Myod1通过调节lncRNA SNHG15和miR-24-3p对氧糖剥夺SH-SY5Y细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨肌源性分化蛋白1(Myod1)对氧糖剥夺(OGD)诱导的SH-SY5Y细胞增殖抑制和凋亡的影响,并阐明其作用机制。方法:采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测正常对照组研究对象和缺血性脑梗死组患者外周血及正常培养的SH-SY5Y细胞(对照组)和OGD细胞模型(OGD组)细胞中Myod1和长链非编码RNA(lncRNA)小核仁RNA宿主基因15(SNHG15)mRNA表达水平。分别采用si-Myod1、pcDNA3.0-Myod1、si-SNHG15、pcDNA3.0-SNHG15、si-NC、空载质粒(Vector)、miR-NC和miR-24-3p模拟物(miR-mimics)质粒转染SH-SY5Y细胞后,进行OGD处理,将SH-SY5Y细胞分为对照组、OGD组、OGD+Vector组、OGD+Myod1组、OGD+si-NC组、OGD+si-Myod1组、OGD+si-SNHG15组、OGD+si-SNHG15+Vector组、OGD+si-SNHG15+Myod1组、OGD+miR-NC组、OGD+miR-mimics组、OGD+miR-mimics+Vector组和OGD+miR-mimics+SNHG15组。采用CCK-8法检测各组细胞活性,采用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)染色法检测各组EdU阳性细胞率,采用原位末端转移酶标记(TUNEL)法检测各组TUNEL阳性细胞率,采用Western blotting法检测各组细胞中裂解的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase-3)、裂解的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(cleaved caspase-9)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达水平。染色质免疫共沉淀(CHIP)法评估Myod1和SNHG15之间的关联。双荧光素酶报告基因实验评估Myod1与SNHG15及SNHG15与miR-24-3p的靶向关系。结果:与正常对照组比较,缺血性脑梗死组患者外周血中Myod1和SNHG15 mRNA表达水平均升高(P<0.05)。与对照组比较,OGD组细胞中Myod1和SNHG15 mRNA表达水平均明显升高(P<0.05)。与OGD组比较,48和72 h时OGD+Myod1组细胞活性和EdU阳性细胞率均降低(P<0.01),TUNEL阳性细胞率升高(P<0.01);OGD+si-Myod1组细胞活性和EdU阳性细胞率均升高(P<0.01),TUNEL阳性细胞率降低(P<0.01)。Myod1可与SNHG15的启动子序列结合。SNHG15可吸附miR-24-3p,Myod1与SNHG15及SNHG15与miR-24-3p存在靶关系。敲低SNHG15后,与OGD组比较,48和72 h时OGD+si-SNHG15组细胞活性和EdU阳性细胞率均升高(P<0.01),TUNEL阳性细胞率降低(P<0.01),细胞中Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表达水平降低(P<0.01),Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.01);与OGD+si-SNHG15组比较,48和72 h时OGD+si-SNHG15+Myod1组细胞活性和EdU阳性细胞率降低(P<0.05),TUNEL阳性细胞率升高(P<0.05),细胞中Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表达水平升高(P<0.05),Bcl-2的蛋白表达水平降低(P<0.05)。过表达miR-24-3p和SNHG15后,与OGD组比较,48和72 h时OGD+miR-mimics组细胞活性和EdU阳性细胞率升高(P<0.01),TUNEL阳性细胞率降低(P<0.01),细胞中Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表达水平降低(P<0.01),Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.01);与OGD+miR-mimics组比较,48和72 h时OGD+miR-mimics+SNHG15组细胞活性和EdU阳性细胞率降低(P<0.05),TUNEL阳性细胞率升高(P<0.05),细胞中Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表达水平升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论:Myod1可通过与SNHG15启动子区结合进而吸附miRNA-24,促进OGD诱导的SH-SY5Y细胞的增殖抑制和细胞凋亡。

