按痘苗病毒优势密码子改造HIV-1 gag基因提高表达水平的研究

为确定痘苗病毒密码子偏向性与基因表达的关系及其在痘苗病毒与宿主细胞相互作用过程中的作用,按痘苗病毒的优势密码子对HIV-1gag基因进行改造,并对合成基因与野生型HIV-1gag基因在痘苗病毒载体系统的表达水平进行了研究。结果显示:①各目的基因分别正向插入了痘苗病毒TK区7.5k启动子下游;②免疫荧光检测显示,改造前后的gag基因均能够很好地在痘苗病毒中表达;③Westernblot检测显示,在相同感染量时,改造后的gag基因具有更高的表达水平;④流式细胞术检测显示,密码子改造后的gag基因较野生型gag基因表达水平提高约17%。上述结果表明:按照痘苗病毒优势密码子进行外源基因改造,可作为提高外源基因在痘苗病毒中表达的策略,同时提示,密码子偏向性是痘苗病毒与宿主细胞相互作用的重要调控因素。

HIV-1 Gag蛋白在大肠杆菌表达系统中诱导和纯化条件的优化

为探讨诱导温度对于HIV-1Gag在大肠杆菌中表达产物状态以及尿素浓度对蛋白纯化效果的影响,将30oC和37oC诱导表达的包涵体分别溶于不同浓度的尿素,比较溶解性的差异,并比较复性的不同。将30oC诱导的目的蛋白分别用2mol/L和8mol/L尿素溶解后做层析分离,比较两者的分离效果。结果发现,与37oC相比,30oC诱导表达的蛋白能有效溶于低浓度尿素,并且更容易复性。与8mol/L尿素溶解相比,30oC诱导的包涵体用2mol/L尿素溶解后通过凝胶过滤和离子交换层析纯化能得到更好的分离效果。这提示低温诱导的Gag包涵体中可能含有更多类似天然态构象的蛋白,而低浓度尿素有利于保持包涵体中蛋白的天然态构象。从而为包涵体蛋白的诱导表达和分离纯化提供了参考。

1型和2型外壳蛋白构建的AAV载体携带HIV-1 gag诱导免疫反应的比较研究

比较两种血清型的腺病毒伴随病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体携带HIV-1gag基因肌肉注射诱导小鼠免疫反应的特点。分别制备携带EGFP和HIV-1gag基因的重组AAV2/1(AAV1)和AAV2载体。小鼠肌肉注射rAAV1-EGFP和rAAV2-EGFP,观察注射局部EGFP的表达。将rAAV1-gag和rAAV2-gag分别以0、3周初免/加强方式肌肉注射免疫BALB/c小鼠以及新西兰白兔。ELISA法检测抗HIV-1 Gag P24蛋白的特异性抗体,细胞内细胞因子染色法检测Gag特异性的CTL反应。结果表明,rAAV1-EGFP在小鼠肌肉的表达强度显著高于rAAV2-EGFP;用Western blot法和间接免疫荧光法检测rAAV1-gag和rAAV2-gag体外转染的293细胞,均可检测到HIV-1 Gag蛋白的表达;在小鼠体内rAAV1-gag和rAAV2-gag组均可检测到特异性P24抗体,抗体滴度rAAV1-gag组显著高于rAAV2-gag组;而无论rAAV1-gag组还是rAAV2-gag组,特异性CTL反应均较低,与阴性对照组相比均无显著性差异;两种载体免疫兔子也都可检测到特异性P24抗体,同样地,rAAV1-gag组显著高于rAAV2-gag组。结论:携带HIV-1gag基因的rAAV1或rAAV2以肌肉注射方式免疫小鼠主要诱导特异Gag的体液免疫反应;且rAAV1可诱导很强的抗HIV-1 Gag特异性抗体,抗体水平显著高于rAAV2。

