抑制hIL-1β基因表达的植物成分的研究

目的 寻求能够抑制hIL - 1β基因表达的植物活性成分 ,为新药开发提供先导化合物。 方法 采用一步法RT -PCR对hIL - 1β基因的表达进行定量 ,追踪植物的活性成分。 结果 找到了两个活性成分 ,并已鉴定出为两个不饱和脂肪酸。结论 通过这种方法能够找到新的活性化合物。

不同剂量rhIL-1β保护γ线照射小鼠的实验研究

以60Coγ射线照射小鼠为模型，研究了rhIL－1β不同剂量对照射小鼠造血恢复的影响。结果给予不同剂量rhIL－1β（3×103u／鼠～3×105u／鼠）后可使6．5Gy照射小鼠外周血白细胞、红细胞及血小板的恢复明显加快，照后10d骨髓CFU－GM、BFU－E及BFU－Meg含量随给药剂量加大而增加。表明rhIL－1β能促进照射小鼠的造血功能恢复。

hIL-1Ra基因的克隆及在原核细胞中的表达

目的 :克隆hIL 1Ra基因并在大肠杆菌中高效表达。方法 :从人外周血中分离白细胞并提取其总RNA。用RT PCR获得hIL 1RacDNA ,克隆入pBV2 2 0表达载体进行诱导表达。对表达产物进行复性和纯化。结果 :成功地构建了pBV2 2 0 IL 1Ra表达载体 ,并在大肠杆菌中获得高效表达 ,表达量占全菌的 4 0 %。对表达产物进行分离纯化及活性分析表明 ,获得纯度大于98%的样品。该样品具有明显抑制IL 1刺激EL 4细胞分泌IL 2的作用。结论 :在大肠杆菌中成功地表达有活性的hIL 1Ra基因 ,为进一步的开发利用奠定了实验基础。

重组免疫毒素hIL-2-LuffinP1对淋巴细胞体外增殖的影响

目的检测基因工程免疫毒素hIL-2-LuffinP1的体外生物学活性。方法采用分离的C57和BALB/c小鼠脾细胞进行混合淋巴细胞反应,刀豆球蛋白A(ConA)刺激BALB/c小鼠脾细胞进行淋巴细胞增殖实验,以LuffinP1毒素分子作为对照。3H-TdR核素掺入法检测hIL-2-LuffinP1对淋巴细胞增殖的抑制作用。以CTLL-2细胞检测hIL-2-LuffinP1对IL-2依赖细胞株的杀伤作用,实验共设6组:PBS、IL-2、LuffinP1、LuffinP1+IL-2、hIL-2-LuffinP1、hIL-2-LuffinP1+IL-2,CTLL-2细胞加入各组试剂培养12h,台盼蓝染色,计数每100个细胞中的死亡细胞数。结果随剂量增加,hIL-2-LuffinP1对淋巴细胞增殖的抑制作用逐渐增强,在10-6mol/L浓度时,抑制率可达到97%,而LuffinP1对淋巴细胞增殖无明显抑制作用。hIL-2-LuffinP1对Con A刺激的脾细胞活化也有抑制作用,与在混合淋巴细胞体系中一致,而LuffinP1对上述两个反应体系中的淋巴细胞增殖均无明显抑制作用。加入hIL-2-LuffinP1+IL-2和hIL-2-LuffinP1后CTLL-2细胞的死亡率分别为29.6%和47.4%,明显高于IL-2组(5.6%,P<0.01)。结论重组免疫毒素hIL-2-LuffinP1在体外能够抑制淋巴细胞增殖,对表达IL-2R的活化淋巴细胞产生定向杀伤作用。

抗人IL-1β单链抗体的构建及其中和活性的检测

目的:原核表达抗人IL-1β(hIL-1β)的scFv,并对纯化后抗体的特异性、亲和力以及中和活性进行检测,为研制治疗类风湿关节炎的小分子抗体药物奠定基础。方法:使用PCR方法从含有抗hIL-1β抗体基因的质粒中获得抗hIL-1β的单链抗体基因,将其插入原核表达载体pET-27b(+)中,构建重组表达载体pET-27b-A-hIL-1β-scFv。将该载体转化大肠杆菌Rosetta后诱导表达,经包涵体变性、复性得到可溶的抗hIL-1βscFv蛋白。利用高效液相色谱仪对其纯度进行分析后使用Western blot和ELISA方法测定scFv抗体对抗原特异性结合能力和亲和力,使用MTT的方法检测scFv抗体中和人IL-1β蛋白的能力。结果:成功地对抗hIL-1β单链抗体进行构建、诱导、表达和纯化。得到纯度为72.05%、相对分子质量约为28 ku的目的蛋白。ELISA和Western blot结果证实scFv蛋白对hIL-1β具有特异性结合能力。MTT实验结果证实该scFv抗体可以有效阻断hIL-1β刺激L929细胞的增殖。结论:通过原核表达系统得到的抗hIL-1β单链抗体,纯化后,鉴定其与hIL-1β蛋白有特异性结合能力,并且表现出中和hIL-1β的活性,为进一步研究治疗RA的小分子抗体奠定了基础。

FUS1/hIL-12双基因阳离子脂质体复合物特性研究

研究FUS1/hIL-12双基因阳离子脂质体复合物的生物学和药剂学特性,评估其作为肺癌基因治疗药物的转染效率、稳定性以及毒性。阳离子脂质体与质粒以不同质量比配制后用凝胶阻滞实验和激光粒度仪测定粒径和zeta电位确定阳离子脂质体与质粒DNA的最佳配比;通过分别转染增强型绿色荧光蛋白质粒EGFP和PVITO2-hIL12/FUS1双基因质粒入A549肺癌细胞,倒置荧光显微镜、细胞爬片免疫组化和酶联免疫法分别检测EGFP、FUS1和hIL-12在肺癌细胞中的表达;以琼脂糖凝胶电泳检测双基因脂质体复合物与血清和DNaseⅠ孵育的稳定性;通过双基因脂质体复合物与红细胞孵育后显微镜观察其对红细胞形态的影响。研究结果为将来FUS1/hIL-12双基因阳离子脂质体复合物用于肺癌的基因治疗奠定了基础。