤组脑组织神经细胞凋亡数量明显减少,HIF-1α、Beclin-1蛋白表达减少,SDF-1α、CXCR-4蛋白表达显著增加。结论补阳还五汤能够降低HIF-1α表达,进而通过调控SDF-1α/CXCR4信号传导通路抑制脑出血诱发的神经细胞凋亡。

妊娠期糖尿病中患者miR-138-5p通过调控缺氧诱导因子1α保护β细胞功能

目的:探讨在妊娠期糖尿病(GDM)患者中miR-138-5p对胰岛β细胞功能的影响及其相关作用机制。方法:通过RT-qPCR对比15例GDM患者与15例的正常健康孕妇外周血中miR-138-5p的表达差异;miR-138-5p mimic及inhibitor分别转染入β细胞系INS-1细胞中,过表达或抑制其在该细胞中的表达水平,并通过RT-qPCR验证转染效率;利用MTT增殖实验、Annexin V-FITC凋亡实验及胰岛素释放实验分别检测miR-138-5p对INS-1细胞的增殖、凋亡和胰岛素释放能力的影响;通过miRNA靶基因预测软件Target Scan筛选miR-138-5p的目标靶基因,并利用双荧光素酶基因报告及Western blot实验进行验证;功能挽救实验证实miR-138-5p是否通过靶向调控其目标基因而发挥对INS-1细胞的增殖、凋亡及胰岛素释放能力影响;Western blot实验检测miR-138-5p在INS-1细胞中作用的分子信号通路。结果:与正常健康孕妇相比,GDM患者外周血中miR-138-5p的表达显著低表达;在INS-1细胞中转染miR-138-5p mimic及inhibitor后可显著促进或抑制miR-138-5p的表达;过表达miR-138-5p可明显促进INS-1细胞的增殖,抑制其发生凋亡并促进细胞对胰岛素的释放能力;而下调miR-138-5p的表达,可显著抑制INS-1细胞的增殖,促进其发生凋亡及抑制细胞的胰岛素释放能力;通过miRNA靶基因预测软件Target Scan筛选缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)为miR-138-5p的目标靶基因,双荧光素酶基因报告实验及Western blot实验提示miR-138-5p可抑制INS-1细胞中HIF-1α的表达;功能挽救实验证实miR-138-5p通过调控HIF-1α的表达,影响INS-1细胞的增殖、凋亡及胰岛素释放能力;Western blot实验明确miR-138-5p可能通过靶向调控HIF-1α的表达,影响PI3K/AKT信号通路中PI3K、AKT及其磷酸化后的p-PI3K、p-AKT蛋白而发挥对INS-1细胞的作用。结论:在GDM患者中,miR-138-5p可能通过靶向调控HIF-1α的表达,进而影响PI3K/AKT信号通路,促进β细胞的增殖、抑制其凋亡,并促进其胰岛素释放能力从而保护β细胞的功能。

基于PI3K/Akt信号转导通路的通脉醒脑滴丸治疗脑缺血的机制研究

目的探讨以活血化淤为主要功效的中药创新复方制剂通脉醒脑滴丸防治脑缺血卒中的作用机理。方法选用线栓阻断大鼠大脑中动脉法复制脑缺血再灌注模型,采用荧光定量PCR方法测定脑组织PI3K、Akt和PTEN的表达,免疫组化方法测定脑组织HIF-1α和VEGF的表达,考察通脉醒脑滴丸对PI3K/Akt信号通路的作用。结果通脉醒脑滴丸能上调脑组织PI3K、Akt、HIF-1α以及VEGF的表达,下调PTEN的表达。结论研究初步证实通脉醒脑滴丸对脑缺血损伤的保护作用机制可能与活血化淤的中药方剂激活PI3K/Akt信号通路有关。