重组hIL-10质粒构建及其在毕赤酵母SMD1168中的表达和纯化

构建重组hIL-10真核表达载体,探索在毕赤酵母中的表达,为进一步研究hIL-10生物学功能及临床应用奠定基础。PCR扩增目的基因hIL-10cDNA,经EcoRI/XbaI双酶切后,将其亚克隆至同样双酶切的载体pPICZaA中,构建表达质粒pPICZaA-hIL-10;电转化法,将其转入毕赤酵母SMD1168,甲醇诱导Mut+型转化子基因表达;对目的蛋白进行检测及纯化。扩增出了目的基因hIL-10cDNA,重组质粒pPICZaA-hIL-10经酶切鉴定和序列测定正确;表达产物经SDS-PAGE分析在42.0kD处可见较浓染条带,Westernblotting分析可见特异条带;ELISA检测72h上清液中目的蛋白浓度可达1.973mg/L;纯化后目的蛋白纯度达67.0%。实现了重组hIL-10在毕赤酵母SMD1168中的成功表达和初步纯化。

hIL-10修饰树突状细胞对实验动物淋巴细胞增殖及胞毒效应的影响

目的 :探讨hIL 10修饰DC对实验动物免疫功能的影响。方法 :将经hIL 10基因修饰或未修饰DC腹腔注射C5 7BL 6致敏小鼠 ,以致敏或未致敏C5 7BL 6单个核细胞作为反应细胞 ,以未修饰DC细胞及修饰DC为刺激细胞 ,共培养 6天 ,MTT检测细胞增殖 ,乳酸脱氢酶法测定细胞毒活性。结果 :hIL 10对未修饰DC致敏或未致敏小鼠的同种细胞刺激的增殖反应有明显的抑制作用。hIL 10修饰DC诱导不同组小鼠淋巴细胞增殖反应显著低于未修饰DC细胞诱导小鼠淋巴细胞增殖反应 ,hIL 10修饰DC对不同组小鼠CTL细胞毒活性具有抵抗作用。结论 :hIL 10修饰的DC诱导同种小鼠淋巴细胞的增殖反应显著降低和对CTL胞毒活性抵抗。

重组hIL-10在毕赤酵母X-33的表达及其生物活性鉴定

目的:用毕赤酵母表达hIL-10并探索合适的表达条件,为IL-10生物制品研发及临床应用奠定基础。方法:以0.5%甲醇诱导酵母X-33表达rhIL-10,用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定rhIL-10,比较不同温度、不同pH值和有无PMSF条件下rhIL-10的表达水平。用ELISA法测定培养液rhIL-10含量,用Bradford法测定培养液总蛋白含量,计算rhIL-10占总蛋白的比例。以淋巴细胞转化试验分析rhIL-10的生物学活性。结果:SDS-PAGE后可见42 kD左右蛋白条带;Western blot也检测到42kD左右特异性蛋白质条带。pH值为6.0、温度在28℃并加入抑制剂时rhIL-10表达量最高值为20 mg/L,同时段培养液中总蛋白质含量为50 mg/L,rhIL-10占总蛋白比例为40%。在外周血淋巴细胞转化试验中,rhIL-10抑制了淋巴细胞的增殖。结论:hIL-10能在毕赤酵母高效表达,表达产物有较好生物活性;发酵条件对rhIL-10的表达水平影响大,改善发酵条件能促进rhIL-10的表达。

hIL-10在大肠杆菌中的表达及其生物学活性鉴定

构建了含有人白细胞介素-hIL-10(Human Interleuk in 10,hIL-10)基因的重组质粒,在大肠杆菌中的高效表达,并对其生物学活性进行了鉴定.用RT-PCR扩增hIL-10 cDNA,并插入原核表达载体PET-32b.将重组质粒转入BL21(DE3)感受态细胞,在37℃用IPTG诱导hIL-10表达.表达的重组蛋白经复性纯化后,用夹心ELISA法检测其对外周血单核细胞(PBMC)合成IFN-γ的抑制作用.重组质粒PET-32b/hIL-10的DNA序列分析显示,克隆的DNA序列和文献报道的hIL-10 cDNA序列一致.SDS-PAGE表明,重组蛋白相对分子质量为18 000.活性测定结果显示,重组蛋白能显著抑制PBMC合成IFN-γ.这表明构建的PET-32b/hIL-10可以在大肠杆菌中高效表达,经复性和纯化后,获得了具有高纯度和活性的hIL-10.

