艾滋病相关痴呆机制研究:鼠海马脑片CA1区突触传递及可塑性与HIV-1包膜糖蛋白gp120的关系(英文)

背景:目前对艾滋病相关性痴呆(HIV-1associateddementia,HAD)仍没有特效的治疗药物,主要因为对HIV-1感染引起的神经损伤和坏死的机制,仍没有完全阐明。目的:探讨人类免疫缺陷病毒I型(humanimmunodeficiencyvirusItype,HIV-1)包膜糖蛋白gp120对鼠海马脑片CA1区的突触传递及可塑性的影响,以期阐明HAD的形成机制。设计:配对设计。单位:暨南大学医学院的病理生理教研室。材料:实验于2003-01/10在暨南大学医学院病理生理教研室犤国家中医药管理局三级重点实验室(登记号:TCM-03-131)犦完成。实验用2～5周龄雄性SD大鼠。干预:应用离体脑片灌流及记录技术。主要观察指标:记录大鼠海马CA1区的兴奋性突触后电位(excitatorypostsynapticpotential,EPSP),研究了gp120对高频电刺激Schaffer侧支引起的鼠长时程增强效应(long-termpotentiation,LTP)的影响。结果:发现gp120对大鼠海马CA1区LTP产生抑制作用犤LTP的平均幅度由正常的(216.1±14.0)%降到(90.8±6.0)%,n=12,P<0.01犦,对其基础EPSP没有影响。PKA/PKC蛋白激酶抑制剂H7可以反转这种抑制效应犤LTP的平均幅度为(198.8±16.2)%,n=8,P<0.01犦。结论:gp120可能是通过抑制海马CA1区的LTP而参与HAD的形成。

柚皮苷通过P2X7受体减轻HIV-1包膜糖蛋白gp120导致大鼠神经功能损害的的作用及机制

人类免疫缺陷病毒-1(Human immunodeficiency virus-1,HIV-1)包膜糖蛋白gp120能够引起大鼠出现学习记忆障碍的行为学改变并增加海马中P2X7受体的表达;柚皮苷对gp120引起的行为学改变及P2X7表达增多具有改善作用。为了研究柚皮苷通过减少P2X7受体表达减轻gp120导致大鼠神经功能损害的作用及机制,本实验选择SD大鼠并分为假手术操作的对照组、脑室注射gp120的gp120组、脑室注射gp120及不同剂量柚皮苷灌胃的柚皮苷组、脑室注射BzATP的BzATP组、脑室注射gp120、BzATP及90mg/kg柚皮苷灌胃的90mg/kg/d柚皮苷+BzATP组。Morris水迷宫检测逃避潜伏期及错误次数,TUNEL法检测海马中细胞凋亡率,Elisa法检测海马中肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)的含量,Western blot检测海马中P2X7受体的表达。结果显示:与对照组比较,gp120组大鼠的逃避潜伏期延长,错误次数及海马中细胞凋亡率、TNF-α、IL-1β、IL-6的含量、P2X7受体的表达水平增加(P<0.05);与gp120组比较,不同剂量柚皮苷组大鼠的逃避潜伏期缩短,错误次数及海马中细胞凋亡率、TNF-α、IL-1β、IL-6的含量、P2X7受体的表达水平减少(P<0.05);与90mg/kg/d柚皮苷组比较,90mg/kg/d柚皮苷+BzATP组大鼠的逃避潜伏期延长,错误次数及海马中细胞凋亡率、TNF-α、IL-1β、IL-6的含量、P2X7受体的表达水平增加(P<0.05)。本研究的结果表明柚皮苷减轻HIV-1包膜糖蛋白gp120诱导的神经功能损害,这一作用与抑制海马组织中P2X7受体表达并减轻炎症反应及细胞凋亡有关。创新在于首次阐明了柚皮苷减轻HIV-1包膜糖蛋白gp120诱导神经功能损害的分子机制。在gp120引起大鼠行为学改变及海马组织中细胞凋亡、炎症反应激活的过程中,柚皮苷通过抑制P2X7受体的表达来改善行为学改变、抑制细胞凋亡及炎症反应的激活。

