shRNA表达载体pWH1的构建及用于HIF1基因的沉默

目的:构建用于RNAi的shRNA(small hairpinRNA)表达载体及检测其对低氧诱导因子-1(Hypoxia-inducibleFactor-1,HIF1)基因的沉默效果。方法:从人血基因组中PCR扩增出H1基因启动子,克隆入酶切处理后的pEGFP-C1载体片段中,此载体命名为pWH1。以人HIF1cDNA基因为靶标设计引物,退火后克隆入pWH1。新的载体转染SGC7901细胞,然后用RT-PCR和Western blot检测HIF1基因的表达改变。结果:构建的pWH1载体能很好地表达针对HIF1基因的shRNA,RT-PCR和Western blot的结果显示HIF1基因的mRNA和蛋白表达水平均明显下降。结论:成功构建了shRNA表达载体pWH1,这对于基因的功能研究具有重要的意义。

不同处理小鼠卵巢组织中HIF1α基因的表达分析及其真核表达载体构建

为研究低氧诱导因子1α(HIF1α)及其下游基因胰岛素样生长因子2(IGF-2)和血管内皮生长因子(VEGF)在注射孕马血清促性腺激素(PMSG)(促排组)的促排卵巢与注射生理盐水(对照组)的普通卵巢组织中的mRNA转录水平,构建小鼠HIF1α基因真核表达载体,观察其转染的小鼠颗粒细胞中HIF1α基因的表达情况,以探讨HIF1α与小鼠卵泡发育的关系。用荧光定量PCR检测不同处理组织中HIF1α、VEGF及IGF-2 mRNA转录水平,免疫组化技术定位HIF1α在卵泡中的表达,基因重组技术构建HIF1α-pcDNA3.1真核表达载体并将其转染小鼠颗粒细胞,荧光定量PCR与Western blot技术检测转染细胞中HIF1α表达情况。结果表明:HIF1α在促排小鼠卵巢中的mRNA转录水平极显著高于普通小鼠卵巢组织(P<0.01),在促排组和对照组的其他组织内HIF1αmRNA转录水平并无显著差异;HIF1下游基因VEGF和IGF-2在促排小鼠卵巢组织中的转录水平分别显著(P<0.05)与极显著(P<0.01)高于普通小鼠卵巢组织中的转录水平;卵泡发育至有腔卵泡后,HIF1α才开始在卵泡中表达;HIF1α-pcDNA3.1真核表达载体能够在颗粒细胞中转录HIF1αmRNA并翻译成蛋白。结论:HIF1α只在有腔卵泡内表达,其转录水平与卵巢内有腔卵泡数量成正相关,HIF1α通过上调VEGF和IGF-2参与卵泡的发育及成熟。

鲸类低氧耐受的分子机制初探:基于HIF1α和TSC1基因的生物信息学分析

鲸类(Cetacea)具有超强潜水能力,长时间潜水造成的体内低氧是其适应完全水生生活面临的挑战之一。为了克服体内低氧环境,鲸类产生了一系列低氧耐受相关的解剖和生理等方面的适应特征,然而这一适应的分子机制仍不清楚。本研究选择在细胞感知和适应内环境氧分压变化的过程中发挥重要作用的低氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor 1α,HIF1α)和低氧环境下抑制能量代谢的结节性复合物1(Tuberous sclerosis complex 1,TSC1)基因为候选基因,选择压力检测发现鲸类TSC1基因的6个正选择位点至少被两种最大似然法(Maximum Likelihood, ML)检测到,且通过与陆生哺乳动物同源序列比较分析,鲸类鉴定出7个特异的氨基酸突变。这些正选择和特异突变位点有30.77%(4/13)发生了激进氨基酸性质改变,且正选择位点位于重要结构域附近。正选择信号主要集中在鲸类内部各支系中,提示鲸类为了适应低氧环境,这两个基因可能发生了功能改变,以保护细胞免受低氧损伤。我们在低氧耐受不同类群间共检测到66个平行/趋同进化位点,为低氧耐受不同类群的趋同的低氧适应提供了分子证据。

贵州草海鲫鱼HIF-1α和HIF-2α基因克隆与表达分析

为研究鲫鱼中HIF不同亚型基因的结构与生物学功能,克隆获得鲫鱼中HIF同源基因的2种亚型,分别命名为Ca-HIF1α和Ca-HIF2α。其中,Ca-HIF1αcDNA全长共3867 bp,开放阅读框2322 bp,编码774个氨基酸。Ca-HIF2αcDNA全长共4647 bp,开放阅读框2460 bp,编码820个氨基酸。预测蛋白质的分子质量分别为85.844、91.228 ku,等电点分别为5.12和6.20。SMART分析结果可知,二者具有HLH、PAS和PAC结构域,此外,多序列比对结果显示二者还具有ODD、N-TAD和C-TAD功能域。进化树结构表明,Ca-HIF2α比Ca-HIF1α进化得要快。实时荧光定量PCR结果显示,Ca-HIF2αmRNA在所检测组织中的相对表达量均高于Ca-HIF1αmRNA的表达量。此外,Ca-HIF1α和Ca-HIF2αmRNA在肝脏和鳃的相对表达量最高。