重组hIL-10对AA大鼠T淋巴细胞及IL-17A的影响研究

目的:以重组人白细胞介素-10(human interleukin-10,h IL-10)及其联合甲氨碟呤(MTX)作用佐剂性关节炎大鼠模型,检测T淋巴细胞亚群及IL-17A水平的变化情况,研究重组hIL-10及其联合MTX治疗佐剂性关节炎大鼠的效果。方法:用IL-10、MTX以及IL-10+MTX处理AA大鼠模型,用流式细胞仪测定各组大鼠血液中CD4^+T细胞与CD8^+T细胞比值,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠血清IL-17A的含量。结果:各治疗组CD4^+淋巴细胞总数与CD4^+/CD8^+值不同程度下降,各治疗组与模型组比较有显著性差异(P<0.05)。各治疗组IL-17A水平有不同程度下降,各治疗组与模型组比较有显著性差异(P<0.05),联合组与IL-10组比较有显著性差异(P<0.05)。结论:重组hIL-10能下调AA大鼠血液中CD4^+T细胞的数量及CD4^+/CD8^+比值,降低血清中IL-17A水平,联合组较IL-10组对血清中IL-17A影响更显著,提示重组hIL-10联合MTX在治疗类风湿关节炎中能更好地发挥作用。

重组hIL-10联合威灵仙总皂苷对AA大鼠关节影像的影响及机制

目的分析重组hIL-10联合威灵仙总皂苷对佐剂性关节炎大鼠(AA大鼠)关节影像学表现的影像及其影响的机制。方法将150只大鼠分为空白组、对照组、观察组1、观察组2、观察组3。空白组不接受任何干预。对照组仅接受关节炎模型建立干预。3个观察组大鼠除接受佐剂型关节炎模型建立干预外,分别接受威灵仙总皂苷治疗,重组hIL-10治疗和重组hIL-10联合威灵仙总皂苷治疗。于实验第0、15、35天分别行X线检查关节间隙和关节评分;35d后处死大鼠,取动脉血检测其淋巴细胞和血清炎症因子。结果实验15d后对照组和3个观察组骨侵蚀关节侵蚀评分显著高于空白组,关节间隙显著减小(P<0.05);实验35d后观察组小鼠骨侵蚀关节侵蚀评分显著低于对照组,关节间隙显著大于对照组(P<0.05)。观察组3CD4+T细胞、CD4+/CD8+、IL-17A、IL-6和TNF-α显著低于对照组和观察组1、2(P<0.05)。结论重组hIL-10联合威灵仙总皂苷可以通过调节免疫有效保护AA大鼠关节。

IL-10基因修饰的树突状细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究

目的:探讨hIL-10基因修饰的未成熟树突状细胞(imDC)诱导大鼠肝移植免疫耐受的能力。方法:行以DA大鼠为供体、Lewis大鼠为受体的同种异体原位肝移植100例,随机分为5组(每组4只):未注射DC组(对照组)、mDC组、imDC组、空载体组及hIL-10基因转染组;分别于移植前5d每天给Lewis大鼠腹腔注射mDC、imDC、空载体转染的imDC和hIL-10修饰的imDC各2×106个,于肝移植术后3、7、10d各处死4只,观察外周血肝功能及IL-12变化,并对移植后大鼠做生存分析。结果:IL-10组术后移植肝为非确定型急性排斥反应到轻度急性排斥反应。肝功能示IL-10组在7d、10d时,肝功能有所恢复,但与imDC组及空载体组相比差异无统计学意义。ELISA检测示,术后7d,IL-10组的血清IL-12浓度均低于mDC组及imDC组。IL-10组中位生存期(40d)长于其他组。结论:hIL-10基因修饰的imDC诱导同种异体大鼠肝移植免疫耐受能力显著增强,显著延长同种异体肝移植大鼠的生存期。

人白细胞介素—10基因探针的制备及应用

本文应用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出人ｈＩＬ－１０ｃＤＮＡ６１０ｂｐ基因片段，将此片段插入ｐＵＣ１８质粒中，经电泳检测和序列分析证实，扩增片段和发表序列一致酶切电泳回收纯化片段，地高辛随机引物标记，制备了ｈＩＬ－１０基因探针，应用斑点杂交检测了探针的灵敏度和特异性，结果表明该基因探针具有特异性强，灵敏度高，应用方便等特点，初步用于细胞系及ＥＢ病毒阳性的淋巴瘤组织中ｈＩＬ－１０ｍＲＮＡ表达的检测。

人白细胞介素10（hIL－10）基因的克隆和序列测定

应用逆转录多聚酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，自行设计并合成一对引物，成功地从活化的正常人外周血单个核细胞中扩增出ｈＩＬ－１０ｃＤＮＡ基因。并定向插入ｐＵＣ１８载体中，经ＤＮＡ序列测定最终确定为ｈｌＬ－１０ｃＤＮＡ基困，这将为令后ｈＩＬ－１０基因探针的制备和基因表达，进一步在基因水平上探讨ｈＩＬ－１０的生物学功能提供了物质基础。