PGC-1α基因在HIV-1包膜糖蛋白gp120诱导神经元线粒体功能障碍中的作用及机制研究

人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency viru,HIV)包膜糖蛋白gp120具有神经毒性,可引起神经元损伤,与HIV相关性痴呆的发生有关,但gp120引起神经元损伤的机制尚不清楚。有研究报道gp120能够引起神经元出现线粒体功能障碍,而PGC-1α是促进神经元内线粒体生成的关键基因。因此,本研究将分析PGC-1α基因在HIV-1包膜糖蛋白gp120诱导神经元线粒体功能障碍中的作用及机制。原代培养皮层神经元细胞后分为对照组、gp120组、空白质粒组、gp120+空白质粒组,gp120+PGC-1α质粒组、PGC-1α质粒组,检测细胞活力OD_(490 nm)、线粒体膜电位(△ψm)水平、三磷酸腺苷(ATP)含量、活性氧簇(ROS)含量、凋亡率及PGC-1α、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3的表达水平。结果显示,gp120组皮层神经元的PGC-1α表达水平、OD_(490 nm)水平、△ψm水平、ATP含量均低于对照组,ROS含量、凋亡率、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3的表达水平均高于对照组;过表达PGC-1α后,gp120+PGC-1α质粒组皮层神经元的PGC-1α表达水平、OD_(490 nm)水平、△ψm水平、ATP含量均高于gp120+空白质粒组,ROS含量、凋亡率、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3的表达水平均低于gp120+空白质粒组。以上结果表明,gp120诱导皮层神经元出现线粒体氧化呼吸功能减退、线粒体途径凋亡等线粒体功能障碍的表现,抑制PGC-1α基因表达是gp120诱导线粒体功能障碍的相关机制之一。本研究的创新点在于探究了gp120诱导神经元线粒体功能障碍的分子机制,研究发现抑制PGC-1α基因表达是gp120诱导神经元线粒体功能障碍的相关机制之一,这为今后阐明gp120诱导神经元损伤及HIV相关性痴呆的发病机制提供了实验依据。

右美托咪定对HIV-1包膜糖蛋白gp120诱导大鼠学习记忆障碍的改善作用及机制

人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)包膜糖蛋白gp120促进P2X7受体激活与AIDS痴呆综合征的发生密切相关。右美托咪定(Dex)具有神经保护作用,在创伤性脑损伤大鼠中能够抑制P2X7受体表达并改善认知功能,但Dex在AIDS痴呆综合征中的治疗作用尚不明确。为了研究Dex对HIV-1包膜糖蛋白gp120诱导大鼠学习记忆障碍的改善作用及机制,本研究将SD大鼠分为对照组、gp120组、BzATP组、gp120+Dex组、gp120+Dex+BzATP组,进行侧脑室灌注gp120、P2X7受体激动剂BzATP组或腹腔注射Dex的操作。采用定位航行实验检测逃避潜伏期,空间探索实验检测探索时间,试剂盒检测白介素-1β(IL-1β)、白介素-18(IL-18)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的含量,DHE荧光探针检测活性氧簇(ROS)的含量,western blot检测P2X7受体、NLPR3、caspase-1、p-p38MAPK的表达水平。结果显示,与对照组比较,gp120组的逃避潜伏期延长,探索时间缩短,海马中IL-1β、IL-18、TNF-α、ROS、MDA的含量及P2X7受体、NLPR3、caspase-1、pp38MAPK的表达水平增加,SOD、GPx的含量降低;与gp120组比较,gp120+Dex组的逃避潜伏期缩短,探索时间延长,海马中IL-1β、IL-18、TNF-α、ROS、MDA的含量及P2X7受体、NLPR3、caspase-1、p-p38MAPK的表达水平降低,SOD、GPx的含量增加;与gp120+Dex组比较gp120+Dex+BzATP组的逃避潜伏期延长,探索时间缩短,海马中IL-1β、IL-18、TNF-α、ROS、MDA的含量及P2X7受体、NLPR3、caspase-1、p-p38MAPK的表达水平增加,SOD、GPx的含量降低。以上结果表明,Dex对HIV-1包膜糖蛋白gp120诱导的大鼠学习记忆障碍具有改善作用,抑制P2X7受体及下游NLRP3、p-p38MAPK表达是介导这一改善作用的可能机制。

