细粒棘球蚴重组蛋白HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2诱导表达条件探索

目的探索细粒棘球蚴重组蛋白HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2的最佳诱导表达条件,并对其蛋白结构进行预测。方法构建p ET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2重组质粒,将其转化至Ecoli.BL21(DE3)细菌中,选择不同的时间段和温度,用不同浓度的IPTG进行诱导蛋白表达。将得到的菌液通过超声破碎,经离心后用SDS-PAGE分别分析上清和沉淀中重组蛋白HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2的表达情况。Western Blot鉴定重组蛋白表达。鉴定成功后进行大量诱导表达。采用生物信息学的方法,使用在线软件SWISS MODEL对HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白三维结构进行预测。结果HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2重组蛋白在28℃条件下,诱导4 h,IPTG的浓度为0.2 mmol/L时可溶性蛋白表达量达到最大。蛋白的相对分子量约为29 kD,结果与预期相符。其蛋白三维结构的预测与2×44.1.A结构的相似程度为78.13%。结论探索出HIS-4IgV-EgG1Y162-2重组蛋白最佳诱导表达条件,并成功预测出其蛋白的三维结构模型,为细粒棘球蚴重组疫苗的进一步研究创造条件。

pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)重组质粒的构建及表达产物的纯化与鉴定

目的 构建pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)原核表达质粒,诱导表达后纯化,获得重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4),并对其免疫学特性进行初步鉴定,对其空间结构进行预测。方法 利用DNA重组技术构建重组质粒pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4),将测序正确的质粒转化至E.coli BL21(DE)菌株中,分别采用不同浓度的IPTG在不同诱导时间及温度下诱导表达重组蛋白。取菌液超声破碎,SDS-PAGE分析上清及沉淀中蛋白的表达;通过镍柱亲和层析法纯化蛋白并进行Western blot鉴定。通过生物信息学技术,利用SOPMA、I-TASSER在线数据库预测重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)的空间结构。结果 成功构建pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)重组质粒,转化至E.coli BL21(DE)后诱导表达相对分子质量为53×10^(3)的重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)。SDS-PAGE分析CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)重组蛋白在IPTG浓度为0.7 mmol/L,37℃、4 h条件下上清中表达量较高。镍柱层析纯化用20 mmol/L咪唑浓度洗脱的蛋白浓度及纯度较高。Western blot检测重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)能被相应抗体识别,反应条带位于53×10^(3)处,与预期相符。生物信息学在线软件分析CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)中各蛋白均能正常折叠,未对优势表位产生影响。结论 利用原核表达成功获得CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)重组蛋白,并预测出该蛋白的三维结构模型,为细粒棘球蚴重组疫苗的研制提供了重要的实验依据。

细粒棘球蚴重组蛋白HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162的诱导表达及3D结构预测

目的探索重组蛋白HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162最佳的表达条件,大量诱导及鉴定蛋白质,并预测重组蛋白质的三维结构模型。方法将原核重组质粒pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162转化至E.coli.BL21(DE)菌株中,在不同条件下诱导重组蛋白进行表达,SDS-PAGE分析上清及沉淀中重组蛋白表达并用Western blot鉴定。I-TASSER在线预测重组蛋白HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162的三维结构。结果可溶性重组蛋白HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162在异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-Thiogalactoside,IPTG)(终浓度0.2 mmol/L),28℃4 h诱导条件下表达量较高;包涵体中的重组蛋白在IPTG(终浓度0.8 mmol/L),28℃2 h并37℃2 h诱导条件下表达量最高。Western blot鉴定该蛋白的相对分子量约为32×10^(3),与预期相符。利用I-TASSER在线预测重组蛋白质HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162的3D结构模型,结果显示相邻的蛋白CTLA-4IgV与蛋白EgG1Y162能抵抗空间位阻的影响进行正常折叠。结论探索出重组蛋白HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162的最佳诱导表达条件并对重组蛋白成功鉴定,根据预测的重组蛋白3D结构验证选用linker序列"GTDDDDKAMADIGSEF"能使其前后相邻的两个蛋白独立正常折叠,为进一步深入研究细粒棘球蚴重组疫苗创造了条件。