血清LncRNA-ZFAS1、miR-15a-5p相对表达量对癫痫持续状态患者预后不良的预测效能

目的观察癫痫持续状态(SE)患者血清LncRNA-ZFAS1、miR-15a-5p表达变化,分析血清LncRNA-ZFAS1、miR-15a-5p相对表达量对SE患者预后不良的预测效能。方法SE患者100例(SE组)、同期体检健康者68例(对照组),采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测受检者血清LncRNA-ZFAS1、miR-15a-5p,通过starBase数据库预测LncRNA-ZFAS1与miR-15a-5p的结合位点。收集SE患者性别、年龄、病程、发作类型、基础疾病、院内并发症、脑组织异常、脑脊液异常、脑电图异常、伴发热、既往癫痫发作史≥2次、癫痫持续时间、机械通气、癫痫持续状态严重程度评分(STESS)、重症监护室时间、住院时间和治疗药物种类等一般资料,并根据格拉斯哥预后量表将SE患者分为不良预后组31例和良好预后组69例,比较不良预后组、良好预后组患者的一般资料及血清LncRNA-ZFAS1、miR-15a-5p相对表达量。以SE患者预后不良为因变量,以单因素分析中有统计学差异的变量为自变量,采用多因素Logistic回归分析法分析SE患者预后不良的危险因素。采用受试者工作特征曲线(ROC)分析血清LncRNA-ZFAS1、miR-15a-5p相对表达量及二者联合对SE患者预后不良的预测效能。结果SE组受检者血清LncRNA-ZFAS1相对表达量高于对照组,miR-15a-5p相对表达量低于对照组(P均<0.05)。SE患者血清LncRNA-ZFAS1、miR-15a-5p相对表达量呈负相关关系(r=-0.742,P<0.001)。LncRNA-ZFAS1与miR-15a-5p的3'非翻译端存在互补序列。不良预后组惊厥性、癫痫持续时间≥1 h、机械通气比例、STESS评分、血清LncRNA-ZFAS1相对表达量高于良好预后组,血清miR-15a-5p相对表达量低于良好预后组(P均<0.05)。惊厥性SE、癫痫持续时间≥1 h、机械通气、STESS评分增加和血清LncRNA-ZFAS1相对表达量升高为SE患者不良预后的独立危险因素,血清miR-15a-5p相对表达量升高为独立保护因素(P均<0.05)。血清LncRNA-ZFAS1预测SE患者不良预后的AUC为0.786,敏感度为67.74%、特异度为75.36%;血清miR-15a-5p预测SE患者不良预后的AUC为0.781,敏感度为90.32%、特异度为53.62%;血清LncRNA-ZFAS1联合miR-15a-5p预测SE患者不良预后的AUC为0.879,敏感度为87.10%、特异度为73.91%。结论SE患者血清LncRNA-ZFAS1高表达、miR-15a-5p低表达,呈负相关关系。血清LncRNA-ZFAS1相对表达量升高为SE患者不良预后的独立危险因素,血清miR-15a-5p相对表达量升高为独立保护因素。检测血清LncRNA-ZFAS1、miR-15a-5p可用于SE患者预后不良的预测,且二者联合预测效能更高。

HIV-1 p15(Gag)基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

目的为了研究HIV-1p15(Gag)的生物学活性,制备HIV-1p15(Gag)蛋白及其特异性抗体。方法用PCR的方法扩增编码p15(Gag)基因序列,将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中表达HIV-1p15蛋白,分别用His抗体和HIV阳性血清做western blot鉴定目的蛋白。以纯化目的蛋白为抗原免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA),免疫细胞化学法检测抗体滴度及其特异性。结果原核表达载体pET28a(+)-p15(Gag)成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,得到相对分子质量约20000的p15(Gag)蛋白经western blot鉴定正确。纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性。结论得到纯化的HIV-1p15蛋白,制备的多克隆抗体能够检测自然状态下病毒蛋白p15(Gag),为进一步研究HIV-1奠定了实验基础。