IL-10基因在大鼠骨髓树突状细胞的表达

目的检测人白细胞介素10(hIL-10)基因在大鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞(immature dendritic cell,imDC)中的表达。方法实验分4组:mDC组、imDC组、空载体组及hIL-10基因转染组。用hIL-10真核表达载体(pIRES2-EGFP-hIL-10)转染大鼠骨髓来源的imDC,应用ELISA、Western blot、流式细胞术及混合淋巴细胞反应(MLR)检测hIL-10在各组中的表达。结果荧光显微镜观察显示pIRES2-EGFP-hIL-10质粒转染imDC后可见绿色荧光;ELISA检测hIL-10基因转染组的hIL-10表达明显高于mDC组、imDC组及空载体组;经Westen blot检测hIL-10基因转染组有hIL-10蛋白表达;流式细胞术显示hIL-10基因转染组hIL-10基因转染后imDC表面分子CD86、CD80与其他三组相比略呈低表达;转染后混合淋巴细胞反应(MLR)显示,hIL-10转染组的imDC对T细胞的增殖反应均弱于imDC组和空载体组(P=0.024和P=0.033)。结论外源性hIL-10基因成功导入大鼠imDC并表达。

人白细胞介素10的克隆及分泌表达

目的 :研究人白细胞介素 10 (hIL -10 )的高效分泌表达。方法 :根据Genbank报道的hIL -10基因序列 ,人工合成hIL -10基因 ,并将某些稀有密码子替换成E .Coli偏爱密码子 ,克隆至 pUC18质粒中 ,测序结果与预期一致。将hIL -10基因克隆至PET2 2b ,构建分泌表达克隆PET2 2b -hIL -10 ,经IPTG诱导在大肠杆菌BL2 1(DE3 )中表达hIL -10天然蛋白。结果 :SDS -PGAE电泳及凝胶密度扫描分析显示 ,重组蛋白分子量约为 18KD和 2 1KD(含信号肽 ) ,不同温度条件下重组蛋白的表达状态和表达量不同。结论 :18℃重组蛋白hIL -10的表达量为 7.6%。

鞘内注射人IL-10基因修饰的间质干细胞对慢性骨癌性疼痛大鼠的镇痛作用

目的人IL-10基因修饰的间质干细胞(hIL10-rMSCs)经皮鞘内注射入慢性骨癌性疼痛大鼠蛛网膜下腔,观察其在蛛网膜下腔存活情况及其对骨癌性疼痛大鼠的镇痛作用及机制。方法通过将Walker256大鼠腹水癌细胞PBS悬浮液10μL注入大鼠胫骨髓腔内建立骨癌性疼痛大鼠模型,并随机分为hIL10-rMSCs组、空载体-rMSCs组及control组,每组12只,分别经皮鞘内注射hIL10-rMSCs细胞悬液(1×10^6cells·mL^-1 )以及空载体-rMSCs细胞悬液(1×10^ 6cells·mL ^-1 )、生理盐水各30μL;各组大鼠分别于鞘内注射后3、7、14天测定机械性痛觉过敏(PWT)和热痛觉过敏(PWL),同时应用荧光激发、免疫组化及WB技术检测hIL10-rMSCs在蛛网膜下腔存活情况及腰段脊髓小胶质细胞OX-42、IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表达情况。结果与control组和空载体-rMSCs组相比,hIL10-rMSCs组PWT及PWL均明显升高,差异有统计学意义( P <0.05),而空载体-rMSCs组与control组比较差异无统计学意义( P >0.05);hIL10-rMSCs组和空载体-rMSCs组鞘内注射细胞7、14天后在荧光激发下可见绿色荧光细胞,而control组则未见绿色荧光细胞;与control组及空载体-rMSCs组相比,hIL10-rMSCs组脊髓腰段胶质细胞OX-42、IL-1β、IL-6和TNF-α表达明显降低( P <0.05),而这些指标在空载体-rMSCs组与对照组比较则无明显差异( P >0.05)。结论鞘内注射hIL10-rMSCs能通过抑制脊髓小胶质细胞活化,减少促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的释放在一定程度上减轻大鼠骨癌性疼痛。

人白细胞介素-10的克隆和表达

构建了含有人白细胞介素１０基因的重组质粒并在大肠杆菌中进行非分泌表达。表达蛋白经还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定Ｍｒ１８０００，经酶联免疫测定具有免疫活性，薄层扫描测知表达效率约２１．６％。本实验为进一步研制人白介素１０的基因工程药物奠定了基础。

