二甲双胍对慢性暴露于高糖及高游离脂肪酸的HIT-T15细胞胰岛素受体酪氨酸蛋白激酶活性的影响

目的观察二甲双胍(MF)对慢性高糖和高脂处理后的HIT-T15细胞(β细胞系)胰岛素受体(IRc)酪氨酸蛋白激酶(TPK)活性的影响,探讨MF对β细胞糖脂毒性,即β细胞胰岛素抵抗的改善作用机制。方法实验分为对照组、对照+MF组、高糖组、高糖+MF组、高脂组、高脂+MF组。将HIT-T15细胞分别接种于含有5.5mmol/L、16.7 mmol/L葡萄糖(G)及0.5 mmol/L软脂酸的培养液中,培养48 h后,加入2.5μg/mL MF干预24h。用放射性酶分析法测定β细胞IRc TPK活性。结果高糖〔(52.5±18.6)pmol/(min.μg)〕和高脂组〔(54.6±14.0)pmol/(min.μg)〕HIT-T15细胞IRc TPK活性分别较对照组〔(119.4±29.1)pmol/(min.μg)〕降低(P<0.01);予2.5μg/mL MF干预24 h后,高糖和高脂组IRc TPK活性较干预前增高〔(113.0±29.8)vs(52.5±18.6)pmol/(min.μg),P<0.01;(98.6±26.1)vs(54.6±14.0)pmol/(min.μg),P<0.01〕,且与对照组相比差异无统计学意义。MF对对照组HIT-T15细胞IRc TPK活性无明显影响。结论高糖和高脂可抑制β细胞IRcTPK活性。MF能明显改善受高糖及高脂所抑制的HIT-T15细胞IRc TPK活性,且恢复到接近正常水平。提示MF对糖脂毒性所致β细胞胰岛素抵抗的改善作用可能与增加IRc TPK活性有关。

短期胰岛素刺激对HIT-T15细胞胰岛素原基因表达的影响

目的探讨短期外源性胰岛素刺激对HIT-T15胰岛β细胞胰岛素原(PI)基因表达的影响及机制。方法HIT-T15仓鼠胰岛瘤细胞随机分为4组:含1.4 mmol/L葡萄糖完全培养基组作为空白对照(LG组),为抑制内源性胰岛素释放干扰以低糖联合硝苯地平作为条件对照(LGC组),在LGC基础上分别加0.5 U/L或5 U/L的外源性胰岛素作为实验组(分别为LINS组和HINS组),分别在刺激后0、30、60、90、120 min以荧光定量PCR检测各组PI mRNA,免疫组化检测各组细胞胰岛素受体底物1(IRS1)酪氨酸磷酸化水平。结果 (1)LINS组、HINS组细胞PI mRNA表达均上调,在刺激后60 min PI mRNA表达量达高峰。(2)实验组在刺激后30 min IRS1酪氨酸磷酸化水平较对照组明显增高,高、低浓度胰岛素组细胞酪氨酸磷酸化达高峰时间不同。(3)LG组和LGC组间PI mRNA表达及IRS1酪氨酸磷酸化水平无明显差异。结论短期外源性胰岛素能上调胰岛β细胞PI基因的表达,且高浓度的胰岛素较低浓度胰岛素作用强。PI表达调控与IRS1信号传导有关。

番石榴叶总黄酮对胰岛β细胞胰岛素抵抗影响的实验研究

目的:观察番石榴叶总黄酮对HIT-T15胰岛β细胞胰岛素抵抗影响。方法:制备番石榴叶总黄酮(FSL)有效部位,通过HIT-T15胰岛β细胞生长曲线以及不同浓度葡萄糖(GLU)、FSL对HIT-T15胰岛β细胞增殖的影响确定FSL的加药时间、浓度和高糖浓度。然后测定在高糖环境下,FSL对HIT-T15胰岛β细胞胰岛素分泌、胰岛素受体m RNA和胰岛素受体底物1蛋白表达的影响。结果:50 mmol·L-1葡萄糖能够显著抑制HIT-T15胰岛β细胞增殖(P<0.01),50μg·m L-1 FSL能够促进高糖环境下HIT-T15胰岛β细增殖(P<0.01)、促进胰岛素分泌(P<0.05)、胰岛素受体m RNA表达(P<0.05)和胰岛素受体底物1蛋白表达(P<0.01)。结论:番石榴叶总黄酮能够促进高糖环境下HIT-T15胰岛β细胞胰岛素分泌,可能与其增加胰岛素受体m RNA的表达、胰岛素受体底物(IRS-1)蛋白表达有关。

