维生素C与热处理通过PI3K/AKT/HIF-1α通路对肺癌A549细胞增殖的作用

目的探讨维生素C与热处理对肺癌A549细胞的作用及相关机制。方法应用不同浓度的维生素C(终浓度0、1、2、4、8 mmol/L)与不同温度(37℃和41℃)作用于A549细胞,采用CCK8法检测细胞活性,FRASC维生素C检测分析试剂盒Ⅱ检测细胞内总维生素C的浓度;然后分为对照组(37℃,0 mmol/L维生素C)、维生素C组(37℃,8 mmol/L维生素C)、热处理组(41℃,0 mmol/L维生素C)、联合组(41℃,8 mmol/L维生素C)干预24 h,荧光标记2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)检测A549细胞葡萄糖摄取量,蛋白质印迹检测GLUT1、GLUT3、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT、HIF-1α蛋白表达水平,检测结果均应用方差分析及LST-t检验进行统计分析。结果A549细胞活力随维生素C浓度增加而下降(P<0.05),41℃热处理的细胞在维生素C干预后的细胞活力均低于37℃(P<0.05);细胞内总维生素C水平随干预浓度增加而升高,热处理的细胞在2、4、8 mmol/L维生素C干预后,细胞内维生素C水平均高于37℃(P<0.05);分组干预后,与对照组相比,维生素C组、热处理组及联合组的细胞内葡萄糖摄取量均降低(P<0.05),且热处理组低于维生素C组(P<0.05),而联合组又低于维生素C组和热处理组(P<0.05);三个干预组的GLUT1、PI3K、p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平均低于对照组(P<0.05),维生素C组的GLUT3、HIF-1α,及联合组的GLUT3、HIF-1α、AKT均低于对照组(P<0.05);联合组的GLUT1、PI3K、p-PI3K蛋白表达水平低于维生素C组(P<0.05),联合组的GLUT3、AKT、p-PI3K、HIF-1α均低于维生素C组和热处理组(P<0.05)。结论维生素C联合热处理显著地抑制A549细胞PI3K/AKT/HIF-1α通路,下调GLUT1和GLUT3的表达,减少细胞内的葡萄糖摄取,抑制A549细胞增殖。

吴茱萸碱对子宫内膜癌细胞EMT及JAK/STAT3/HIF-1α通路的影响

目的探究吴茱萸碱(EVO)对子宫内膜癌(EC)细胞的抗癌作用,并探讨其可能的作用机制。方法培养EC细胞株HEC-1A、Ishikawa和AN3CA,不同浓度EVO(0、1、2、4、8μmol/L)处理,噻唑蓝(MTT)检测EVO对不同EC细胞株增殖的影响并计算半数抑制浓度(IC50)。培养Ishikawa细胞,将其分为:Control组(不做任何处理)、EVO组(4μmol/L EVO)、AG490组[50μmol/L AG490,Janus激酶(JAK)抑制剂]、EVO+RO8191组(4μmol/L EVO+20μmol/L RO8191,JAK激动剂)。分别使用划痕实验和Transwell实验检测各组Ishikawa细胞迁移和侵袭能力;蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测上皮-间质转化(EMT)及JAK/转录激活因子3(STAT3)/缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)信号通路相关蛋白水平。结果MTT结果显示,EVO对HEC-1A、Ishikawa和AN3CA细胞增殖有明显的抑制作用,且呈浓度依赖性(P<0.05);EVO可显著抑制Ishikawa细胞的迁移和侵袭,上调上皮标志物E-钙粘附蛋白(E-cadherin)的蛋白表达,下调间质标志物E-钙粘附蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)以及磷酸化JAK2(p-JAK2)、p-STAT3、HIF-1α的蛋白表达(P<0.05)。与EVO组相比,EVO+RO8191组Ishikawa细胞的划痕愈合率、侵袭率及N-cadherin、Vimentin、p-JAK2、p-STAT3、HIF-1α蛋白水平明显增高,E-cadherin蛋白水平明显降低(P<0.05)。结论EVO通过抑制EC细胞EMT及JAK/STAT3/HIF-1α通路进而抑制细胞迁移和侵袭。