细粒棘球蚴EgG1Y162-2与CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白结构预测及表位分析比较

目的采用生物信息学的方法,应用相关软件对EgG1Y162-2和CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白的氨基酸序列进行分析,了解其理化性质及结构特点,预测并比较其抗原表位,为CTLA-4IgV-EgG1Y62-2蛋白作为包虫病表位疫苗的研究奠定基础。方法利用ProtParam在线软件分析EgG1Y162-2和CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白的理化性质;运用DNAstar中的protean软件与在线SOPMA软件预测EgG1Y162-2和CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白的二级结构;应用I-TASSER在线软件预测并比较EgG1Y162-2和CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白的三级结构,并使用BepiPred1.0,IEDB等软件对其T/B细胞抗原表位进行预测与分析。结果预测EgG1Y162-2蛋白由69个氨基酸组成,为稳定蛋白,具有亲水性。二级结构中的α螺旋、β-折叠、β-转角与无规则卷曲分别占7.69%、30.77%、15.38%和46.15%。预测的3条T细胞优势表位分别是1-18、21-43和47-62位氨基酸,2条B细胞优势抗原表位分别是9-28与57-69位氨基酸;CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白由208个氨基酸组成,稳定蛋白,具有亲水性。二级结构中的α螺旋、β-折叠、β-转角与无规则卷曲分别占13.46%、32.21%、7.69%和46.63%。预测的3条优势T细胞表位分别是143-154、165-177和183-199位氨基酸。2条B细胞优势抗原表位分别为151-167和197-205位氨基酸。结论EgG1Y162-2和CTLA-4IgVEgG1Y162-2蛋白均存在优势T抗原表位与B抗原表位,且T/B联合表位存在高度重合。说明CTLA-4IgV与EgG1Y162-2蛋白通过Linker序列连接后几乎未对EgG1Y162-2蛋白的优势表位产生影响。因此,将CTLA-4IgV基因与特异性抗原EgG1Y162-2基因进行融合表达可能会增强疫苗的免疫效果,这对囊型包虫病多价复合疫苗的研究具有重大意义。

基于接头序列“GSGGSG”的细粒棘球蚴病重组多表位疫苗EgG1Y162-2(4)的制备及鉴定

目的对细粒棘球蚴病重组多表位疫苗Eg G1Y162-2(4)进行原核表达并初步鉴定。方法利用免疫信息学方法对基于接头序列“GSGGSG”的细粒棘球蚴病重组多表位疫苗Eg G1Y162-2(4)进行三维结构建模,分析其结构变化并评估该疫苗抗原性。通过Eco R I和SalⅠ双酶切构建p ET30a-EgG1Y162-2(4)重组质粒,将重组质粒转化入感受态细胞,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导蛋白表达,Western blotting鉴定原核表达蛋白产物,并应用细粒棘球蚴病患者及健康人血清分析重组蛋白抗原性。结果构建的重组疫苗EgG1Y162-2(4)三维结构串联的4个Eg G1Y162-2蛋白均能独立、有效表达且具有良好抗原性。重组质粒pET30a-EgG1Y162-2(4)在0.2 mmol/L IPTG37℃诱导4 h条件下,上清中目的蛋白表达量最高,使用60 mmol/L咪唑洗脱的蛋白成分较纯。Western blotting分析发现,重组多表位蛋白HIS-EgG1Y162-2(4)在约39 k Da位置处出现条带,且该蛋白可被细粒棘球蚴病患者血清识别。结论成功构建了细粒棘球蚴重组疫苗EgG1Y162-2(4),为研究细粒棘球蚴病重组多表位疫苗奠定了基础。