艾滋病相关痴呆机制研究:鼠海马脑片CA1区突触传递及可塑性与HIV-1包膜糖蛋白gp120的关系(英文)

背景:目前对艾滋病相关性痴呆(HIV-1associateddementia,HAD)仍没有特效的治疗药物,主要因为对HIV-1感染引起的神经损伤和坏死的机制,仍没有完全阐明。目的:探讨人类免疫缺陷病毒I型(humanimmunodeficiencyvirusItype,HIV-1)包膜糖蛋白gp120对鼠海马脑片CA1区的突触传递及可塑性的影响,以期阐明HAD的形成机制。设计:配对设计。单位:暨南大学医学院的病理生理教研室。材料:实验于2003-01/10在暨南大学医学院病理生理教研室犤国家中医药管理局三级重点实验室(登记号:TCM-03-131)犦完成。实验用2～5周龄雄性SD大鼠。干预:应用离体脑片灌流及记录技术。主要观察指标:记录大鼠海马CA1区的兴奋性突触后电位(excitatorypostsynapticpotential,EPSP),研究了gp120对高频电刺激Schaffer侧支引起的鼠长时程增强效应(long-termpotentiation,LTP)的影响。结果:发现gp120对大鼠海马CA1区LTP产生抑制作用犤LTP的平均幅度由正常的(216.1±14.0)%降到(90.8±6.0)%,n=12,P<0.01犦,对其基础EPSP没有影响。PKA/PKC蛋白激酶抑制剂H7可以反转这种抑制效应犤LTP的平均幅度为(198.8±16.2)%,n=8,P<0.01犦。结论:gp120可能是通过抑制海马CA1区的LTP而参与HAD的形成。

HIV-1 CRF01_AE毒株gp41蛋白生物信息学预测

目的:对HIV-1 gp41蛋白的膜外区和跨膜区进行预测,并分析该蛋白的结构和功能。方法:从NCBI GenBank数据库获取gp41基因及其蛋白编码序列,利用ExPASy ProtParam tool、ProtScale、SignalP 4.0 Server、TMHMM Server v.2.0、SWISSMODEL、PredictProtein等工具对gp41蛋白的生物学特性进行预测。结果:HIV-1 gp41基因ORF长度为666 bp,编码222个氨基酸,蛋白分子式为C1164H1815N317O325S6,等电点(isoelectric point,pI)=8.60,属于稳定、疏水性蛋白。该蛋白具有跨膜区,信号肽切割位点位于第20和21位氨基酸处。其二级结构由无规则卷曲、β折叠和α螺旋组成,属于全螺旋型蛋白。而且该蛋白具有N-端信号肽,能引导蛋白分泌到胞外。此外gp41蛋白具有4个蛋白质-蛋白质和1个蛋白质-核酸结合位点,这些位点能调控gp41蛋白的多种生物学功能。结论:对gp41蛋白的结构和功能进行了预测,为深入研究其参与疾病发生发展的分子机制奠定了基础。

基于中国HIV-1 CRF01_AE重组亚型gp41 NHR结构域亚单位疫苗的研究

目的:构建基于中国HIV-1 CRF01_AE重组亚型包膜糖蛋白gp41 NHR结构域N51的亚单位疫苗,并进行免疫原性研究。方法:设计4条引物,运用重叠延伸PCR方法扩增出N51Fd基因,将其插入真核表达载体pFUSE-hIgG1-Fc2,构建重组质粒pFUSE/N51Fd并进行序列测定。Western blot法检测N51FdFc-AE重组蛋白的表达。用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠后,ELISA法检测小鼠的抗体反应。结果:成功构建了pFUSE/N51Fd重组质粒,N51FdFc-AE重组蛋白在真核体系获得了高效表达,Western blot结果显示在相对分子质量(Mr)35 000处有目的蛋白条带。小鼠抗血清能特异性识别源于gp41 NHR的抗原,效价高达1∶102 400,平均效价为1∶51 200。结论:改造后的亚单位疫苗能有效激活机体的免疫响应,可用于HIV候选疫苗的研发。

HIV-1 SF_2株env基因(gp41)的克隆构建及其原核表达

目的 克隆并在大肠杆菌中表达HIVgp4 1。 方法 应用PCR技术 ,纯化HIV 1SF2 株外膜蛋白env基因 (gp4 1) ,并重组入原核高效表达载体 pBV2 2 0 ,在大肠杆菌HB10 1中进行表达。 结果 SDS PAGE电泳结果表明 ,在 4 4 0 0 0处有一条蛋白表达带。Westernblot证明 ,4 4 0 0 0蛋白带可与HIV 1阳性血清发生特异性反应。结论 该重组表达 gp4 1的融合蛋白 ,可为HIV 1gp4 1。