竹叶提取物通过调控Akt/HIF-1α通路抑制低氧条件下人乳腺癌MCF-7细胞的恶性生长

目的探究竹叶提取物对低氧条件下人乳腺癌MCF-7细胞恶性生长的影响及分子机制。方法将培养的人乳腺癌MCF-7细胞随机分为正常组、低氧组以及0.2、0.4、0.8μg/mL竹叶提取物组和0.8μg/mL竹叶提取物组+IGF-1组。CCK-8法检测各组细胞的增殖活性变化,RT-PCR和Western blot检测细胞增殖标记蛋白PCNA、Ki-67和MCM2表达,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡变化。Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3和survivin表达;并探讨Akt/HIF-1α通路在竹叶提取物抑制癌细胞生长中的作用。结果竹叶提取物处理后,低氧下MCF-7细胞的增殖活性和PCNA、Ki-67和MCM2的表达显著性降低并呈现剂量依赖性(P<0.01);而细胞G2/M期比例增加(P<0.01);此外,竹叶提取物处理后细胞凋亡率明显增加,同时Bax和caspase-3表达上调,Bcl-2和survivin表达下调(P<0.01);此外,竹叶提取物组Akt/HIF-1α通路中p-Akt和HIF-1α的表达下调(P<0.01),Akt/HIF-1α通路激动剂IGF-1可逆转竹叶提取物对低氧下MCF-7恶性生长的抑制作用。结论竹叶提取物可通过下调Akt/HIF-1α信号通路抑制低氧条件下人乳腺癌MCF-7细胞恶性生长。

健脾化瘀解毒方调控PI3K/Akt/HIF-1α通路干预胃癌前病变大鼠胃黏膜上皮细胞自噬及凋亡

目的探讨健脾化瘀解毒方(JPHY)调控PI3K/Akt/HIF-1α通路干预胃癌前病变(GPL)大鼠胃黏膜上皮细胞自噬及凋亡的机制。方法采用200μg·mL^(-1) N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)自由饮用+隔日禁食法造模28周复制GPL模型。将SD大鼠随机均分为空白组、模型组、维酶素组(270 mg·kg^(-1))、JPHY高剂量组(9 g·kg^(-1))和JPHY低剂量组(4.5 g·kg^(-1)),每组18只。第15周起,各给药组大鼠每天灌胃给药(10 mL·kg^(-1))1次,连续25周。分别于第18、28和39周,每组随机取6只大鼠,采用HE染色法观察大鼠胃黏膜组织病理学形态变化;Western Blot法测定胃黏膜组织PI3K、Akt、HIF-1α、Beclin1、Bcl-2、BAX蛋白的表达。结果与空白组比较,模型组大鼠胃黏膜组织固有腺变薄,非固有腺锯齿样变,弥漫性细胞空泡样变,固有腺细胞变为体积小、胞质少、核质比例大、深染的异型增生细胞,呈假复层、跨腺腔灶状分布,有炎性细胞浸润,表现为以肠上皮化生为主;第18周,大鼠胃黏膜组织的PI3K、Akt蛋白表达明显下调(P<0.05,P<0.01),HIF-1α、Beclin1、Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/BAX比值明显上调(P<0.05,P<0.01);第28周,PI3K、Akt、BAX蛋白表达明显下调(P<0.05,P<0.01),HIF-1α、Beclin1蛋白表达及Bcl-2/BAX比值明显上调(P<0.01);第39周,Akt蛋白表达明显下调(P<0.05),HIF-1α、Beclin1、Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/BAX比值明显上调(P<0.05,P<0.01),PI3K、BAX蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较,JPHY高剂量组的胃黏膜改善作用最明显,异型增生细胞数量、分布范围和分布密度有明显减少,固有层厚度明显增加,腺腔结构趋于正常;第18周的PI3K、Akt蛋白表达明显上调(P<0.01),HIF-1α、Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/BAX比值明显下调(P<0.05);第28周的PI3K、Akt、BAX蛋白表达明显上调(P<0.05,P<0.01),HIF-1α、Beclin1蛋白表达及Bcl-2/BAX比值表达明显下调(P<0.01);第39周Akt蛋白表达明显上调(P<0.01),HIF-1α、Beclin1蛋白表达及Bcl-2/BAX比值明显下调(P<0.05,P<0.01)。结论JPHY对GPL不同阶段的黏膜损伤均有明显保护作用,可能与其通过PI3K/Akt/HIF-1α通路调节肿瘤缺氧微环境以及调控细胞自噬、凋亡作用有关。