HIV-1表面糖蛋白gp120 DNA疫苗质粒的构建与表达

目的 构建含HIV-1表面糖蛋白基因的真核表达质粒,并在Hela细胞内表达。方法 在核酸疫苗载体质粒 pVAX1中插入gp120基因,构建真核表达质粒pVAXGP。在体外用脂质体法将重组质粒转染Hela细胞,并用间接免疫荧光试验、免疫印迹试验和Dot-ELISA对表达产物进行检测。结果 间接免疫荧光试验结果显示,转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光。免疫印迹试验和Dot-ELISA结果均显示,重组质粒转染细胞的裂解物中存在表达的gp120蛋白。结论 已成功地构建了真核表达质粒,且表达的蛋白具有良好的反应原性和特异性。

HIV-1糖蛋白gp120激发人小胶质细胞钙内流效应和ERK磷酸化

目的:探讨HIV-1糖蛋白gp120对人小胶质细胞钙离子内流和ERK磷酸化的作用及其机制。方法:用钙离子探针Fluo-4标记粘附在盖玻片上的人小胶质细胞,运用共聚焦显微镜以荧光强度为指标实时观察各种条件下的细胞内钙离子水平的变化;用gp120处理并用anti-gp120-FITC进行染色,运用共聚焦显微镜术和流式细胞术分析人小胶质细胞与gp120结合情况;用抗磷酸化ERK抗体免疫荧光方法进行染色,运用共聚焦显微镜术和流式细胞术进行ERK磷酸化水平分析。结果:共聚焦显微镜检测结果显示HIV-1糖蛋白gp120能够激发人小胶质细胞钙离子内流效应;共聚焦显微镜和流式细胞仪分析结果显示gp120可以与人小胶质细胞结合;共聚焦显微镜和流式细胞仪分析结果显示gp120刺激可增加人小胶质细胞ERK磷酸化。结论:HIV-1糖蛋白gp120能在人小胶质细胞激发钙离子内流并且增加胞内ERK的磷酸化,从而导致了小胶质细胞的活化,这一效应提示,在HIV-1相关性脑炎中,gp120可能参与了某些发病机制。

Ⅰ型人类免疫缺陷病毒包膜糖蛋白修饰体表达载体的构建及鉴定

目的构建V3环完全或部分缺失的I型人类免疫缺陷病毒(hauman immunodeficiency virus type I,HIV-1)ADA株包膜糖蛋白表达体系。方法分别设计包膜糖蛋白两端及V3环删除区域两端的引物,采用重叠延伸剪接法进行HIV-1 ADA株包膜糖蛋白V3环修饰体的构建。得到的PCR产物经EcoR I和Xho I双酶切,将酶切产物与pSM载体连接,转化大肠埃希菌后筛选阳性克隆,经PCR及基因序列测定进行鉴定。结果获得HIV-1 ADA株包膜糖蛋白V3环修饰体PCR产物,构建了其表达载体pSM-ADA△V3和pSM- ADAmV3,经转化和筛选获得了重组质粒,经PCR及基因测序鉴定显示重组质粒序列正确,为预期目的片段。结论成功构建了V3环修饰的HIV-1 ADA株包膜糖蛋白的表达载体。此结果为进一步构建伪病毒,观察V3环完全或部分缺失对病毒侵入靶细胞过程的影响,为开发阻止HIV-1进入靶细胞的药物或疫苗打下基础。