应用CRISPR／cas9系统敲除HIF1α基因抑制前列腺癌DU145细胞的增殖和侵袭

目的应用新型基因编辑工具CRISPR/cas9（clustered regularly interspaced palindromic repeat/CRISPR-associated system 9）在前列腺癌DU145细胞中部分敲除HIF1α基因，以探讨转录因子HIF1α（hypoxia-inducible factor-1α）的功能及其对前列腺癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响。方法以HIF1α-exon 1为靶点，设计两条sgRNA序列，构建CRISPR/cas9系统，在前列腺癌DU145细胞中敲除HIF1α基因，并利用CCK8、Transwell实验分析部分敲除HIF1α对前列腺癌DU145细胞增殖、迁移、侵袭的影响。结果酶切及测序结果显示HIF1α部分敲除成功。部分敲除HIF1α基因后，其表达水平明显下调，可显著抑制DU145细胞增殖、迁移、侵袭。结论成功构建了HIF1α CRISPR/cas9基因敲除系统，可显著抑制前列腺癌DU145细胞增殖、迁移、侵袭能力。该系统可为深入研究HIF1α基因的功能提供新的工具。

Tet-on基因表达系统调控HIF-1α表达对肝癌细胞增殖的影响

目的 探讨HIF-1α表达对肝癌细胞增殖和细胞周期的影响.方法 利用Tet-on基因表达系统调控肝癌细胞系HepG2中HIF-1α的表达,检测细胞周期和细胞增殖的变化.结果 酶切和DNA测序证实Tet-on基因表达系统反应质粒PTRE-HIF-1α构建成功.获得了受强力霉素调控、稳定表达HIF-1α的肝癌细胞.随着强力霉素浓度增加,hiF-1α基因表达增加,HIF-1α在体外明显增加HepG2细胞增殖活性;G0/G1期细胞指数减少,细胞增殖指数增多.RT-PCR检测结果表明,随着HIF-1α基因表达增加,Cyclin A mRNA表达增加（P＜0.001）,Cyclin D1和Cyclin E mRNA表达水平无明显变化（P＞0.05）.结论 HIF-1α基因在体外可以通过HIF-1α表达水平的增加而促进肝癌细胞增殖活性,通过CyclinA表达增加缩短了肝癌细胞增殖周期.

罗格列酮对骨髓瘤细胞HIF1α和IGF1mRNA表达的影响及其可能机制

目的 观察罗格列酮作用后骨髓瘤细胞HIF1α和IGF1 mRNA表达水平,探讨罗格列酮抑制骨髓瘤血管形成的可能机制.方法 以骨髓瘤细胞系RPMI 8226细胞及5例初诊多发性骨髓瘤患者骨髓浆细胞（CD138免疫磁珠筛选,作为骨髓瘤原代细胞）为研究对象,采用RT-PCR法检测用不同浓度（10、20、40 μmol/L）罗格列酮处理前后骨髓瘤细胞HIF1α、IGF1 mRNA表达水平;采用Westernblot法检测AKT和ERK蛋白磷酸化和非磷酸化表达的情况.同时以5例缺铁性贫血患者的骨髓单个核细胞为对照组.结果 RPMI8226细胞和骨髓瘤原代细胞HIF1α和IGF1 mRNA表达显著高于对照组.罗格列酮浓度为20 μmol/L处理48 h后,与对照组相比,RPMI 8226细胞中HIF1α、IGF1 mRNA相对表达水平分别由1.21±0.08和0.62±0.06降至0.75±0.06和0.32±0.04,骨髓瘤原代细胞中HIF1α、IGF1mRNA表达水平分别由2.02±0.16和1.92±0.13降至0.53±0.04和0.58±0.03,差异均有统计学意义（P值均＜0.05）,且呈剂量依赖性;10、20、40 μmol/L罗格列酮均可抑制RPMI8226细胞pAKT、pERK蛋白的表达,然而对骨髓瘤原代细胞T-AKT和T-ERK蛋白表达没有明显影响.结论 罗格列酮可抑制HIF1α、IGF1 mRNA的表达,降低pAKT和pERK蛋白的表达可能是其抑制肿瘤血管形成机制之一.