表达HIV-1 gag蛋白的重组乳酸乳球菌诱导小鼠产生体液免疫应答

目的分析表达HIV-1 gag蛋白的重组乳酸乳球菌通过口服、滴鼻、皮下注射以及上述3种方式联合免疫小鼠诱导的体液免疫反应。方法将50只BALB/c小鼠随机分成5组,每组10只。表达gag的重组乳酸乳球菌分别通过口服、滴鼻、皮下注射以及上述3种方式联合免疫小鼠,对照组口服含PMG36e空载体的乳酸乳球菌,接种菌量均为109菌落形成单位(CFU),连续免疫3次,每次间隔2周,其中口服和滴鼻每次连续免疫3 d。采集免疫前和每次免疫后2周小鼠的血清,ELISA检测gag特异性的IgG水平。结果表达gag的重组乳酸乳球菌经口服、滴鼻、皮下注射以及3种方式联合免疫均诱导小鼠产生了gag特异性IgG,且联合免疫组gag IgG水平显著高于其他各实验组(P<0.01)。初次免疫后6周,口服和皮下注射免疫组gag IgG水平显著高于滴鼻免疫组(P<0.01)。免疫3次后各组血清中gag抗体的阳性率:口服免疫组分别为40%、40%、90%;滴鼻免疫组分别为10%、20%、20%;皮下免疫组分别为10%、60%、90%;联合免疫组的阳性率在初次免疫后2周已达到100%。结论表达HIV-1 gag的重组乳酸乳球菌载体疫苗经口服、滴鼻、皮下注射及3种方式联合免疫均能诱导小鼠产生特异性的体液免疫反应,多种途径联合免疫可增强乳酸乳球菌载体疫苗的免疫效果。

广州地区献血人群HIV-1 gag基因序列分析

目的了解广州地区献血人群中人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)亚型的流行规律及其与国际参考株的同源性。方法从32例经疾控中心用蛋白印迹法确认为HIV-1阳性的无偿献血者的血浆中提取核酸,用RT-PCR进行gag基因扩增,并对扩增产物进行测序和序列分析。结果 32例标本中有3种HIV-1亚型:14例(43.8%)为CRF01_AE重组亚型,其中12例与国际标准株01_AE.CN.2005.05GX156最接近,平均基因距离为0.043 54;2例与国际标准株01_AE.VN.1998.98VNBG6最接近,平均基因距离为0.056 00;13例(40.6%)为CRF07_BC重组亚型,与国际标准株07_BC.CN.2007.07CNBJ550最接近,平均基因距离为0.026 69;5例(15.6%)为01B型,与国际标准株01B.CN.2008.08CYM003最接近,平均基因距离为0.060 42。结论广州地区献血人群中HIV-1亚型以CRF01_AE和CRF07_BC为主。

重组HIV-1 Gag/Env融合抗原在大肠杆菌中的表达及免疫学分析

在大肠杆菌中， 利用ｐＤＯＧ 载体来源的表达载体ｐＤＧａｇＥｎｖ ， 高效表达了相对分子质量（ Ｍｒ） 为４６ ５００（ｐ４６） 的重组ＨＩＶ１Ｇａｇ／ Ｅｎｖ 融合抗原（Ｇａｇ２０９ ～４３７ ＋ Ｅｎｖ４７４ ～５１８ ＋ Ｅｎｖ５４８ ～６７５） 。表达产物同时还包括：Ｍｒ ～２８ ５００ ， Ｍｒ ～２２ ０００ 与 Ｍｒ ～１９ ０００ ３ 种（ｐ２８ ，ｐ２２ 和ｐ１９） 蛋白。此４ 种表达产物均存在于包涵体中，不能被８ ｍ ｏｌ／Ｌ 尿素溶解。Ｗｅｓｔｅｒｎ 印迹分析表明，４ 种重组蛋白均能与ＨＩＶ１ 阳性血清发生特异反应；其中ｐ４６ 与ｐ２８ 蛋白能与抗ＨＩＶ１ｐ２４ 反应，而ｐ２２ 与ｐ１９ 蛋白则不与其起反应。其中ｐ１９ 蛋白对应于Ｅｎｖ４８２ ～５１８ ＋ Ｅｎｖ５４５ ～６７５ ，ｐ２２ 蛋白可能是从Ｇａｇ／ Ｅｎｖ 表达质粒的ｇａｇ 基因内部的甲硫氨酸（ＡＴＧ４２３） 起始的翻译产物。将包涵体充分洗涤后，利用制备电泳方法纯化了ｐ４６ ，ｐ２２／ｐ１９ 及ｐ１９ 蛋白。将后两种纯化蛋白质以２ ｍ ｇ／Ｌ 的浓度包被ＥＬＩＳＡ 板，检测了国家卫生部药品生物制品检定所提供的ＨＩＶ１／ ＨＩＶ２ 质检血清。结果可检出其中包含的所有１８ 份ＨＩＶ?