FGF-21与罗格列酮钠对棕榈酸诱导的胰岛细胞株凋亡的保护作用及机制研究

目的探讨成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)和罗格列酮钠(RO)对棕榈酸(PA)诱导的HIT-T15胰岛细胞凋亡的保护作用和机制。方法①0.25、0.50和1.00 mmol/L的PA干预HIT-T15细胞24 h,流式细胞仪检测细胞凋亡。②在0.50 mmol/L的PA中分别加入FGF-21〔12.50 nmol/L(A)、25.00 nmol/L(B)、50.00 nmol/L(C)〕、1μmol/L RO及3个不同浓度的FGF-21与RO联合,检测细胞凋亡,免疫细胞化学法、Western blot检测各组细胞磷酸化c-jun氨基末端激酶(p-JNK)的表达。结果①PA组细胞凋亡高于对照组(P<0.05)。②FGF-21 A、B、C组能明显降低0.50 mmol/L PA诱导的凋亡(P<0.05),但凋亡率高于对照组(P<0.05)。FGF-21与RO联合干预组的细胞凋亡低于PA组(P<0.05)。联合干预组的细胞凋亡低于单用FGF-21组(P<0.05)。③0.50 mmol/L PA组的p-JNK蛋白表达高于对照组(P<0.05)。不同浓度FGF-21组的p-JNK的表达均低于PA组(P<0.05)。FGF-21与RO联合干预组的p-JNK均低于PA组(P<0.05)。联合干预组p-JNK的表达低于单用FGF-21组(P<0.05)。结论①PA可剂量依赖性的诱导HIT-T15胰岛细胞的凋亡。②FGF-21能抑制PA诱导的HIT-T15胰岛细胞株的凋亡,此机制可能是抑制了p-JNK的表达,并且与RO有协同作用。

多巴胺受体在胰岛β细胞系和原位组织中的差异性表达

目的通过研究大鼠胰腺组织和胰岛β细胞系INS-1(大鼠源)和HIT-T15(仓鼠源)细胞中多巴胺(dopamine,DA)受体的分布以及INS-1细胞系的内分泌功能,为DA调节胰岛β细胞功能研究结果不一致的可能原因提供一定的实验依据。方法应用双标记免疫荧光染色方法观察在大鼠胰腺组织和胰岛β细胞系中DA受体分布的异同,以及胰岛素和胰高血糖素免疫荧光双标记结果的差异。应用放射免疫法检测INS-1细胞孵育液中胰岛素及胰高血糖素的浓度,观察细胞系的内分泌功能的改变。结果在大鼠胰腺组织中,DA受体D1、D2和D5分别表达在β细胞、δ细胞、α细胞和PP细胞上,β细胞只表达D1受体。然而在两种胰岛β细胞系INS-1和HIT-T15细胞上不仅有D1受体,还有D2和D5受体的分布。两种胰岛β细胞系均同时表现胰岛素和胰高血糖素免疫阳性,而在原位胰岛中分布于不同的细胞,进一步检测显示INS-1细胞系的孵育液中不仅含有胰岛素,也含有胰高血糖素。结论胰岛β细胞系DA受体分布及内分泌功能不同于原位β细胞。

卵母细胞成熟相关激素和生长因子受体在马扩展型和紧凑型卵丘-卵母细胞复合体表达的研究

旨在比较一些与卵细胞成熟相关的激素和生长因子受体在两种卵丘-卵母细胞复合体(Ex-COC和Cp-COC)中的表达以探究两种类型的马卵母细胞成熟和发育能力差异的原因。本研究在屠宰场采集蒙古马离体卵巢带回实验室回收COCs,并根据卵丘细胞形态区分Ex-和Cp-COCs;通过qPCR和免疫荧光检测FSHR、LHR、IGF1R、IGF2R、ESR1、ESR2,BMP15和GDF9受体BMPR1B、BMPR2和ALK5在两种COCs中的表达模式;将雌二醇、IGF2、GDF9和BMP15分别添加进马IVM培养体系中检测其对马卵母细胞体外成熟率的影响。结果显示,这些受体基因的表达量在Ex-和Cp-COCs的卵丘细胞和卵母细胞中均有差异,在Cp-COCs中,卵丘细胞的大部分受体基因表达量高于卵母细胞;而在Ex-COCs中,卵母细胞与卵丘细胞的基因表达水平相似或高于卵丘细胞。相较于Cp-COCs的卵母细胞,大部分的受体基因在Ex-COCs的卵母细胞中表现出更高表达水平。体外成熟培养试验表明雌二醇和IGF2的添加可能有利于提高马的卵母细胞体外成熟率。马扩展型和紧凑型COCs中FSH、LH、IGF1、IGF2、雌激素、BMP15和GDF9等重要激素或生长因子受体表达水平的差异可以解释其体外成熟和发育能力的差异,在成熟培养体系中添加IGF2和E2可能会提高马两种类型卵母细胞体外成熟率。