抗HIV-1 gp120单克隆抗体体外阻断CD4细胞HIV感染的研究

目的:抗HIV-1gp120单克隆抗体对细胞感染HIV的拮抗作用研究。方法:制备抗HIV-1gp120单克隆抗体,鉴定其特性;研究抗HIV-1gp120单克隆抗体对细胞感染HIV的拮抗作用。结果:构建的重组质粒的外源基因片段经测序与预期HIV-1gp120抗原基因片段大小一致;高浓度时该单克隆抗体能够抑制HIV病毒的感染,随着抗体浓度的降低,中和实验的抑制率也随之下降;高浓度时该单克隆抗体能够显著抑制病毒的感染,随着抗体浓度的降低,HIVgp120RNA定量增高。结论:获得6株稳定分泌抗HIV-1gp120单克隆抗体的杂交瘤细胞株,该抗HIV-1gp120单克隆抗体具有一定的抗HIV作用。

来源于HIV-1 gp120 V3区的多肽诱导PC12细胞凋亡的初步研究

目的研究HIV-1 gp120 V3区多肽诱导神经细胞凋亡中的机制。方法体外培养大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞),采用Annexin V联合细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(PI)法结合流式细胞术检测细胞的凋亡;获得细胞凋亡模型后,采用Western blotting研究不同浓度(0、100、200、400、800 nmol/L)来源于gp120的多肽处理细胞以及400 nmol/L多肽在不同时间(0、4、12、24、36、48 h)对PC12细胞PLK-1表达的影响。结果 HIV-1 gp120 V3区多肽诱导PC12细胞凋亡后,Polo样激酶1的表达降低,并呈现浓度-时间依赖性。结论 HIV-1 gp120 V3区多肽诱导PC12细胞凋亡与PLK-1有关。

HIV-1 CRF01_AE毒株gp41蛋白生物信息学预测

目的:对HIV-1 gp41蛋白的膜外区和跨膜区进行预测,并分析该蛋白的结构和功能。方法:从NCBI GenBank数据库获取gp41基因及其蛋白编码序列,利用ExPASy ProtParam tool、ProtScale、SignalP 4.0 Server、TMHMM Server v.2.0、SWISSMODEL、PredictProtein等工具对gp41蛋白的生物学特性进行预测。结果:HIV-1 gp41基因ORF长度为666 bp,编码222个氨基酸,蛋白分子式为C1164H1815N317O325S6,等电点(isoelectric point,pI)=8.60,属于稳定、疏水性蛋白。该蛋白具有跨膜区,信号肽切割位点位于第20和21位氨基酸处。其二级结构由无规则卷曲、β折叠和α螺旋组成,属于全螺旋型蛋白。而且该蛋白具有N-端信号肽,能引导蛋白分泌到胞外。此外gp41蛋白具有4个蛋白质-蛋白质和1个蛋白质-核酸结合位点,这些位点能调控gp41蛋白的多种生物学功能。结论:对gp41蛋白的结构和功能进行了预测,为深入研究其参与疾病发生发展的分子机制奠定了基础。

蛇床子素减轻HIV gp120诱发的周围神经病理痛

目的探讨蛇床子素(osthole,Ost)对背根神经节(dorsal root ganglia, DRG)P2X_3受体(P2X_3R)介导人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)包膜糖蛋白gp120诱发周围神经病理痛的作用及机制。方法建立HIV gp120诱发周围神经病理痛大鼠模型,其中Ost给药组大鼠于建模术前7 d至术后14 d灌胃给药(40 mg·kg^(-1)·d^(-1))。检测各组大鼠机械痛缩足反射阈值(PWT)与热痛缩足反射潜伏期(PWL);实时定量PCR、蛋白印迹、免疫组化等方法检测DRG中神经元P2X_3R、炎性因子及ERK、p-ERK等的表达;全细胞膜片钳检测HEK293细胞三磷酸腺苷(ATP)激活电流及Ost对电流的影响。结果 gp120组大鼠PWT、PWL较假手术组(sham)减小,大鼠DRG中P2X_3R、TNF-αR及p-ERK表达均较sham组明显升高;gp120+Ost组大鼠PWT、PWL较gp120组增大,大鼠DRG中P2X_3R、TNF-αR及p-ERK表达均较gp120组降低;Ost抑制了转染人P2X_3R的HEK293细胞ATP激动电流。结论 Ost下调DRG神经元中P2X_3R,抑制相关信号通路与炎性反应,减轻gp120诱发的周围神经病理痛。