HIV-1 gag和env基因片段的构建及表达

为研究人免疫缺陷病毒（HIV－1）的分子生物学，发展艾滋病的诊断试剂，克隆了含HIV－1env和gag基因cDNA的质粒pUCF12。用PvuⅡ和HincⅡ降解pUCF12质粒，得到含部分p17、全部p24和全部p15基因的cDNA片段，用BglⅡ降解pUCF12质粒得到含有部分gp120和全部gp41的cDNA片段。将该两个片段分别亚克隆到表达载体PGex上，在pTac启动子的调控下，部分gag基因和env基因在大肠杆菌中表达．在SDS－PAGE中，GST＋gag融合蛋白呈现一条约70kD的染色带，其表达水平约占菌体总蛋白的18％．而GST－env蛋白则呈现一条约65kD的蛋白带，该表达蛋白约占菌体总蛋白的15％。经免疫印迹分析，该两种表达产物可分别与抗-P24和抗-gP41的单克隆抗体反应，用Abbott试剂也证明为HIV－1抗原蛋白。

HIV-1 Gag p^(17-)p^(24)在痘苗病毒中的表达及性质研究

研究了重组痘苗病毒表达的HIV1核心蛋白(Gag)p17p24蛋白的一些生物学及免疫学特点。间接免疫荧光、DotELISA及Westernblot结果表明,构建的两株重组病毒分别表达了HIV1Gagp24及p17p24融合蛋白。电镜观察证实,Gagp24及p1724重组蛋白均可形成病毒样粒子。重组病毒可诱导小鼠产生抗HIV1Gagp24抗体。重组病毒感染BHK21细胞后,可见由于细胞凋亡而致的染色体DNA断裂“梯子”电泳图。

HIV-1 Gag蛋白酵母表达产物的纯化及免疫原性检测

目的 纯化HIV 1Gag蛋白 ,并检测其免疫原性。方法 将表达HIV 1Gag蛋白的酵母工程菌GS115 /pPICGAG接种到YPD培养基中多次传代后 ,用PCR检测其目的基因。该酵母工程菌在BMMY培养基中经甲醇诱导表达 ,上清液初步浓缩后上柱进行凝胶过滤层析 ,并将纯化蛋白免疫Balb/c小鼠 ,检测其血清抗体水平。结果 该酵母工程菌经多次传代后外源基因不丢失。Westernblot检测结果表明纯化蛋白具有很好的反应原性 ,其纯度可达 85 %。纯化蛋白免疫小鼠后可诱导特异性抗体产生。结论 表达HIV 1Gag蛋白的酵母工程菌具有很好的遗传稳定性 。

HIV-1 Gag蛋白在重组痘苗病毒中的高效表达及其特性分析

在构建3株人Ⅰ型免疫缺陷病毒（HIV－1）Gag基因重组痘苗病毒的基础上，实现了Gag蛋白的高效表达，3株重组病毒在感染细胞中表达量分别为14．7、6．0和4.5μg／106细胞／20h，接近杆状病毒的表达水平。表达的重组蛋白可形成病毒样粒子（VLP），并可诱导小鼠产生抗HIV抗体。

表达HIV-1 gag-gp120嵌合基因的DNA疫苗在小鼠体内的免疫应答

目的 :检测表达HIV 1gag gp12 0嵌合基因的DNA疫苗在小鼠体内的免疫应答效果。方法 :将真核表达质粒pVAXGE肌肉注射BALB C小鼠 ,观察免疫小鼠脾T淋巴细胞亚群的数量、特异性CTL杀伤率及小鼠免疫后不同时间点血清中IgG抗体滴度。结果 :重组质粒pVAXGE免疫组小鼠脾淋巴细胞进行了增殖 ,脾特异性CTL杀伤率显著高于对照组 (P <0 0 1) ;小鼠免疫后于第 8周血清抗体达到最高。结论 :表达HIV 1gag gp12 0嵌合基因的DNA疫苗质粒可诱导BALB

HIV-1 Gag多表位嵌合基因的构建及表达蛋白的抗体制备

旨在通过构建Gag的抗原多表位融合基因及在原核系统的高表达,为HIV诊断及可能的疫苗制备提供试验基础。选定HIV-1 Gag基因中3个片段包含较多抗原表位的区域,设计带有酶切位点的引物,用PCR的方法从HIV-1HXB2全基因扩增编码这3个片段的基因序列,通过质粒提取、酶切、测序方法鉴定基因片段的正确性,SDS-PAGE和Western blotting测定融合蛋白的表达,并免疫动物制备相应抗体。结果显示,构建的HIV-1 Gag多表位嵌合基因的原核表达质粒,酶切和测序结果表明基因序列正确,基因全长576bp。在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达的重组蛋白分子量为27kD,以包涵体的形式存在。纯化目的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体IgG。ELISA和免疫荧光方法检测显示制备的多克隆抗体能具有特异性反应。成功构建和高表达了HIV-1 Gag多表位融合蛋白,纯化蛋白制备的抗体与HIV-1Gag有特异性结合。为进一步研究HIV-1奠定了试验基础。