格列喹酮对胰岛β细胞株HIT-T15细胞的促胰岛素分泌作用

目的通过观察不同葡萄糖浓度下格列喹酮(Glq)刺激HIT-T15细胞分泌胰岛素的作用,了解Glq对β细胞的刺激模式。方法 HIT-T15细胞孵育于5、10、15mmol/L葡萄糖浓度的培养基中,8小时后加入Glq、格列本脲(Glb)、格列齐特(Glc),分别在不同时间点收集培养液,测定药物刺激前后的胰岛素分泌水平。结果在三种糖浓度下,Glq刺激的胰岛素分泌高峰均在加药后10分钟,在30分钟时又有一稍低的第二峰,随后逐渐下降,至180分钟后分泌速率为基础值的1.1～1.2倍;Glb呈单相分泌峰,峰值出现在45分钟,随后分泌速率逐渐下降,至180分钟后仍有基础值的1.5倍;在10 mmol/L糖浓度组,Glq刺激的胰岛素浓度时间曲线下面积(AUC)更小。Glc的分泌曲线类似Glq。结论 Glq与Glb对β细胞的刺激作用模式不同,前者较后者胰岛素分泌达峰时间更快、作用时间更短,AUC更小。

苦瓜中具有保护和修复四氧嘧啶损伤HIT-T15细胞功能的有效成分的分离与表征

为探讨苦瓜降糖有效成分的分离纯化,观察其在体外对四氧嘧啶破坏的胰腺β细胞(HIT-T15细胞)的保护修复作用,用SP阳离子交换色谱法对苦瓜抽提液(Momordicacharantiaextract,MCE)的活性组分进行了分离纯化,并用MTT法对经四氧嘧啶破坏前后的胰腺β细胞存活率进行检测,从而考察了MCE的各组分对胰岛β细胞的保护和修复功能,此外还测定了各组分的抗氧活性。结果表明:SP阳离子交换树脂的分离各组分对胰腺β细胞的存活都有促进作用,其中P1、P3、P6组分的效果显著,又以P6组分的效果最佳。相对正常对照组,经P1、P3和P6组分保护并修复的细胞残存率分别为78.64%、89.20%和94.22%;经P1、P3和P6组分保护的细胞残存率分别达59.03%、61.07%和66.16%;经P1、P3和P6组分修复的细胞残存率分别达69.52%、76.32%和77.19%。P1、P3和P6组分的SOD活性分别为22.85、29.98和27.53u/mL。结论:苦瓜抽提液中的3个组分具有一定的SOD活性,在适当的浓度范围内,均具有明显减弱四氧嘧啶对胰腺β细胞的损伤和改善受损的胰腺β细胞的功能。

过表达胰岛素增强子结合蛋白1对HIT—T15细胞增殖的影响

建立稳定表达pcDNA3．1-ISLl（胰岛素增强子结合蛋白1）质粒的HIT—T15细胞系并探讨对其增殖的影响。MTT及平板克隆实验检测结果表明转染pcDNA3．1-ISLl的细胞增殖明显加快，细胞数明显增多；流式细胞仪检测结果表明，转染pcDNA3．1-ISLl的细胞，在细胞周期中G0／G1期细胞明显减少，S、G2／M期细胞明显增多。ISLl能明显促进HIT—T15细胞增殖，其机制可能与参与调控细胞周期各期DNA复制、转录有关。

百合多糖降糖作用机理的体外研究

目的通过研究百合多糖(LP-1,LP-2)对α-葡萄糖苷酶的抑制活性和胰岛β细胞(HIT-T15 cell)的影响,初步探讨百合多糖的降血糖机理。方法用pNPG作为底物,以阿卡波糖为参照,用比色法测定LP-1和LP-2对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用;用MTT法检测不同浓度的LP-1(0.1,1.0,10.0 mg/ml)和LP-2(0.1,1.0,10.0 mg/ml)对HIT-T15增殖的影响,用放免法检测不同浓度LP-1和LP-2对HIT-T15细胞葡萄糖刺激性的胰岛素分泌量的变化。结果百合多糖可促进HIT-T15细胞增殖,在5.6 mmol/L或16.7 mmol/L葡萄糖刺激下,LP-l和LP-2可剂量依存性地促进HIT-T15细胞葡萄糖刺激性胰岛素分泌。但对-葡萄糖苷酶活性没有明显的抑制作用。结论百合多糖降糖机理与促进胰岛β-细胞的增殖和分泌功能有关。