抗HIV-1 gp41单克隆抗体的制备及意义

目的为HIV-1感染的检测和研究提供依据。方法以基因工程重组抗原HIV-1 gp41蛋白免疫BALB/c小鼠,利用常规杂交瘤技术和间接ELISA法制备抗gp41蛋白的单克隆抗体(mAb),用ELISA法鉴定所得mAb的Ig亚类、效价及特异性。单抗经饱和硫酸铵(SAS)纯化和HRP标记后,利用双抗体夹心ELISA筛选检测gp41蛋白的最佳配伍单抗,分别包被ELISA板及作为酶标mAb,建立双mAb夹心ELISA法。结果经细胞融合、筛选、克隆化,获得了12株可分泌高效价mAb的杂交瘤细胞。纯化的腹水mAb经配对试验,选出2株mAb:7D4和9G2-HRP建立了双mAb夹心ELISA法,检测HIV-1 gp41抗原的灵敏度是1μg/L。结论获得12株效价高的抗HIV-1 gp41的mAb,建立了特异性强、灵敏度较高的检测HIV-1 gp41抗原的双抗体夹心ELISA法。

HIV-1 GP41第二优势表位簇在大肠杆菌中的高效表达

①目的 构建HIV 1SF2株跨膜蛋白GP4 1第二优势表位簇基因的原核高效表达克隆 ,探讨提高原核表达的途径。②方法 根据密码子的兼并性 ,利用PCR 定点突变技术扩增、改造目的基因片段 ,将其与原核表达载体 pGEX4T 2经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切、连接 ,重组质粒pGEX4T 2 /SE转化表达宿主菌DH5α,经IPTG诱导表达出目的融合蛋白 ,经SDS PAGE与Western Blot鉴定。③结果 获得了高效表达HIV 1GP4 1第二优势表位谷胱甘肽S 转移酶融合蛋白的重组菌 ;Western Blot鉴定表明 ,重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。④结论在原核表达体系中可以高效表达HIV 1GP4

HIV-1流行株去糖基化修饰gp41突变体的构建及其表达和纯化

目的:构建HIV-1ⅢB标准株、中国大陆地区主要流行株CRF-BC和海南省流行株CRF-AE野生型和突变型gp41表达载体,获得gp41重组蛋白。方法:利用基因定点突变的方法,将HIV-1ⅢB、CRF-BC和CRF-AE流行株野生型gp41基因中特定的N611Q糖基化位点天冬酰胺Asn突变为谷氨酰胺Gln,使该位点去糖基化。利用基因工程技术构建野生型pc DNA3. 1-gp41和突变型pc DNA3. 1-Mgp41表达载体。取测序正确的重组质粒转染293 T细胞,重组蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后采用免疫杂交方法进行分析。结果:测序结果显示野生型gp41的N611糖基化位点均由天冬酰胺(Asn)的编码基因(AAU)突变为谷氨酰胺(Gln)的编码基因(GAA),成功构建了野生型和突变型gp41表达载体。琼脂糖凝胶电泳分析显示野生型和突变型HIV-1 gp41基因大小约为700 bp,Western blot免疫杂交结果显示在26 k D处出现目的条带,与预期一致。结论:成功构建了HIV-1流行株去糖基化修饰gp41突变体,为研究去糖基化修饰gp41蛋白与疾病发生发展的分子机制奠定基础。

HIV包膜蛋白的结构及其相应的病毒进入抑制剂

HIV-1病毒包膜蛋白gp120和gp41在病毒感染中起着重要的作用。在病毒进入细胞的过程中,gp120先和CD4分子结合,发生构象改变,进而导致gp41构象的变化,使病毒包膜和细胞膜融合而感染细胞。与gp120或者gp41相结合的多肽、大分子和小分子化合物,都可能影响HIV-1病毒包膜和靶细胞膜结合的过程,从而起到抗HIV-1病毒的作用。该文对gp120和gp41的结构及其相互作用,以及以HIV-1包膜糖蛋白为靶点的病毒进入抑制剂类抗艾滋病药物进行综述。