HIV-1 gag基因经卵母细胞垂直传递模型的建立

目的:建立HIV_1gag基因经卵母细胞垂直传递的模型,为HIV通过雌性生殖细胞垂直传递的研究奠定实验基础。方法:将含有HIV_1gag基因的重组质粒pIRES2_EGFP_gag注射到小鼠双侧卵巢,转染生殖细胞。应用超排获得实验用卵母细胞,收集显示绿色荧光的卵母细胞,将一部分呈现绿色荧光的卵母细胞裂解,提取基因组DNA,采用PCR检测gagDNA是否存在卵母细胞中;再将另一部分带有绿色荧光的卵母细胞常规制备中期染色体片,用荧光原位杂交(FISH)技术检测HIV_1gag基因在成熟卵母细胞染色体上的整合。结果:转染pIRES2_EGFP_gag后,在荧光显微镜下能够很清楚地看到带有绿色荧光的卵母细胞;PCR结果显示在带有绿色荧光的卵母细胞中可检测到HIV_1gag基因特异的阳性条带;FISH检测结果显示在卵母细胞的中期染色体上检测到HIV_1gagDNA的阳性信号。结论:HIV_1gag基因能够通过卵透明带和细胞膜并整合到卵母细胞基因组内,本研究为HIV_1gag基因可经过雌性生殖细胞垂直传递给子代奠定了实验基础。

HIV-1 Gag P17m的融合表达、纯化及NMT有效底物

利用PCR技术扩增编码HIV 1GagP17m的DNA片段 ,进而构建了T7启动子控制下的C端His Tag融合表达质粒pMF P17mHT .SDS PAGE分析结果表明 ,融合蛋白 (约 2 1kD)在大肠杆菌BL2 1(DE3)中得到高表达 ,表达产物约占全菌蛋白 2 0 % .该融合蛋白主要以可溶性形式存在 ,通过金属离子 (Ni2 +)螯合亲和层析予以纯化 ,纯度在 90 %以上 .体外标记结果表明 ,融合表达的P17mHT能被人NMT有效地N端豆蔻酰化 .这些结果为深入研究筛选HIV 1GagP17或P55的豆蔻酰化专一性抑制剂 。

Immunogenicity of DNA and Recombinant Sendai Virus Vaccines Expressing the HIV-1 gag Gene

Combinations of DNA and recombinant-viral-vector based vaccines are promising AIDS vaccine methods because of their potential for inducing cellular immune responses. It was found that Gag-specific cytotoxic lymphocyte (CTL) responses were associated with lowering viremia in an untreated HIV-1 infected cohort. The main objectives of our studies were the construction of DNA and recombinant Sendai virus vector (rSeV) vaccines containing a gag gene from the prevalent Thailand subtype B strain in China and trying to use these vaccines for therapeutic and prophylactic vaccines. The candidate plasmid DNA vaccine pcDNA3.1(+)-gag and recombinant Sendai virus vaccine (rSeV-gag) were constructed separately. It was verified by Western blotting analysis that both DNA and rSeV-gag vaccines expressed the HIV-1 Gag protein correctly and efficiently. Balb/c mice were immunized with these two vaccines in different administration schemes. HIV-1 Gag-specific CTL responses and antibody levels were detected by intracellular cytokine staining assay and enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) respectively. Combined vaccines in a DNA prime/rSeV-gag boost vaccination regimen induced the strongest and most long-lasting Gag-specific CTL and antibody responses. It maintained relatively high levels even 9 weeks post immunization. This data indicated that the prime-boost regimen with DNA and rSeV-gag vaccines may offer promising HIV vaccine regimens.

IL-18和HIV-1gag-gp120嵌合基因DNA疫苗联合免疫小鼠的免疫应答

目的 :探讨IL 18和HIV 1gag gp12 0嵌合基因的DNA疫苗联合免疫小鼠的免疫应答。方法 :构建含IL 18的真核表达质粒pVAXIL18,将他与表达HIV 1gag gp12 0嵌合基因的核酸疫苗质粒pVAXGE共同肌注免疫BALB/c小鼠 ,检测免疫小鼠脾特异性CTL杀伤活性和血清抗体滴度。结果 :联合免疫组小鼠脾特异性CTL杀伤活性和血清抗体水平均显著高于单独免疫组 (P <0 .0 5 ) ,空白质粒对照组 (P <0 .0 1)和PBS对照组 (P <0 .0 1)。结论 :IL 18和HIV 1gag gp12 0嵌合基因的DNA疫苗联合免疫可诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫 ,且IL 18发挥了免疫佐剂的作用。