Keap1/Nrf2/HIF-1α通路在宫颈癌中的表达及临床意义研究

目的探讨Keap1/Nrf2/HIF-1α通路在宫颈癌患者中的表达及临床意义。方法选择2017年3月～2018年10月江西省萍乡市湘雅萍矿合作医院治疗的40例宫颈癌患者作为研究对象,所有患者均行手术治疗,术中切除病灶组织及癌旁组织,获得新鲜标本。采用免疫组织化学法测定获得宫颈癌组织及癌旁组织的低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、NF-E_2相关因子2(Nrf2)、Keap1阳性率。采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术测定Keap1-Nrf2-HIF-lα基因通路表达量。结果宫颈癌组织中的HIF-1α、Nrf2、Keap1阳性率,均高于癌旁组织(P<0.05)。免疫组化下Nrf2主要表达于宫颈癌细胞核内,部分位于胞质内,而HIF-1α、Keap1在宫颈癌组织中多表达于细胞胞质内。宫颈癌组织中的Keap1/Nrf2/HIF-1α基因通路表达量,高于癌旁组织(P<0.05)。结论 Keap1/Nrf2/HIF-1a通路在宫颈癌中呈表达,可能参与了宫颈癌疾病发生和发展的过程。

2-APB通过PKCα/HIF-1α信号通路抑制H_(2)O_(2)诱导的软骨细胞凋亡

目的探讨2-氨基乙氧基苯硼酸(2-APB)对H_(2)O_(2)诱导的软骨细胞凋亡的作用及其机制。方法实验分为Control组、H_(2)O_(2)组、2-APB组和H_(2)O_(2)+2-APB组。CCK-8法检测各组细胞活力;显微镜下观察2-APB对H_(2)O_(2)诱导的软骨细胞形态变化的影响;TUNEL法和流式细胞术检测软骨细胞凋亡情况;流式细胞术检测脂质活性氧(ROS)水平;Western blot法检测2-APB对H_(2)O_(2)诱导的各组细胞中Cleaved-PARP、p-PKCα和HIF-1α蛋白的表达情况;免疫荧光法检测PKCα抑制剂BIM-Ⅰ对H_(2)O_(2)诱导的各组细胞中HIF-1α的荧光表达情况。结果2-APB对H_(2)O_(2)诱导的软骨细胞凋亡具有抑制作用,且当2-APB浓度为100μmol/L时抑制效果最为显著(F=235.80,P<0.01);2-APB能够抑制H_(2)O_(2)所致软骨细胞凋亡阳性率(F=114.80,P<0.01)以及ROS的水平(F=52.99,P<0.01),并且抑制Cleaved-PARP(F=10.10,P<0.05)、p-PKCα(F=24.56,P<0.05)和HIF-1α(F=6.85,P<0.05)蛋白的表达;PKCα抑制剂BIM-Ⅰ能够抑制H_(2)O_(2)所致HIF-1α荧光强度的增加。结论2-APB可以通过抑制PKCα/HIF-1α通路减少H_(2)O_(2)诱导的软骨细胞凋亡,进而保护软骨细胞。

基于mTOR/HIF-1α通路探讨温阳化饮方对哮喘寒饮蕴肺证大鼠气道炎症细胞自噬的机制研究

目的 通过实验研究探讨温阳化饮方通过mTOR/HIF-1α信号通路干预哮喘寒饮蕴肺证大鼠气道炎症细胞的自噬机制。方法 SPF级Wistar雄性大鼠60只随机分为空白组、模型组、温阳化饮方组、小青龙汤组、雷帕霉素组,每组12只;建立哮喘寒饮蕴肺证大鼠模型;分别给予温阳化饮方、小青龙汤、雷帕霉素治疗。观察大鼠一般行为学、体重变化;检测肺功能情况、支气管肺泡灌洗液炎症因子、血清炎症因子;HE、Masson染色观察肺组织病理变化;透射电镜观察肺组织自噬小体;实时荧光定量PCR检测HIF-1α mRNA、mTOR mRNA、Beclin1 mRNA、ATG5 mRNA表达;Western blot检测HIF-1α、Beclin 1的蛋白表达。结果 与空白组相比,模型组大鼠出现一系列的不良生理和生化变化,其中包括体重负增长趋势,肺功能指标Ri、Re显著增高,Cdyn显著下降,肺组织及气道组织出现炎性细胞浸润、水肿、出血及坏死的情况,支气管肺泡灌洗液(BALF)IL-4、IL-13、YKL-40表达显著上升,血清中TNF-α表达明显上升,IFN-γ表达明显下降,HIF-1α表达显著上升,自噬基因及蛋白显著表达下降。与模型组相比,其他各给药组通过给予温阳化饮方、小青龙汤、雷帕霉素后各项指标均出现不同程度的改善,以温阳化饮方组效果最佳。结论 温阳化饮方可以改善大鼠体内的缺氧环境,增加自噬水平,并抑制mTOR/HIF-1α表达,从而缓解气道炎症。