Ⅰ型人类免疫缺陷病毒包膜糖蛋白修饰体表达载体的构建及鉴定

目的构建V3环完全或部分缺失的I型人类免疫缺陷病毒(hauman immunodeficiency virus type I,HIV-1)ADA株包膜糖蛋白表达体系。方法分别设计包膜糖蛋白两端及V3环删除区域两端的引物,采用重叠延伸剪接法进行HIV-1 ADA株包膜糖蛋白V3环修饰体的构建。得到的PCR产物经EcoR I和Xho I双酶切,将酶切产物与pSM载体连接,转化大肠埃希菌后筛选阳性克隆,经PCR及基因序列测定进行鉴定。结果获得HIV-1 ADA株包膜糖蛋白V3环修饰体PCR产物,构建了其表达载体pSM-ADA△V3和pSM- ADAmV3,经转化和筛选获得了重组质粒,经PCR及基因测序鉴定显示重组质粒序列正确,为预期目的片段。结论成功构建了V3环修饰的HIV-1 ADA株包膜糖蛋白的表达载体。此结果为进一步构建伪病毒,观察V3环完全或部分缺失对病毒侵入靶细胞过程的影响,为开发阻止HIV-1进入靶细胞的药物或疫苗打下基础。

抗HIV-1 gp120单克隆抗体体外阻断CD4细胞HIV感染的研究

目的:抗HIV-1gp120单克隆抗体对细胞感染HIV的拮抗作用研究。方法:制备抗HIV-1gp120单克隆抗体,鉴定其特性;研究抗HIV-1gp120单克隆抗体对细胞感染HIV的拮抗作用。结果:构建的重组质粒的外源基因片段经测序与预期HIV-1gp120抗原基因片段大小一致;高浓度时该单克隆抗体能够抑制HIV病毒的感染,随着抗体浓度的降低,中和实验的抑制率也随之下降;高浓度时该单克隆抗体能够显著抑制病毒的感染,随着抗体浓度的降低,HIVgp120RNA定量增高。结论:获得6株稳定分泌抗HIV-1gp120单克隆抗体的杂交瘤细胞株,该抗HIV-1gp120单克隆抗体具有一定的抗HIV作用。

来源于HIV-1 gp120 V3区的多肽诱导PC12细胞凋亡的初步研究

目的研究HIV-1 gp120 V3区多肽诱导神经细胞凋亡中的机制。方法体外培养大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞),采用Annexin V联合细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(PI)法结合流式细胞术检测细胞的凋亡;获得细胞凋亡模型后,采用Western blotting研究不同浓度(0、100、200、400、800 nmol/L)来源于gp120的多肽处理细胞以及400 nmol/L多肽在不同时间(0、4、12、24、36、48 h)对PC12细胞PLK-1表达的影响。结果 HIV-1 gp120 V3区多肽诱导PC12细胞凋亡后,Polo样激酶1的表达降低,并呈现浓度-时间依赖性。结论 HIV-1 gp120 V3区多肽诱导PC12细胞凋亡与PLK-1有关。

上海设施核磁系统用户在HIV-1病毒包膜刺突蛋白质的跨膜区结构研究取得进展

2016年6月24日，Science在线发表了中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所国家蛋白质科学中心（上海）周界文研究组与哈佛医学院BingChen博士研究团队的合作研究论文“StructuralBasisforMembraneAnchoringofHIV-1EnvelopeSpike”。

HIV-1 p24和gp41融合基因表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化

目的用基因重组技术将HIV-1 p24基因以及gp41基因具有抗原线性中和表位的部分重组连接,构建重组质粒,并在大肠埃希菌中高效表达融合蛋白。方法设计带有酶切位点的引物,分别PCR扩增p24和gp41两个基因,将它们分别连接到pMD18-T载体中,测序验证后,挑选出含有目的基因的正确克隆。将p24片段酶切后连接到gp41基因所在的pMD18-T载体中,再将连接后的两个基因酶切,重新连接到pET21a表达载体中。将表达载体转染大肠埃希菌诱导表达,经Western-blot验证表达正确。结果融合蛋白p24-gp41在大肠埃希菌中高效表达。结论融合蛋白p24-gp41可以在pET21a表达载体中高效表达。