HIV-1gag基因p24编码区的变异性分析

目的 了解我国HIV感染者p2 4蛋白编码区的基因变异情况。 方法 收集我国河南及上海地区 2 8份已经证实的HIV - 1感染患者的血浆标本并抽提出RNA ;采用逆转录和Nested PCR的方法扩增所需的目的基因 ,使用DNA测序仪直接测序 ;应用CLUSTALW、PHYLIP等软件包对序列进行比对及进化树分析。结果 2 8份gag样本中 2 5份为B亚型 ,3份为A亚型。与共享序列相比 ,2 5例B亚型的 p2 4编码区中发生核苷酸改变的位点比例为 0 .4 %～ 4 .8% ,平均为 1.4 % ,其中A→G占 2 0 .5 % ,G→A占 17.3% ;3例A亚型发生核苷酸改变的位点比例平均为 0 .2 4 %。在所有变异位点中均未发现G→A的高度突变。B亚型和A亚型内的基因离散率平均为 2 .9%和 0 .5 8% ,A亚型与B亚型之间的基因离散率平均为 11.1%。 2 5例B亚型根据基因序列所推测的p2 4蛋白发生氨基酸改变的比例为 0 .4 %～ 5 .2 % ,平均为 2 .2 %。进化树分析表明在我国河南地区HIV感染B亚型多为与泰国株相近的B’亚型。结论 HIV 1p2 4编码区仍相对保守 。

CCND1基因3'-UTR区miR-15a-5p和miR-16-5p结合位点的荧光素酶报告载体构建及分析

目的:构建miR-15a-5p和miR-16-5p的荧光素酶报告载体,利用此载体分析并验证miR-15a-5p和miR-16-5p与CCND1基因3'-UTR区域的确切结合位点,探讨miR-15a-5p和miR-16-5p与CCND1基因的相互作用关系。方法:通过Pubmed和miRBase数据库分别寻找到CCND1基因3'-UTR区域碱基序列和miR-15a-5p、miR-16-5p的碱基序列。找出理论结合位点后,构建荧光素酶报告载体,并用荧光素酶报告基因方法验证miR-15a-5p和miR-16-5p与CCND1基因之间的作用关系。结果:通过基因测序表明,本实验成功构建了CCND1a/Ma和CCND1b/Mb荧光素酶报告基因表达载体。将上述载体应用于荧光素酶报告基因实验,结果发现CCND1 b组的荧光素酶表达强度显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:miR-15a-5p和miR-16-5p与CCND1基因的3'-UTR区域存在结合位点,其具体结合位置在CCND1b区。这在理论上意味着miR-15a-5p和miR-16-5p可以抑制CCND1基因的表达。

艾滋病病毒(HIV)-1、p24抗原和抗体联合检测的临床价值分析

目的分析联合检测艾滋病病毒(HIV)-1、p24抗原与抗体的临床价值。方法纳入本院2018年1月至2018年12月接收进行(HIV)-1、p24抗原与抗体检测患者1 000例血液样本,分别进行(HIV)-1、p24抗原与抗体检测,针对(HIV)-1、p24抗原检测阳性样本检测CD4+T淋巴细胞与RNA,对比分析检测结果。结果 1 000份检测样本中,HIV抗体检测阳性80例、(HIV)-1、p24抗原检测阳性11例,(HIV)-1、p24抗原与抗体联合检测阳性6例。11例(HIV)-1、p24抗原检测阳性样本中,四代酶联试剂检测显示9例HIV抗原、抗体检测阳性,2例检测阴性,进行病毒载量检测均≥20 000拷贝/ml,检测CD4细胞显示<500个/μl样本4例。结论临床应用可区分(HIV)-1、p24抗原与抗体的四代试剂进行检测可提高对HIV感染患者的检出率并缩短检测窗口期,在检测过程中结合应用病毒载量与CD4细胞水平计数检测对于促进检验准确性的提高也具有积极意义。