基于Nrf2/HO-1/HIF-1α通路探讨升降散对EAE鼠巨噬细胞的调控作用

目的为探讨升降散(SJP)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)鼠巨噬细胞的调控作用,并进一步揭示其作用的靶点。方法将40只C57BL/6小鼠随机分为正常组(CON)、模型组(MOD)、升降散低剂量组(SJP-L)、升降散高剂量组(SJP-H)和醋酸泼尼松组(PAT)。除正常组以外,余下组别小鼠均构建EAE模型。通过行为学评分、体重变化和组织HE染色病理学评分评估药物疗效。采用免疫组织化学染色法测定CD86和CD206的表达,通过蛋白质免疫印迹法检测脊髓核因子E2相关因子2(Nuclear factor-E2-related factor2,Nrf2),血红素加氧酶1(Heme oxygenase-1,HO-1),超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD),缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)的表达水平。结果与MOD相比,SJP各剂量组和PAT组显著缓解了EAE小鼠神经功能的缺损(P<0.05或P<0.01),减轻了中枢神经系统的炎症浸润(P<0.01或P<0.001);与CON组相比,MOD组的CD86表达明显升高(P<0.001),CD206的表达明显降低(P<0.001),与MOD组相比,SJP组抑制了CD86的表达(P<0.01或P<0.001),上调了CD206的表达(P<0.001);与CON组相比,MOD组Nrf2、HO-1和SOD-1蛋白显示出下调趋势(P<0.05,P<0.01或P<0.001),而HIF-1α被上调(P<0.01),SJP干预后上调了Nrf2、HO-1和SOD-1的水平(P<0.01),抑制了HIF-1α的表达(P<0.01)。结论升降散能通过调节巨噬细胞M1/M2的免疫平衡改善EAE鼠的临床症状,并减轻病灶的炎症浸润。同时高剂量升降散对Nrf2/HO-1/HIF-1α通路的活化具有一定的调节作用。

天麻素对帕金森氏症模型大鼠mTOR/HIF-1α通路、糖酵解代谢的影响

目的探讨天麻素对帕金森氏症模型大鼠mTOR/HIF-1α通路、糖酵解代谢的影响。方法40只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、天麻素低剂量组、高剂量组,每组10只。模型组、天麻素低剂量组、高剂量组均进行中脑黑质致密部(substantia nigra pars compacta,SNc)注射脂多糖(LPS)以建立PD模型,天麻素低剂量组、高剂量组给予10、50 mg/kg天麻素水溶液腹腔注射,持续9 d。旷场实验、网格测试检测行为学变化,western blot检测p-mTOR、HIF-1α、IL-1β表达,免疫荧光检测酪氨酸羟化酶(TH)、IBA1、HIF-1α表达,HK活性、乳酸含量检测糖酵解代谢情况。结果与正常对照组相比,模型组动物在旷场中央区域停留时间比例下降(P<0.01),网格上逃避潜伏期延长(P<0.01),SNc脑区TH表达明显下降(P<0.01),己糖激酶(HK)活性、乳酸含量上升(P<0.01),IBA1、IL-1β、p-mTOR、HIF-1α表达明显上升(P<0.01);与模型组相比,天麻素低剂量组、高剂量组动物在旷场中央区域停留时间比例上升(P<0.05或P<0.01),网格逃避潜伏期均缩短(P<0.01),SNc脑区TH表达上升(P<0.01),HK活性、乳酸含量下降(P<0.05或P<0.01),IBA1、IL-1β、p-mTOR、HIF-1α表达下降(P<0.05或P<0.01)。结论天麻素干预可能调节小胶质细胞,通过调节mTOR/HIF-1α通路、糖酵解代谢,抑制TH+神经元丢失,从而改善PD大鼠神经行为学损伤。