人类免疫缺陷病毒1型gp140包膜蛋白三聚体在哺乳动物细胞中的高效表达及其性质鉴定

本研究目的是通过优化1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)gp140编码基因的密码子和克隆设计,从而实现在293T哺乳动物细胞中高效表达,并对纯化获得的gp140蛋白进行抗原性质鉴定。在本研究中选择HIV-1B亚型NL4-3全基因序列为模板进行gp140克隆构建,通过密码子优化、信号肽替换、增加柔性linker、三聚体折叠序列等方法优化设计。通过HIV-1转录反式激活因子tat共转HEK293T细胞进行gp140蛋白表达,采用镍柱纯化。SDS-PAGE、Western blot、ELISA、负染电镜等结果显示目的蛋白纯度高于70%,每升培养基可获得0.5mg gp140蛋白,并且具有良好的抗原活性,电镜下呈现三聚体结构。通过弗氏佐剂与目的蛋白混合免疫Balb/c小鼠,检测小鼠免疫血清显示gp140蛋白能有效刺激机体产生免疫应答。本研究通过优化表达获得B亚型HIV-1NL4-3gp140蛋白,为HIV-1病毒包膜蛋白结构和重组疫苗研究奠定基础。

HIV-1gp41 NHR序列靶点专一性的荧光共振能转移测定

目的确定并利用荧光共振能转移法(FRET)对以HIV-1 gp41 N端七联重复序列(NHR)为靶点的融合抑制剂进行筛选和作用机制研究。方法 FRET采用金属络合物多肽技术设计针对不同结合位点、结合强度可调、涵盖全部NHR序列的靶点和探针,对HIV融合抑制剂进行高通量筛选。由于HIV在进行膜融合时其gp41的N端NHR和C端CHR可形成稳定的六螺旋结构,因此,利用圆二色谱仪对FRET所使用的靶点/探针对的结合强度进行验证,确定对应的靶点/探针对可形成稳定的六螺旋结构;同时,借助细胞活性测试测定抑制剂的活性,验证FRET是否可用于筛选以HIV-1 gp41 NHR为靶点的抑制剂。结果与结论 FRET中使用的靶点/探针均可形成螺旋度较高的六螺旋结构,其中Fe(Env2.0)3/CP2及Fe(Env5.0)3/CP5形成的α螺旋度分别高达89.6%和84.7%。FRET所使用的靶点/探针对专一性强、结合作用强,可用于进行HIV-1融合抑制剂的筛选和机制研究。

HIV-1 gp41蛋白的主要特性及B/T细胞表位预测

目的采用生物信息学方法分析HIV-1 gp41跨膜糖蛋白的基因序列及其编码蛋白的结构特征,并预测可能的B/T细胞表位,为艾滋病疫苗及多肽药物开发提供理论依据。方法从NCBI GenBank数据库获取gp41基因及其编码蛋白序列,综合运用ExPASy ProtParam tool、SOPMA、TMpred、Motifscan、ABCpred、Bepipred、CTLPred和IEDB等在线软件分别预测其低级结构、跨膜区、翻译后修饰位点、B/T细胞表位。结果 HIV-1 gp41基因ORF长度为666 bp,编码222个氨基酸。该gp41蛋白共3 627个原子,相对分子质量为25.642 5×10~3,分子式为C_(1164)H_(1815)N_(317)O_(325)S_6。理论等电点为8.60,是稳定的疏水性蛋白。gp41蛋白具有无规则卷曲55个,占24.77%;13个翻译后修饰位点,存在N-糖基化、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化、N-酰胺化、蛋白激酶C磷酸化等修饰。gp41蛋白N-末端存在跨膜螺旋区,分别位于第2-20,80-97和171-192位氨基酸处,这3个螺旋区的总评分为4 614。预测gp41蛋白含有23个B细胞抗原表位,优势表位依次是87-102、93-108、113-128、78-93、151-166等;含有NKTYKEIWD、VERYLRDQR和EPDRPERIE 3个优势CTL细胞表位,分别位于第103-111、70-78、213-221位氨基酸处。结论预测gp41蛋白的B/T细胞表位进行预测,可为艾滋病疫苗及多肽药物的开发提供了理论依据。

深圳地区艾滋病患者HIV-1毒株膜蛋白V3环的氨基酸变异分析

目的了解深圳地区艾滋病患者体内不同HIV-1亚型膜蛋白V3环的氨基酸序列特征及变异特点。方法采用逆转录套式聚合酶链反应(RT-nested-PCR)对艾滋病患者血浆HIV RNA进行扩增,对扩增产物直接测序并进行序列对比、翻译和分析。结果深圳地区艾滋病患者感染HIV病毒分属B与CRF01-AE亚型,病毒V3顶端的四肽特征主要为:GPGQ 48%、GPGR 36%、其他形式16%;其中AE亚型GPGQ百分比为76.9%,B亚型GPGR百分比为75%;还发现DQDR、DQGQ等少见V3环顶端四肽组成形式。V3环发生与SI表型有关的氨基酸突变形式高达80%。结论深圳地区艾滋病患者感染病毒V3环顶端四肽主要为GPGQ与GPGR,V3环序列高度变异,出现一些少见的V3环顶端四肽组成形式值得进一步研究。