IL-10基因修饰树突状细胞对大鼠皮肤移植免疫耐受的诱导

目的:探讨白介素10(IL-10)修饰的供体树突状细胞(dendriticcells,DC)对大鼠同种异体皮肤移植术后免疫耐受的诱导效果,为该基因治疗方法在皮肤移植的临床应用提供依据。方法:供体DC以humanIL-10基因修饰后,通过外周静脉输入受体体内,一周后行大鼠同种异体皮肤移植,根据实验分组观察受体移植皮肤存活情况。结果:对照组、未修饰DC组、hIL-10修饰DC组大鼠移植皮肤存活时间分别为(6.86±1.34)d、(7.57±2.45)d、(13.71±4.04)d,经统计学处理,未修饰DC组与对照组之间无显著性差异,而hIL-10修饰DC组与对照组之间有显著性差异(P<0.01)。结论:hIL-10修饰的供体DC预处理受体,可明显延长移植皮肤存活时间。

IL-10与器官移植

白细胞介素10（interleukin 10,IL-10）于1989年由Fiorentino等[1]发现,他们证明IL-10由Th2淋巴细胞和单核细胞合成分泌,具有抗炎和抑制多种细胞因子合成的作用,所以称之为细胞因子合成抑制因子（cytokine synthesisinhibitingfactor,CSIF）.人的IL-10（hIL-10）基因定位于第一号染色体上.在氨基酸水平,hIL-10与病毒IL-10（vIL-10）有84%的同源性,与鼠IL-10有73%的同源性.

在大鼠关节滑膜细胞表达人白细胞介素10的基因转移系统的建立

目的 建立一个在大鼠关节滑膜细胞表达人白细胞介素１０（ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １０ ，ｈ Ｉ Ｌ１０） 的重组逆转录病毒载体基因转移系统，为下一步的研究工作做准备。方法 构建表达人白细胞介素１０ 的逆转录病毒重组体ｐ Ｌ Ｘ（ｈ Ｉ Ｌ１０） Ｓ Ｎ，经 Ｐ Ａ３１７ 细胞包装， Ｇ４１８ 筛选， Ｎ Ｉ Ｈ３ Ｔ３ 细胞进行病毒滴度测定，选滴度最高的克隆（６ ×１０８ 集落形成单位／ Ｌ） 作为感染大鼠关节滑膜细胞的感染细胞；用重组逆转录病毒感染大鼠关节滑膜细胞，应用聚合酶链反应（ Ｐ Ｃ Ｒ） ，反转录聚合酶链反应（ Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ） 和 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 检测ｈ Ｉ Ｌ１０ 基因的整合和表达。结果 外源性ｈ Ｉ Ｌ１０ 基因已整合到靶细胞染色体 Ｄ Ｎ Ａ 并有效地表达。 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 检测显示ｈ Ｉ Ｌ１０ 基因在ｐ Ｌ Ｘ（ｈ Ｉ Ｌ１０） Ｓ Ｎ 转染大鼠关节滑膜细胞４８ 小时后开始表达，达７２０ ｎｇ·１０ － ６ｃｅｌｌｓ·２４ｈ － １ ，高峰在第３ 天，为１ ９８２ ｎｇ·１０ － ６ｃｅｌｌｓ·２４ｈ － １ 。第７ 、１４ 、２８天分别为１２ ７６１ 、１ ０５４ 、９４２ ｎｇ·１０ － ６ｃｅｌｌｓ·２４ｈ － １ 。结论 外源性ｈ Ｉ ?

人白细胞介素-10基因的克隆与逆转录病毒载体的构建

目的克隆、测序人白细胞介素(hIL)-10基因片段,构建逆转录病毒载体(MSCV- hIL-10)。方法采用刀豆蛋白A活化的人外周血单个核细胞培养提取总RNA,设计随机引物并逆转录反应合成hIL-10 cDNA第1链,并以hIL-10特异性引物行PCR扩增,获得hIL-10克隆基因片段,将hIL-10克隆基因片段,经双酶切后定向插入到逆转录病毒载体(MSCV)中,用脂质体法转染PT67包装细胞,以G418筛选阳性克隆。结果聚合酶链反应(PCR)扩增出534 bp特异性片段,测序结果表明同源性与GenBank报道完全一致,hIL-10基因片段插入MSCV载体中经转染包装后得到2×10~7 CFU／ml的分泌hIL-10的病毒悬液,hIL-10的分泌量为1220ng／10~6细胞·d^(-1)。结论成功克隆hIL-10开放阅读框架,成功构建MSCV-hIL-10重组质粒,获得高滴度的分泌hIL- 10的病毒悬液,hIL-10的表达可以应用于移植排斥的基因治疗。