HIV-1 HXB2株Tat蛋白在大肠杆菌中的分段表达及免疫原性分析

目的研究对人类免疫缺陷病毒Ⅰ型HXB2株调控蛋白Tat原核表达产生影响的区域和Tat蛋白重要的抗原表位。方法用PCR方法获得Tat(1-48aa)、Tat(22-72aa)和Tat(38-101aa)DNA片段,构建其原核表达质粒pET32a-Tat(1-48aa)、pET32a-Tat(22-72aa)和pET32a-Tat(38-101aa),并转入E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达及纯化,SDS-PAGE鉴定表达及纯化产物。采用间接ELISA方法用兔抗pET32a-Tat抗血清对三种肽段进行免疫原性分析。结果成功构建了pET32a-Tat(1-48aa)、pET32a-Tat(22-72aa)和pET32a-Tat(38-101aa)质粒,分别表达出相对分子质量(Mr)为23×103、23×103和25×103的融合肽段,其浓度分别为4.26、3.35和5.11mg/ml。间接ELISA结果表明三种融合肽段与兔抗pET32a-Tat抗血清均呈特异性结合反应,其抗体滴度分别为1:128000、1:32000、1:64000,而抗血清与pET32a蛋白仅有较弱结合。结论半胱氨酸富集区(22-37位氨基酸)对Tat蛋白的原核表达有较显著影响;Tat蛋白的N端区、碱性区和C端区是其重要的抗原表位,其中N端区的免疫原性最强。

HIV-1 HXB2株Tat半胱氨酸富集区N端移位突变体的构建及在大肠杆菌中的高效表达

目的构建HIV-1HXB2株Tat半胱氨酸富集区N端移位突变体,并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行高效表达和纯化。方法应用PCR拼接的方法将首轮合成Tat基因的半胱氨酸富集区(64～111位核苷酸,22～37位氨基酸)移位至缺失半胱氨酸富集区的Tat(△C)的N末端,获得其突变体序列(Tat(CN)DNA),构建其原核表达质粒pET32a-Tat(CN),并转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达及纯化,经SDS-PAGE鉴定表达及纯化产物,纯化后的产物用间接ELISA进行鉴定。结果构建了pET32a-Tat(CN)突变体,pET32a-Tat(CN)融合蛋白在大肠杆菌中表达水平为5.17mg/ml,相对分子质量为31ku。间接的ELISA结果表明,pET32a-Tat(CN)能与Tat兔抗血清呈特异反应。结论成功构建了HIV-1 HXB2株Tat半胱氨酸富集区移位至TatN端的突变体,并能在大肠杆菌中高效表达,其纯化的蛋白pET32a-Tat(CN)很好地保留了与HIV-1Tat兔抗血清的免疫反应性,为HIV-1Tat的疫苗基础研究提供了一有价值的研究结论。

经长期HAART治疗的中国HIV—AIDS患者外周血细胞内HIV-1前病毒DNA的检测及其意义

目的探索NK细胞是否是HIV-1病毒的储存库细胞之一，并观察在长期HAART治疗后，T淋巴细胞及单核细胞内是否仍有HIV-1前病毒DNA存在。方法对15例规范接受HAART治疗4～7年的HIV—AIDS患者采集血标本进行横断面研究。使用磁珠分选法从外周血单个核细胞（PBMC）中分离出T淋巴细胞、单核细胞和NK细胞，通过HIV实时荧光定量检测外周血HIV-1RNA病毒载量和NK细胞、单核细胞、T淋巴细胞内的HIV-1 DNA水平，流式细胞术检测外周CD4＋T细胞数量，对数据进行统计学处理。结果15例接受4～7年[平均（62．45±13．53）个月]HAART治疗的HIV／AIDS患者外周血HIV-1RNA均低于检测下限（〈50拷贝／ml）；T淋巴细胞、NK细胞中和单核细胞中HIV-1前病毒DNA的平均含量分别为2．03±0．48、1．82±0．32和1．754-0．19（10g10拷贝／10。个细胞）；3种细胞中HIV-1DNA阳性（〉50拷贝／m1）者比例分别为6／15、4／15、2／15。结论中国HIV-1感染者外周血中除了T淋巴细胞和单核细胞外，NK细胞也可能是HIV-1的病毒储存库之一。在长期HAART治疗（4～7年）后，尽管表现出明显的抗病毒效果和免疫重建效果，仍然未能彻底清除NK细胞、T淋巴细胞和单核细胞中的HIV-1前病毒DNA。