HIV-1CN54膜抗原Gp145去糖基化修饰对其免疫效果的影响

目的构建表达Ⅰ型艾滋病病毒(human immunodeficiency virus-1type,HIV-1)CN54膜蛋白Gp145去糖基化突变体的DNA疫苗和重组痘病毒疫苗,并对其进行抗原改造和免疫原性测试。方法采用分子生物学方法构建了表达HIV-1CN54膜蛋白Gp145或其突变体(Gp145dG,去除了V1/V2区的6个糖基化位点)的DNA疫苗(SV145、SV145dG)和重组痘病毒疫苗(rTTV145、rTTV145dG)。运用DNA初免-重组痘病毒疫苗加强的方式接种雌性BALB/c小鼠,免疫结束后,分别采用IFN-γ酶联免疫斑点技术(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)和酶联免疫吸附测定技术(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)对Gp145特异性细胞免疫反应和抗体反应进行检测。结果 SV145初免-rTTV145加强所活化的特异性T细胞反应强度为(1 949±1 307)斑点形成细胞数(spotforming cells,SFCs)/106个脾淋巴细胞,对数抗体滴度为(4.020±0.346);SV145dG初免-rTTV145dG加强所活化的特异性T细胞反应强度为(1 192±540)SFCs/106个脾淋巴细胞,对数抗体滴度为(3.300±0.298)。结论表达HIV-1CN54膜蛋白Gp145的DNA疫苗和重组痘病毒疫苗具有良好的免疫原性,去除V1/V2区的糖基化位点无助于提高其免疫原性。

酸性天然凝胶电泳法研究HIV进入抑制剂ADS-J1的作用机制

目的ADS-J1是通过虚拟筛选从20000个化合物中获得的靶向HIVgp41的小分子HIV进入抑制剂。该研究探讨ADS-J1与gp41的结合位点和作用机制。方法采用酸性天然聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(AN-PAGE),研究ADS-J1与衍生于gp41不同功能区的多肽的结合。结果此前采用的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(N-PAGE)等方法,由于不能显示衍生于gp41的N-端多肽,未能确定ADS-J1的作用位点。该研究建立的AN-PAGE技术,能直接显示N-端多肽的条带,证实ADS-J1能与gp41的N-端螺旋重复序列(NHR)复合螺旋核中的深穴结合,从而抑制gp41六螺旋束结构的形成,而且深穴中第574位的赖氨酸残基(K574)与ADS-J1的抑制作用密切相关。结论ADS-J1通过与gp41 NHR靶穴中的K574结合,抑制gp41六螺旋束结构的形成,从而抑制HIV进入靶细胞。此外,该研究建立的AN-PAGE技术,为研究靶向Ⅰ型包膜病毒的病毒进入抑制剂的作用机制提供了一个简便有效的实验方法。

新型HIV-1 gp41融合抑制剂CP32M的构效关系研究

目的研究新型融合多肽CP32M中VEWNEMT序列的长短、残基的极性及其他部位残基的极性对其抑制gp41融合活性的影响。方法在多肽CP32M的基础上,通过对前7个氨基酸序列进行截取、部分替换、全部替换及改变其他位置氨基酸残基的极性设计合成系列多肽,测定多肽抑制HIV-1融合活性。应用圆二色谱、分子排阻色谱测定多肽与N36的结合功能。结果截取、替换氨基酸后的肽抑制gp41融合的活性都不同程度降低,与N36结合形成六束螺旋的能力减弱。在CP32M中部及C端i与i+4位置引入Lys增加Glu-Lys离子对作用后,肽活性降低。用C34的C端氨基酸序列NEKDLLE及可与gp120结合的序列RINNIPWSEAM置换QIWNNMT后,多肽仍有很高活性。结论片段VEWNEMT是关键片段,其中VE及MT是关键功能氨基酸。其他片段替代该片段后仍有较强活性,也与N36形成螺旋结构,提示该片段含有共性结合区。