HIV-1 CN54 Gag P55和P24蛋白的高效表达、纯化和鉴定

目的 探讨HIV 1中国株CN5 4GagP5 5和P2 4重组蛋白的高效表达并纯化 ,为研究HIV疫苗和诊断试剂创造条件。方法 分别将CN5 4GagP5 5和P2 4基因克隆至 pBV2 2 0和 pThioHisC载体 ,构建非融合表达载体 ;将重组质粒转化大肠杆菌BL2 1codonplus RIL ,对工程菌进行诱导表达。Western Blot检测目的蛋白 ,用DEAE SeparoseFF阴离子交换层析柱纯化目的蛋白 ;纯化的P5 5和P2 4抗原蛋白分别包被酶标板作ELISA检测。结果 P5 5以包涵体的形式表达 ,表达量占菌体总蛋白的 30 % ,P2 4实现了可溶性表达 ,表达量占总菌体总蛋白的4 0 % ;纯化后P5 5纯度达到 80 % ,P2 4纯度超过 90 %。Western Blot和ELISA检测均显示了良好的的灵敏度和特异性。结论 HIV 1CN5 4GagP5 5和P2 4抗原蛋白可在大肠杆菌中高效表达 ,纯化的抗原蛋白具有良好抗原性 。

重组HIV-1 CN54 Nef抗原的制备及鉴定

目的原核表达HIV-1CN54调控蛋白Nef,并进行纯化、复性及鉴定。方法将CN54 Nef基因克隆至pThio-HisA载体,构建非融合表达载体,转化大肠杆菌BL21 Codonplus-RIL,IPTG诱导表达,通过尿素梯度洗涤包涵体纯化Nef蛋白,透析复性。Western blot检测目的蛋白的特异性。结果Nef蛋白以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的40%以上。用尿素洗涤法可直接纯化Nef,纯度达到90%以上。Nef蛋白透析后溶解于PBS缓冲液中。Western blot检测显示了良好的特异性。结论HIV-1 CN54 Nef抗原蛋白可在大肠杆菌中高效表达,采用的纯化和复性Nef蛋白的工艺简便、快捷,为开发针对Nef基因的HIV-1疫苗奠定了基础。

HIV-1_(CN54) DNA疫苗滴鼻免疫小鼠诱发系统和黏膜免疫应答

目的 探讨重组痘苗病毒rVVsyngp12 0或rVVmCN5 4gp12 0候选疫苗是否增强HIV 1CN5 4合成gp12 0基因(syngp12 0 )DNA疫苗的免疫原性。方法 第 0、7、14、2 1天用DNA疫苗滴鼻免疫小鼠 ,第 2 8、35、4 2天再滴鼻接种rVVsyngp12 0或rVVmCN5 4gp12 0。体外测脾和肠系膜淋巴结 (MLN)淋巴细胞增殖应答与CD8+ CTL应答。测血清和黏膜洗液特异的IgG和IgA ,并测其是否中和实验室适应株HIV 1SF33。结果 单纯DNA免疫后 ,脾和MLN淋巴细胞在体外发生增殖应答和CTL应答 ,且测出血清特异的IgG和黏膜洗液特异的IgA。重组痘苗病毒末次免疫后第 2周 (第 5 6天 ) ,发现rVVmCN5 4gp12 0增强MLN淋巴细胞增殖应答和CTL应答 ,脾CTL应答也增强。rVVsyngp12 0则增强MLNCTL应答。同时发现 :2组重组痘苗病毒免疫的动物其血清中特异IgG抗体滴度均有所增高 ,但黏膜 (粪便和阴道 )洗液特异IgA抗体滴度却未增高 ,未测出血清特异IgA和黏膜洗液特异IgG。免疫血清可中和HIV 1SF33,而阴道洗液却不能。结论 单纯DNA疫苗滴鼻免疫可诱发较弱的系统和黏膜体液免疫与细胞免疫 ,但维持时间短。重组痘苗病毒主要增强局部黏膜的细胞免疫应答 ,且稍增强系统体液免疫应答 ,未增强黏膜的IgA应答。

共表达HIV-1CN与IL-2基因产物免疫鼠T淋巴细胞亚群的研究

目的 :研究细胞因子在机体免疫应答过程中的免疫佐剂效应。方法 :以表达中国流行株HIV lgag gp12 0基因的核酸疫苗质粒 pcDNAGP及共表达中国流行株HIV lgag gp12 0基因与Ⅱ 2基因的核酸疫苗质粒 pGPH 2免疫Balb/c鼠 ,用流式细胞仪测定 10 0 0 0个免疫鼠脾淋巴细胞中CD4+,CD8T细胞数及CD4+/CD8+比值。结果 :pGIL 2与pcDNAGP比较 ,pGIL 2免疫鼠CD4 和CD8T细胞数明显提高。结论 :在机体的免疫应答过程中 ,细胞因子IL

HIV-1 CN54 Pol P51抗原高效表达、纯化、复性及在抗体检测中的应用

为获得可溶性高纯度HIV-1中国株CN54PolP51抗原,将携带CN54polp51基因的重组质粒pTHioHisA51转化大肠杆菌BL21codonplus-RIL,用IPTG进行诱导表达。用Chelating SepharoseFF-Ni亲和层析柱及DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱纯化目的蛋白,采用透析复性法得到可溶性抗原,Western blotting检测目的蛋白。用纯化的P51抗原蛋白标记辣根过氧化物酶及包被酶标板进行双抗原夹心法ELISA检测。结果显示P51以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的50%,经两步层析和透析复性,目的蛋白纯度大于95%。Western blotting和双抗原夹心法ELISA检测均显示了良好的灵敏度和特异性。本研究可以为HIV-1疫苗研究和开发检测试剂提供支持。

HIV-1膜蛋白gp140三聚体的真核表达、纯化、鉴定

目的构建表达中国流行株HIV-1 CRF_07 B/C亚型(CN54)膜蛋白gp140及其突变体,为HIV-1疫苗设计提供优秀的免疫原。方法构建gp140、gp140 ST质粒,将质粒瞬时转染293F细胞,120h后收获上清液,经纯化、浓缩、PBS置换后,利用SDS-PAGE电泳、Western-blot检测蛋白的表达,ELISA检测其与HIV-1阳性病人血清的反应性。结果 SDS-PAGE电泳、Western-blot试验证明成功表达了gp140、gp140 ST蛋白,并且gp140 ST是一个稳定的三聚体蛋白质。ELISA试验检测,发现表达的gp140 ST蛋白与HIV-1阳性病人血清的亲和力高于gp140蛋白。结论经过突变改造的gp140 ST具有稳定的三聚体构象,可作为HIV-1免疫原进行疫苗研究。