二至丸合桂枝汤对三阴性乳腺癌细胞系顺铂耐药性的调控作用

目的:探讨二至丸合桂枝汤对三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系顺铂耐药性的影响及其分子机制作用。方法:设计并合成3条缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)siRNA,分为1#siRNA组、2#siRNA组、3#siRNA组、阴性对照组及Control组分别转染,Western blot筛选最适siRNA。同时利用药物连续诱导法筛选顺铂耐药性MDA-MB-231细胞株(MDA-MB-231/CDDP)。制备含二至丸合桂枝汤血清,MDA-MB-231/CDDP细胞株随机分为A:空白组(转染siRNA阴性对照)、B:HIF-1αsiRNA组、C:HIF-1αsiRNA+二至丸合桂枝汤组(200μg/ml含药血清)、D:HIF-1αsiRNA+二至丸合桂枝汤(200μg/ml)+顺铂(10μmol/L)组,继续培养,检测细胞活性、细胞凋亡及细胞侵袭情况。同时利用qRT-PCR和Western blot分别检测各组细胞中血管内皮生长因子(VEGF)、HIF-1αm RNA及蛋白表达情况。结果:3#siRNA组HIF-1α蛋白表达水平抑制最显著,选此siRNA用于后续研究。与A组相比,C组和D组在作用24h、48h后均可显著抑制MDA-MB-231/CDDP细胞活性(P<0.05或P<0.01),细胞凋亡率显著升高(P<0.01),且能显著抑制细胞侵袭能力(P<0.05或P<0.01),其中,D组作用效果最显著。q RT-PCR和Western blot检测结果显示二至丸合桂枝汤与顺铂联合干预,可显著下调MDA-MB-231/CDDP细胞中VEGF、HIF-1ɑmRNA及蛋白表达。结论:二至丸合桂枝汤可通过抑制HIF-1α通路,下调VEGF表达,调控TNBC细胞系的顺铂耐药性。

白藜芦醇对碘海醇所致糖尿病大鼠肾损伤的作用及其机制

目的观察SIRT1激动剂——白藜芦醇对碘海醇所致糖尿病大鼠肾损伤的作用,并初步探讨其作用机制。方法 SPF级糖尿病大鼠45只,体质量250～300 g。采用股静脉注射碘海醇法建立糖尿病大鼠肾损伤模型,采用随机数字表法随机分为3组:假手术组(Sham组,n=15)、碘海醇组(NL组,n=15)及白藜芦醇组(Res组,n=15)。Res组于大鼠建模前白藜芦醇(100 mg/kg)灌胃,NL组及Sham组分别给予等量生理盐水,连续给药5 d。模型建立48 h后处死大鼠,观察各组大鼠血肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)浓度; HE染色观察肾脏病理学变化;ELISA检测血清中总超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醇(MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)浓度; TUNEL检测肾上皮细胞凋亡情况; qRT-PCR、Western blotting检测SIRT1、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达。结果与Sham组比较,NL组大鼠肾小管上皮细胞空泡变性,细胞脱落至小管腔,肾小管结构破坏,肾小管上皮细胞凋亡明显,血浆总Scr、BUN、MDA明显升高,T-SOD、GPX明显降低(均P <0.05);肾脏组中SIRT1表达明显降低,而HIF-1α表达明显升高(均P <0.05)。白藜芦醇可以减轻碘海醇所致的糖尿病大鼠肾损伤,与NL组比较,Res组肾小管上皮细胞损伤较轻,仅有少量肾小管细胞凋亡,血浆T-SOD、GPX明显升高,Scr、BUN、MDA明显降低(均P <0.05);肾脏组中HIF-1α表达明显降低,而SIRT1表达明显升高(P <0.05)。结论白藜芦醇可以改善碘海醇导致的糖尿病肾病大鼠肾功能,减少肾小管上皮细胞凋亡,抑制氧化应激,其机制可能与调控SIRT1/HIF-1α通路有关。

丹参-红花药对对急性心肌缺血大鼠心肌损伤的保护作用及机制研究

目的观察丹参-红花药对(简称药对)对急性心肌缺血模型大鼠心肌损伤的保护作用,并对其机制进行了初探。方法将SD大鼠随机分为空白组、模型组、药对组和药对+2-甲氧基雌二醇组,大鼠sc盐酸异丙肾上腺素(Iso)建模,连续2 d,于造模12 h后,ig给予相应药物,空白组和模型组给予等体积纯净水,连续给药7 d;于末次给药后1 h,麻醉大鼠,收集血液和心肌组织,用于生化、病理和凋亡检测。结果药对可显著抑制Iso诱导的心肌缺血模型大鼠心肌细胞的凋亡,降低心肌损伤标志物的升高,改善心肌的病理损伤。结论药对可能是通过调节参与细胞凋亡的HIF-1α通路实现对大鼠心肌损伤的保护作用。