桑根活性成分反式二苯乙烯抗糖尿病作用研究

为探讨桑根中提取分离的2,5′-羟基反式二苯乙烯-4,3′-二-β-D-吡喃葡萄糖苷(DGTS)的抗糖尿病作用,测定DGTS对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性,观察DGTS对HIT-T15细胞的影响。结果表明:DGTS显示很强的α-葡萄糖苷酶的抑制作用,当DGTS浓度为250μg·mL^(-1)时,α-葡萄糖苷酶抑制率为60%;DGTS对α-淀粉酶也显示很强的抑制作用,当DGTS浓度为5μg·mL^(-1)时,α-淀粉酶抑制率为39%,高于50μg·mL^(-1)的阿卡波糖。DGTS对链脲佐菌素引起HIT-T15细胞的损伤具有保护作用。证明DGTS具有抗糖尿病作用。

CDC对胰岛β细胞中COX-2表达及PGE2生成的影响

目的观察12/15脂氧合酶抑制剂CDC对大鼠胰岛β细胞中环加氧酶2(COX-2)的表达及前列腺素E2(PGE2)生成的影响,并初步探讨其机制。方法体外培养大鼠胰岛β细胞系INS-1细胞,加入细胞因子IL-1β诱导COX-2蛋白的表达,然后采用Western印迹的方法观察12/15脂氧合酶抑制剂cin-naminyl-3,4-dihydroxy-α-cyanocinnamate(CDC)对COX-2蛋白表达的影响;借助萤光素酶报告基因技术检测CDC对COX-2启动子转录活性的影响,最后用放射免疫法了解CDC对胰岛β细胞中PGE2生成的抑制作用。结果细胞因子IL-1β能够在大鼠胰岛β细胞系INS-1中诱导COX-2基因的表达,而12/15脂氧合酶抑制剂CDC能够呈剂量依赖抑制IL-1β所诱导的COX-2蛋白的表达。结论12/15脂氧合酶抑制剂能够明显抑制炎性因子IL-1β所诱导的胰岛β细胞中COX-2的表达和炎性介质PGE2的生成。

2型糖尿病肾病患者血清GDF-15、sVCAM-1、YKL-40、α-klotho蛋白水平与糖脂代谢、胰岛素抵抗及肾功能的相关性分析

目的:探讨2型糖尿病(T2DM)肾病患者血清可溶性血管细胞黏附分子-1(s VCAM-1)、生长分化因子-15(GDF-15)、α-klotho蛋白、几丁质酶3样蛋白1(YKL-40)水平与糖脂代谢、胰岛素抵抗及肾功能的关系。方法:选取2017年2月2020年5月期间我院收治的T2DM患者80例,将T2DM患者根据有无糖尿病肾病分为T2DM无肾病组(n=43)、T2DM肾病组(n=37)。并选取同期于我院体检的健康志愿者50例作为对照组。检测所有受试者的血脂指标:总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL),肾功能指标:尿素氮(BUN)、肌酐(Scr),血糖指标:糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹血糖(FPG),胰岛素抵抗指标:稳态模型-胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),GDF-15、s VCAM-1、α-klotho蛋白、YKL-40水平。分析血清GDF-15、s VCAM-1、YKL-40、α-klotho蛋白水平与血糖指标、血脂指标、胰岛素抵抗指标、肾功能指标的相关性。结果:T2DM肾病组GDF-15、s VCAM-1、YKL-40较对照组、T2DM无肾病组高(P<0.05),T2DM肾病组α-klotho蛋白低于T2DM无肾病组、对照组(P<0.05)。T2DM肾病组、T2DM无肾病组TC、TG、LDL、BUN、HOMA-IR、Scr、FPG、HbA1c水平较对照组高,且T2DM肾病组高于T2DM无肾病组(P<0.05),T2DM肾病组、T2DM无肾病组HDL水平低于对照组,且T2DM肾病组低于T2DM无肾病组(P<0.05)。Pearson相关性分析结果显示,GDF-15、sVCAM-1、YKL-40与TC、TG、LDL、BUN、Scr、FPG、HbA1c、HOMA-IR均呈正相关,而与HDL呈负相关(P<0.05),α-klotho蛋白与TC、TG、LDL、BUN、Scr、FPG、HbA1c、HOMA-IR均呈负相关,而与HDL呈正相关(P<0.05)。结论:GDF-15、sVCAM-1、YKL-40、α-klotho蛋白在T2DM肾病患者血清中异常表达,可能参与该疾病的发生、发展。