长链非编码RNA CASC15对肝细胞癌增殖、侵袭和迁移的影响及作用机制

目的探究长链非编码RNA(lncRNA)癌症易感性基因15(Cancer susceptibility candidate 15,CASC15)在肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)中的分子调控机制。方法通过生物信息学方法预测目的基因表达,并分析目的基因表达与患者生存时间的关系;收集临床HCC患者肝癌组织和癌旁组织;CCK-8、Transwell和流式细胞术实验检测HCC细胞SMMC7721和Huh-7的增殖、侵袭、迁移以及凋亡;双荧光素酶实验检测miR-144-3p与CASC15和富含亮氨酸的重复序列蛋白1(Leucine rich repeat containing protein 1,LRRC1)的靶向关系;qRT-PCR和Western blot检测mRNA和蛋白表达情况;免疫荧光实验用于蛋白定位研究;回复实验验证CASC15/miR-144-3p/LRRC1对HCC进展的影响。体内实验验证CASC15对HCC进展的影响。结果TCGA数据库与qRT-PCR检测显示HCC组织和细胞中CASC15高表达、miR-144-3p低表达、LRRC1高表达(P<0.05)。增殖、侵袭、迁移的细胞功能实验结果表明在肿瘤发展中CASC15和LRRC1起到促进作用,miR-144-3p则是抑制作用,与凋亡实验结果一致(P<0.05)。细胞功能实验表明CASC15抑制miR-144-3p功能,miR-144-3p抑制LRRC1,CASC15与miR-144-3p结合,并导致LRRC1上调。回复实验结果表明CASC15通过抑制miR-144-3p促进LRRC1的表达从而促进HCC细胞增殖、侵袭和迁移并抑制细胞凋亡。结论CASC15可能通过调节miR-144-3p/LRRC1轴,从而促进HCC进展。

藏红花素调控lncRNA TTTY15/let-7c-5p通路保护帕金森病细胞损伤模型机制研究

目的:探讨藏红花素对帕金森病细胞损伤模型的影响和可能机制。方法:不同浓度(10、50、100μmol/L)的藏红花素作用于1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP+)诱导SK-N-SH细胞,试剂盒检测细胞中丙二醛(MDA)和还原性谷胱甘肽(GSH)的含量,流式细胞术检测细胞凋亡,实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测长链非编码RNA (lncRNA)睾丸特异性转录Y-连锁15 (TTTY15)和微小RNA (miRNA) let-7c-5p的表达水平。双荧光素酶报告实验和RT-qPCR确定TTTY15和let-7c-5p之间的靶向关系。分别转染TTTY15小干扰RNA (si-TTTY15)、let-7c-5p模拟物至人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH),采用上述方法检测敲低TTTY15或过表达let-7c-5p对MPP+诱导的SK-N-SH细胞损伤的影响。结果:与Con组比较,MPP+组SK-N-SH细胞MDA含量升高,GSH含量显著降低(P<0.05);与MPP+组比较,MPP++crocin-L组、MPP++crocin-M组、MPP++crocin-H组SK-N-SH细胞MDA含量降低,GSH含量升高(P<0.05)。MPP++crocin-L组、MPP++crocin-M组、MPP++crocin-H组3组MDA、GSH变化与藏红花素剂量相关,MDA随剂量增加而降低,GSH随剂量增加而升高(P<0.05)。与Con组比较,MPP+组SK-N-SH细胞凋亡率、Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05);与MPP+组比较,MPP++crocin-L组、MPP++crocin-M组、MPP++crocin-H组SK-N-SH细胞凋亡率、Bax蛋白表达降低,Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05)。MPP++crocin-L组、MPP++crocin-M组、MPP++crocin-H组之间各检测指标比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与Con组比较,MPP+组SK-N-SH细胞TTTY15表达升高,let-7c-5p表达降低(P<0.05);与MPP+组比较,MPP++crocin-L组、MPP++crocin-M组、MPP++crocin-H组SK-N-SH细胞TTTY15表达降低,let-7c-5p表达升高(P<0.05)。MPP++crocin-L组、MPP++crocin-M组、MPP++crocin-H组各指标组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与miR-NC组比较,let-7c-5p组WT-TTTY15的SK-N-SH细胞荧光素酶活性降低(P<0.05);miR-NC组与let-7c-5p组MUT-TTTY15的SK-N-SH细胞荧光素酶活性比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与pcDNA组比较,pcDNA-TTTY15组SK-N-SH细胞let-7c-5p表达降低(P<0.05);与si-NC组比较,si-TTTY15组SK-N-SH细胞let-7c-5p表达升高(P<0.05)。与MPP++si-NC组比较,MPP++si-TTTY15组SK-N-SH细胞TTTY15的表达水平降低,凋亡率、Bax蛋白表达、MDA含量降低,Bcl-2蛋白表达、GSH含量升高(P<0.05)。与MPP++NC组比较,MPP++let-7c-5p组SK-N-SH细胞let-7c-5p的表达水平升高,凋亡率、Bax蛋白表达、MDA含量降低,Bcl-2蛋白表达、GSH含量升高(P<0.05)。结论:藏红花素对帕金森病细胞损伤模型具有保护作用,其机制可能与下调lncRNA TTTY15/let-7c-5p通路有关。