HIV包膜蛋白的结构及其相应的病毒进入抑制剂

HIV-1病毒包膜蛋白gp120和gp41在病毒感染中起着重要的作用。在病毒进入细胞的过程中,gp120先和CD4分子结合,发生构象改变,进而导致gp41构象的变化,使病毒包膜和细胞膜融合而感染细胞。与gp120或者gp41相结合的多肽、大分子和小分子化合物,都可能影响HIV-1病毒包膜和靶细胞膜结合的过程,从而起到抗HIV-1病毒的作用。该文对gp120和gp41的结构及其相互作用,以及以HIV-1包膜糖蛋白为靶点的病毒进入抑制剂类抗艾滋病药物进行综述。

基于中国HIV-1 CRF01_AE重组亚型gp41 NHR结构域亚单位疫苗的研究

目的:构建基于中国HIV-1 CRF01_AE重组亚型包膜糖蛋白gp41 NHR结构域N51的亚单位疫苗,并进行免疫原性研究。方法:设计4条引物,运用重叠延伸PCR方法扩增出N51Fd基因,将其插入真核表达载体pFUSE-hIgG1-Fc2,构建重组质粒pFUSE/N51Fd并进行序列测定。Western blot法检测N51FdFc-AE重组蛋白的表达。用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠后,ELISA法检测小鼠的抗体反应。结果:成功构建了pFUSE/N51Fd重组质粒,N51FdFc-AE重组蛋白在真核体系获得了高效表达,Western blot结果显示在相对分子质量(Mr)35 000处有目的蛋白条带。小鼠抗血清能特异性识别源于gp41 NHR的抗原,效价高达1∶102 400,平均效价为1∶51 200。结论:改造后的亚单位疫苗能有效激活机体的免疫响应,可用于HIV候选疫苗的研发。

HIV-1 SF_2株env基因(gp41)的克隆构建及其原核表达

目的 克隆并在大肠杆菌中表达HIVgp4 1。 方法 应用PCR技术 ,纯化HIV 1SF2 株外膜蛋白env基因 (gp4 1) ,并重组入原核高效表达载体 pBV2 2 0 ,在大肠杆菌HB10 1中进行表达。 结果 SDS PAGE电泳结果表明 ,在 4 4 0 0 0处有一条蛋白表达带。Westernblot证明 ,4 4 0 0 0蛋白带可与HIV 1阳性血清发生特异性反应。结论 该重组表达 gp4 1的融合蛋白 ,可为HIV 1gp4 1。

HIV gp120致心脑血管病分子机制

随着艾滋病（获得性免疫缺陷综合征,AIDS）高效抗逆转录病毒疗法（HAART）的推广应用,AIDS患者生命质量不断提高,但是人类免疫缺陷病毒（HIV）感染及AIDS相关的心脑血管病却相继增加,成为AIDS患者死亡的重要威胁。近来研究表明,HIV本身可致心脑血管病,其中HIV包膜糖蛋白gp120（HIV gp120）具有致病性,对HIV/AIDS性心脑血管病发生发展起潜在作用。