河南及上海患者的HIV-1 gag基因p24蛋白编码序列及亚型初步分析

目的 了解河南及上海地区人类免疫缺陷病毒 (HIV)感染者 p2 4蛋白编码区的基因变异性以及亚型的分布状况。方法 收集 37份HIV 1感染患者的血浆标本 ,河南 2 5份 ,感染途径主要是有偿供血 ;上海 12份 ,主要是血制品感染及性接触感染。采用逆转录和套式聚合酶链反应 (PCR)扩增并直接测序 ,然后进行序列比对及进化树分析。结果 83.8% (31/ 37)为B亚型 ,河南患者中 2 3例为B亚型 ,2例为A亚型 ;上海患者中 8例为B亚型 ,1例为A亚型 ,2例为CRF0 1-AE亚型 ,1例为CRF0 2 -AG亚型。与国际共享序列相比 ,B亚型 p2 4编码区中发生核苷酸改变的位点比例河南为1.6 %～ 4 .2 % ,平均 3.2 % ;上海为 2 .0 %～ 3.8% ,平均 3.4 %。在所有变异位点中均未发现连续G >A的高度突变。两组B亚型内平均基因离散率分别为 3.7%和 3.5 % ,B亚型与其他亚型之间的基因离散率则为 11.1%～ 12 .5 %。河南及上海地区B亚型共享序列与国际共享序列进行比对 ,氨基酸变异的比例均为 2 .2 % (5 / 2 31) ,其中有 3个变异位点相同 ,分别为A14P、I91V及E180D ,而这两个共享序列之间的差异仅为 0 .9% (2 / 2 31)。进化树分析亦表明所有样本中大多为B亚型 ,且与源自泰国的B’亚型相距较近。结论 河南及上海地区的B亚型之间有较高的同源性 ,p2 4?

中国流行株HIV-1gag和hIL-2/hIL-6核酸疫苗构建与实验免疫研究

目的探讨中国流行株 HIV- 1gag与 h IL - 2 /h IL - 6共表达重组核酸疫苗质粒的免疫效果。方法以核酸疫苗质粒 p IRES1neo为表达载体 ,构建重组核酸疫苗质粒 p IRES1- gag、p IRES1- gag- h IL- 2、p IRES1- gag- h IL- 6 ,通过间接免疫荧光试验、Dot- EL ISA检测 gag/h IL - 2 /h IL - 6基因的表达产物。另将此重组核酸疫苗质粒免疫 Balb/c小鼠 ,进行淋巴细胞转化试验、CD4+ 、CD8+ T淋巴细胞数量测定、细胞毒性 T淋巴细胞 (CTL )特异性杀伤作用检测及血清抗体检测 ,结果构建的重组质粒转染 BHK细胞后可表达目的基因 ,免疫小鼠后可有效地刺激淋巴细胞增殖、诱导特异性 CTL 反应 ,当和 h IL- 2 /h IL- 6共表达时免疫效果更加显著。讨论与 Gag蛋白共表达的 h IL- 2 /h IL- 6能够进一步增强免疫鼠的细胞免疫与体液免疫水平 ,构建的重组质粒为 HIV-

表达HIV-1 gag重组鸡痘病毒的构建与筛选

构建并筛选表达HIV-1 gag蛋白的重组鸡痘病毒,并对其进行鉴定。首先设计引物通过PCR技术扩增HIV-1 gag基因,将其连接到pMD18-T载体上,测序正确后将其克隆入本实验室自行构建的鸡痘病毒穿梭载体pTKET中,获得重组质粒pTKET-HIV gag。然后将其与鸡痘病毒FPV282E4株共转染原代鸡胚成纤维细胞(CEF)进行同源重组,以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为筛选标记,通过噬斑筛选获得重组病毒,应用PCR,RT-PCR,Western blot方法对重组病毒进行鉴定和遗传稳定性分析。结果:通过10次噬斑筛选,PCR检测表明目的基因已整合到重组鸡痘病毒基因组中,RT-PCR,Western blot结果表明HIV-1 gag在感染细胞内成功表达且具有抗原性。连续传代20次,PCR,RT-PCR,Western blot均能检测到外源基因的整合、转录和表达,且未能扩增出FPV-TK基因,表明重组病毒遗传稳定性良好,而且病毒已经纯化。结论:成功获得表达HIV-1gag的重组鸡痘病毒,为进一步免疫试验研究奠定基础。