ZG15Cr1Mo1V与P91管-管对接的焊接工艺

分析了P91和ZG1 5Cr1Mo1V的材料特点及焊接性能 ,介绍了 2种材料的对接焊试验方法 。

P物质、神经激肽-1受体对人类免疫缺陷病毒的调节作用

生活紧张状态和抑郁是HIV感染各阶段直至发展为AIDS的重要辅助因素。Kopnisky等报道心理改变在HIV-1疾病进程中所起的作用．发现在免疫一神经传导中脑部趋化因子特别是SP的重要性。抑郁、焦虑和紧张状态与HIV发展相关，行为状态和脑力活动的改变所引起的免疫应答间接或至少有一部分是通过神经内分泌-免疫途径介导的。紧张状态反应导致神经肽的释放改变．

15-脂氧合酶-1对胃癌细胞周期的影响及其机制研究

目的研究15-脂氧合酶-1(15-LOX-1)对胃癌细胞AGS细胞周期的影响,并探讨其作用机制。方法实验分为15-LOX-1重组质粒转染组、空载体组和AGS组,转染胃癌细胞AGS,用RT-PCR和Western blot检测15-LOX-1 mRNA和蛋白的表达,流式细胞术检测AGS细胞周期的分布,Western blot检测S相激酶相关蛋白2(S-phase Kinase associated protein 2,Skp2)和细胞周期抑制因子P27的表达。结果重组质粒转染组AGS胃癌细胞分别从mRNA和蛋白水平检测到15-LOX-1的表达,流式细胞仪结果显示15-LOX-1可使肿瘤细胞大部分滞留于G0/G1期,进入S期的细胞减少,S期比例下降,并且转染15-LOX-1后P27表达上调,而Skp2表达下降(P<0.05)。结论 15-LOX-1可能通过调节细胞周期蛋白Skp2和P27的表达,使细胞周期阻滞于G0/G1期,抑制肿瘤细胞增殖。

长链非编码RNAKCNK15-AS1靶向微RNA-140-5p对骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡及炎症因子表达的影响