HIV-1流行株去糖基化修饰gp41突变体的构建及其表达和纯化

目的:构建HIV-1ⅢB标准株、中国大陆地区主要流行株CRF-BC和海南省流行株CRF-AE野生型和突变型gp41表达载体,获得gp41重组蛋白。方法:利用基因定点突变的方法,将HIV-1ⅢB、CRF-BC和CRF-AE流行株野生型gp41基因中特定的N611Q糖基化位点天冬酰胺Asn突变为谷氨酰胺Gln,使该位点去糖基化。利用基因工程技术构建野生型pc DNA3. 1-gp41和突变型pc DNA3. 1-Mgp41表达载体。取测序正确的重组质粒转染293 T细胞,重组蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后采用免疫杂交方法进行分析。结果:测序结果显示野生型gp41的N611糖基化位点均由天冬酰胺(Asn)的编码基因(AAU)突变为谷氨酰胺(Gln)的编码基因(GAA),成功构建了野生型和突变型gp41表达载体。琼脂糖凝胶电泳分析显示野生型和突变型HIV-1 gp41基因大小约为700 bp,Western blot免疫杂交结果显示在26 k D处出现目的条带,与预期一致。结论:成功构建了HIV-1流行株去糖基化修饰gp41突变体,为研究去糖基化修饰gp41蛋白与疾病发生发展的分子机制奠定基础。

HIV-1包膜糖蛋白V_3环对大鼠海马长时程增强效应的影响

目的 探讨人免疫缺陷病毒Ⅰ型 (HIV 1)的包膜糖蛋白V3 环对大鼠海马脑片CA1区的突触传递及可塑性的影响。方法 应用离体脑片记录技术 ,记录大鼠海马CA1区的场兴奋性突触后电位 (fieldexcitatorypostsynapticpotentials,f EPSP) ,研究了V3 环对高频电刺激Schaffer侧支引起的鼠长时程增强效应 (long termpotentiation ,LTP)的影响。结果 V3 环对高频电刺激 (HFS ,10 0Hz,10 0 0ms× 2 ,串间隔 2 0s,共 2次 )Schaffer侧支引起的大鼠海马CA1区LTP产生抑制作用 ,而对其基础f EPSP没有影响。用浓度为 2 0 0pmol/L的V3 环灌流脑片 ,可引起LTP的维持发生抑制。这种抑制作用可被V3 环特异抗体V3 McAb(4 0ng/ml)所拮抗。结论 V3 环可能是通过抑制海马CA1区的LTP诱发和维持而参与艾滋病痴呆 (HIV 1associateddementia ,HAD)

HIV-1糖蛋白gp120在昆虫细胞中的表达、纯化、性质鉴定以及免疫原性分析

目的 利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统建立高效分泌表达人类免疫缺陷病毒（HIV）-1 Env gp120糖蛋白的方法,并对其理化性质及免疫原特性进行分析.方法 选择B亚型HIV-1 NL4-3 gp120进行蛋白克隆设计,将目的蛋白基因序列克隆到杆状病毒转移载体pAcgp67B中pH启动子的下游,构建成重组转移载体pAc-gp120,利用同源重组的方式在宿主细胞内获得重组杆状病毒,并在High FiveTM昆虫细胞中表达gp120蛋白.之后使用酶联免疫吸附试验、分析超离和分子排阻色谱进行理化性质分析,并通过小鼠免疫实验分析其免疫原性.结果 建立昆虫细胞表达系统制备和纯化重组HIV-1 gp120蛋白的方法,最终获得纯度约90％的gp120蛋白,多批次纯化后鉴定产量约为13 mg/L;酶联免疫吸附测定、分析超离和分子排阻色谱性质分析试验显示,重组HIV gp120蛋白在溶液有良好的抗原性并且在溶液中较为均一;通过弗氏佐剂与目的蛋白混合免疫BALB/c小鼠,免疫血清对NL4-3病毒具有一定程度中和活性,表明gp120蛋白能有效刺激机体产生免疫应答.结论成功建立了简便、可放大的HIV gp120蛋白表达和纯化方法,获得较为均一的、免疫原性良好的gp120抗原,为进一步开展HIV疫苗研究工作奠定了基础.

HIV-1侵入靶细胞的机理

基于最近在HIV-1感染机理方面的研究进展,提出了一个解释HIV侵入靶细胞的机理的模型以及论述了潜在受体与病毒侵入机理的可能关系。对HIV-1跨膜蛋白gp41晶体结构和对HIV-1受体、辅助受体和潜在受体的功能的了解定会促进研制有效的HIV疫苗和抗HIV药物。