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)KCNK15-AS1是否通过靶向微RNA-140-5p(miR-140-5p)影响骨关节炎(OA)软骨细胞增殖、凋亡,炎症因子表达及细胞外基质(ECM)合成。方法:实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测KCNK15-AS1和miR-140-5p在OA软骨组织中的表达。在OA软骨细胞中转染si-KCNK15-AS1,噻唑蓝(MTT)和流式细胞术分别检测细胞增殖与凋亡,蛋白质印迹法(WB)检测细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、p21、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-8、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅱ型胶原(Collagen typeⅡ)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、MMP-9、MMP-13的表达。双荧光素酶活性检测分析KCNK15-AS1与miR-140-5p的靶向关系。si-KCNK15-AS1和anti-miR-140-5p共转染,观察干扰miR-140-5p表达对抑制KCNK15-AS1表达诱导的OA软骨细胞增殖、凋亡,炎症因子表达及ECM合成的影响。结果:与正常软骨组织比较,OA软骨组织中KCNK15-AS1表达量明显增加(P<0.05),miR-140-5p表达量显著减少(P<0.05)。抑制KCNK15-AS1表达明显提高OA软骨细胞24 h、48 h、72 h的吸光度(OD)值和CyclinD1、Bcl-2蛋白表达量、Aggrecan、Collagen typeⅡ水平(P<0.05),显著降低细胞凋亡率、p21、Bax蛋白水平、IL-6、TNF-α、IL-8、MMP-3、MMP-9、MMP-13水平(P<0.05)。KCNK15-AS1靶向miR-140-5p抑制miR-140-5p的表达。干扰miR-140-5p表达逆转了抑制KCNK15-AS1表达对OA软骨细胞增殖、ECM合成的促进作用,对细胞凋亡、炎症因子表达的抑制作用。结论:LncRNA KCNK15-AS1通过靶向调控miR-140-5p表达影响OA软骨细胞增殖、凋亡、炎症因子表达及ECM合成。

抗HIV-1 p15(gag)IgY抗体的制备及活性检测

目的:制备具有高效价强特异性的抗HIV-1 p15(gag)鸡卵黄抗体(IgY),纯化并分析其免疫学活性。方法:用纯化的HIV-1 p15(gag)蛋白抗原免疫蛋鸡,用水稀释法对IgY抗体进行粗提取并结合乙醇沉淀和氯化钠盐析法纯化抗体,再通过SDS-PAGE、Western blot、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体的纯度、特异性及效价。结果:表达纯化的HIV-1 p15(gag)-GST融合蛋白分子量为45kDa,用于抗体检测的抗原。用纯化的His-P15蛋白作为免疫原免疫蛋鸡后,获得的卵黄抗体重链、轻链分子量分别为65kDa和25kDa。8倍体积水稀释卵黄,pH值5.1,20%冰乙醇及0.028mol/L盐溶液分离纯化,纯度可达96℅,每毫升卵黄液可得到的卵黄抗体为9.8mg。终浓度为18%～25%的冰乙醇纯化的抗体浓度高且稳定,同时具有较强的特异性和较高的效价。结论:用HIV-1p15(gag)蛋白免疫蛋鸡,可以获得高效价的特异性抗体IgY,为IgY抗体在HIV-1p15蛋白的研究奠定了实验基础。

转化生长因子-β1对人卵巢癌细胞增殖的抑制作用

目的:探讨转化生长因子(TGF)-β1对人卵巢癌细胞系HO-8910增殖的影响及其作用机制。方法:采用MTT及流式细胞术检测TGF-β1对HO-8910细胞增殖的抑制作用,同时采用半定量RT-PCR和Westernblot方法分别检测TGF-β1作用不同时相细胞中Smad7、p15、p21和c-myc基因mRNA及蛋白表达水平的变化。结果:TGF-β1明显抑制HO-8910细胞的增殖;在TGF-β1(10ng/ml)刺激下,细胞中p15和Smad7的表达上调而c-myc的表达明显降低,p21的表达无明显变化。结论:TGF-β1可能通过上调p15、下调c-myc基因表达水平影响细胞周期调控,从而抑制卵巢癌细胞的增殖。

HIV-1 p15（Gag）基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

目的：构建HIV-1p15（Gag）原核表达载体，诱导蛋白表达及制备多克隆抗体。方法：用PCR的方法扩增编码p15（Gag）基因序列，将其克隆到原核表达载体pET28a（＋）中，利用大肠杆菌表达系统表达HIV-1p15蛋白，分别用His抗体和HIV阳性血清做westernblot鉴定目的蛋白的免疫原性。纯化目的蛋白免疫家兔，制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验（ELISA），细胞免疫组织化学法检测抗体滴度及其特异性。结果：原核表达载体pET28a（＋）-p15（Gag）成功构建，可在大肠杆菌BL2。（DE3）中用IPTG诱导表达，得到相对分子质量约20KD的p15（Gag）蛋白，经westernblot鉴定正确。纯化蛋白免疫家兔，制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性。结论：得到纯化的HIV-1p15蛋白，制备的多克隆抗体能够检测自然状态下病毒蛋白p15（Gag），为进一步研究HIV-1奠定了实验基础。

5′-杂氮-2′-脱氧胞苷对高危组骨髓增生异常综合征细胞作用的体外研究

本研究探讨 5′ 杂氮 2′ 脱氧胞苷 (5 aza 2′ deoxycytidine ,5 Aza CdR ,Decitabine)对高危组骨髓增生异常综合征 (MDS)细胞体外作用的机制。以人MDS RAEB细胞株MUTZ 1细胞为研究对象 ,采用细胞培养技术、MTT增殖抑制实验测定细胞存活率及抑制率 ;用细胞形态学、流式细胞术检测磷脂酰丝氨酸 (PS)转位及细胞凋亡 ;用RT PCR检测 p15INK4B基因、甲基转移酶 (DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)基因mRNA表达 ;用甲基化特异PCR(MSP)方法检测 p15INK4B基因甲基化程度。结果表明 :5 Aza CdR对MUTZ 1细胞有生长抑制作用 ;作用后的细胞显示凋亡细胞的特征性改变。p15INK4B基因甲基化程度随 5 Aza CdR剂量增加而减弱 ,伴随 p15INK4B基因mRNA表达增加。经 3.2mmol/L 5 Aza CdR作用 4 8小时后 ,MUTZ 1细胞DNMT3A mRNA表达水平较未加药组明显下降 (灰度比为 0 .385∶0 .6 5 4 ,P <0 .0 5 ) ,DNMT1、DNMT3B mRNA表达水平与未加药组相比无明显改变。结论 :在 0 .4 - 6 .4mmol/L浓度范围 5 Aza CdR通过诱导MUTZ 1细胞凋亡而抑制该细胞生长 ,这可能是其抗肿瘤的主要机制之一。 5 Aza CdR可能通过下调DNMT3A mRNA表达使p15INK4B基因甲基化程度下降 ,从而恢复其表达。

HAD及非HAD患者中枢神经系统来源的HIV-1 Nef蛋白对U87细胞自噬的影响

目的研究HIV-1 Nef蛋白氨基酸位点变异对其抑制神经细胞自噬的影响,探讨Nef蛋白致中枢神经系统损伤的机制。方法分别扩增和克隆1例HIV相关性痴呆(HIV-associated dementia,HAD)患者(H)及1例非AIDS HAD患者(N)中枢神经系统颞叶(temporal cortex,TC)部位的HIV-1 nef基因,进行序列分析,研究氨基酸位点变异;构建H-TC和N-TC来源的Nef真核表达载体p EGFP-N1-nef,并分别转染U87细胞,观察绿色荧光蛋白并初步判断Nef蛋白表达情况;同时Western blot检测U87细胞Nef蛋白及细胞自噬标记蛋白LC3-Ⅱ、p62蛋白的表达,分析不同来源的Nef对U87细胞自噬的影响。结果PCR扩增并构建H-TC及N-TC nef基因克隆载体pMD-19T-nef,测序证实为HIV-1B亚型,氨基酸序列分析显示,H-TC与N-TC关键氨基酸位点存在差异;成功构建pEGFP-N1-nef重组质粒,在U87细胞内表达Nef蛋白,转染后48 h Nef蛋白表达量最高;Western blot结果分析表明,LC3-Ⅱ蛋白的表达量在组间的差异有统计学意义(F=11.764,P=0.001),两组细胞中LC3-Ⅱ含量较低,Western blot未能检测到。,空白组与空载体组之间LC3-Ⅱ的表达量差异无统计学意义(P=0.169),H-TC、N-TC及阳性对照CQ组LC3-Ⅱ表达升高,与空白对照或空载体相比,差异具有统计学意义(P=0.017,P=0.039,P=0.031),且H-TC组LC3-Ⅱ的表达量高于N-TC组(P=0.023);H-TC、N-TC及阳性对照CQ组p62蛋白的表达量较空白对照或空载体组有所升高,但组间差异无统计学意义(F=2.049,P=0.163)。结论HAD及非HAD患者中枢神经系统中HIV-1 Nef氨基酸位点存在差异,对U87细胞自噬的影响也因此不同,H-TC来源的Nef诱导自噬标记蛋白LC3-Ⅱ表达的能力更强。

p53/SAT1/ALOX15铁死亡通路蛋白与特发性炎性肌病的相关性

目的通过免疫组化法分别检测实验性自身免疫性肌炎(EAM)小鼠模型肌肉组织中p53、精脒/精胺N1-乙酰基转移酶1(SAT1)、花生四烯酸-15-脂加氧酶(ALOX15)蛋白的表达,探讨特发性炎性肌病(IIM)的发病机制与p53/SAT1/ALOX15铁死亡通路蛋白的相关性。方法随机将13只BALB/c小鼠分为EAM模型组(n=7)、对照组(n=6),通过粗略提取的豚鼠骨骼肌匀浆与完全弗氏佐剂混匀后皮下注射建立EAM小鼠模型,在末次免疫处理后1周,通过对小鼠临床表现的观察和体重、四肢的肌力、血清肌酸激酶水平、骨骼肌HE染色结果的测定等综合方法评定是否造模成功。通过免疫组化法分别检测EAM小鼠及对照组小鼠肌肉组织中p53、SAT1、ALOX15蛋白表达水平。结果经综合方法判定,EAM组小鼠6只造模成功(1只死亡)。EAM模型组小鼠肌肉组织中p53、SAT1、ALOX15三种蛋白的阳性表达率及免疫组化表达评分均高于对照组(P<0.05,P<0.01)。Pearson相关分析结果显示,p53分别与SAT1、ALOX15呈正相关(r=0.976,P=0.001;r=0.963,P=0.002),SAT1与ALOX15呈正相关(r=0.951,P=0.004)。结论p53/SAT1/ALOX15铁死亡通路蛋白可能参与了特发性炎性肌病的发病。

小分子RNA干扰MTA1基因对乳腺癌MDA-MB-231细胞生物活性及相关蛋白表达的影响

目的:采用短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰技术沉默乳腺癌细胞MDA-MB-231中转移相关基因(metastasis-associated gene 1,MTA1)的表达,并观察其对15-脂氧合酶-2(15-lipoxygenase-2,15-LOX-2)、p53及bcl-2表达的影响。方法:将shRNA-MTA1载体质粒稳定转染MDA-MB-231细胞,MTT法检测细胞增殖抑制情况,FCM法检测细胞周期及凋亡情况,RT-PCR和Western印迹法检测MTAl、15-LOX-2、p53及bcl-2 mRNA和蛋白表达情况。结果:shRNA-MTA1能明显降低MTA1基因在MDA-MB-231细胞中的表达量;抑制MDA-MB-231细胞的增殖,诱导其凋亡,并使细胞被阻滞在G1期,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。转染shRNA-MTA1可使MDA-MB-231细胞中15-LOX-2和p53 mRNA及蛋白的表达明显增强(P<0.01),而MTA1和bcl-2 mRNA表达明显减弱(P<0.01)。结论:MTA1基因可抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖,诱导其凋亡,该作用可能与上调细胞中15-LOX-2和p53的表达,下调bcl-2的表达有关。