目的：利用AdEasy腺病毒载体系统构建含HIV-1病毒蛋白R（viral protein R，Vpr）基因的重组腺病毒，使之有效感染靶细胞前列腺癌细胞系PC-3，并在其中表达Vpr。方法：自表达载体pCI—neo—Vpr中扩增出Vpr基因，插入到pAdTrack—CMV中构...目的：利用AdEasy腺病毒载体系统构建含HIV-1病毒蛋白R（viral protein R，Vpr）基因的重组腺病毒，使之有效感染靶细胞前列腺癌细胞系PC-3，并在其中表达Vpr。方法：自表达载体pCI—neo—Vpr中扩增出Vpr基因，插入到pAdTrack—CMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdTrack—Vpr，经限制性内切酶Pme I酶切线性化后，利用磷酸钙介导法将其与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转化到BJ5183大肠埃希菌。挑选同源重组质粒，经Pac I酶切后回收大片段，并将其转染包装细胞AD293。利用荧光显微镜观察AD293细胞中绿色荧光蛋白（GFP）表达。收集第一代重组病毒上清，使之感染AD293细胞得到第二代病毒，如此反复感染AD293细胞3—4轮，使病毒大量扩增。梯度稀释法测定病毒滴度后，分别以感染复数（MOI）为1、5、10的病毒量感染靶细胞PC-3，荧光显微镜观察细胞中GFP表达，并利用RT＋PCR和蛋白质印迹技术分别从mRNA和蛋白水平检测目的基因的转录与表达情况。结果：经限制性内切酶检测、GFP表达和病毒上清液PCR证实成功构建了携带Vpr基因的重组腺病毒，滴度为3．0×10^8efu／ml。以MOI为5的重组腺病毒感染24h后，80％以上的靶细胞能够表达GFP，RT—PCR和蛋白质印迹能够同时检测到目的基因Vpr的转录与表达。结论：成功构建含Vpr基因重组腺病毒，并且病毒能够有效感染PC-3细胞，使得目的基因在其中获得大量表达，为进一步研究Vpr蛋白对PC-3肿瘤细胞的影响及其可能涉及的信号通路奠定了基础。展开更多
目的分析人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染者CD8+T细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)、CD38、人白细胞抗原DR(HLA-DR)及KI-67抗原(ki67)的表达水平,探讨HIV-1感染过程中CD8^+T细胞PD-1表达水平与免疫活化和免疫耗竭的关系及意义。方法收集HIV-1...目的分析人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染者CD8+T细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)、CD38、人白细胞抗原DR(HLA-DR)及KI-67抗原(ki67)的表达水平,探讨HIV-1感染过程中CD8^+T细胞PD-1表达水平与免疫活化和免疫耗竭的关系及意义。方法收集HIV-1感染者87例,健康志愿者22例,密度梯度法分离外周血单个核细胞;采用流式细胞术分析其CD8+T细胞PD-1、CD38、HLA-DR、ki67的表达水平;观察用抗PD-L1 m Ab阻断PD-1/PD-L1通路后CD8^+T细胞分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)的水平变化。结果 HIV-1感染者CD8^+T细胞PD-1表达水平显著高于健康对照组;CD8^+T细胞PD-1水平与病毒载量呈正相关,与CD4^+T细胞数呈负相关;CD8^+T细胞PD-1与CD38、HLA-DR表达呈正相关,与ki67表达无相关性;体外阻断PD-1/PD-L1通路后TNF-α、IFN-γ的表达量增加。结论 HIV-1感染者外周血CD8^+T细胞PD-1表达增加;PD-1过表达与HIV感染过程中CD8^+T细胞功能受抑、免疫耗竭及疾病进程相关;体外阻断PD-1/PD-L1通路可恢复CD8^+T细胞功能。展开更多
文摘目的：利用AdEasy腺病毒载体系统构建含HIV-1病毒蛋白R（viral protein R，Vpr）基因的重组腺病毒，使之有效感染靶细胞前列腺癌细胞系PC-3，并在其中表达Vpr。方法：自表达载体pCI—neo—Vpr中扩增出Vpr基因，插入到pAdTrack—CMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdTrack—Vpr，经限制性内切酶Pme I酶切线性化后，利用磷酸钙介导法将其与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转化到BJ5183大肠埃希菌。挑选同源重组质粒，经Pac I酶切后回收大片段，并将其转染包装细胞AD293。利用荧光显微镜观察AD293细胞中绿色荧光蛋白（GFP）表达。收集第一代重组病毒上清，使之感染AD293细胞得到第二代病毒，如此反复感染AD293细胞3—4轮，使病毒大量扩增。梯度稀释法测定病毒滴度后，分别以感染复数（MOI）为1、5、10的病毒量感染靶细胞PC-3，荧光显微镜观察细胞中GFP表达，并利用RT＋PCR和蛋白质印迹技术分别从mRNA和蛋白水平检测目的基因的转录与表达情况。结果：经限制性内切酶检测、GFP表达和病毒上清液PCR证实成功构建了携带Vpr基因的重组腺病毒，滴度为3．0×10^8efu／ml。以MOI为5的重组腺病毒感染24h后，80％以上的靶细胞能够表达GFP，RT—PCR和蛋白质印迹能够同时检测到目的基因Vpr的转录与表达。结论：成功构建含Vpr基因重组腺病毒，并且病毒能够有效感染PC-3细胞，使得目的基因在其中获得大量表达，为进一步研究Vpr蛋白对PC-3肿瘤细胞的影响及其可能涉及的信号通路奠定了基础。
文摘目的分析人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染者CD8+T细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)、CD38、人白细胞抗原DR(HLA-DR)及KI-67抗原(ki67)的表达水平,探讨HIV-1感染过程中CD8^+T细胞PD-1表达水平与免疫活化和免疫耗竭的关系及意义。方法收集HIV-1感染者87例,健康志愿者22例,密度梯度法分离外周血单个核细胞;采用流式细胞术分析其CD8+T细胞PD-1、CD38、HLA-DR、ki67的表达水平;观察用抗PD-L1 m Ab阻断PD-1/PD-L1通路后CD8^+T细胞分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)、γ干扰素(IFN-γ)的水平变化。结果 HIV-1感染者CD8^+T细胞PD-1表达水平显著高于健康对照组;CD8^+T细胞PD-1水平与病毒载量呈正相关,与CD4^+T细胞数呈负相关;CD8^+T细胞PD-1与CD38、HLA-DR表达呈正相关,与ki67表达无相关性;体外阻断PD-1/PD-L1通路后TNF-α、IFN-γ的表达量增加。结论 HIV-1感染者外周血CD8^+T细胞PD-1表达增加;PD-1过表达与HIV感染过程中CD8^+T细胞功能受抑、免疫耗竭及疾病进程相关;体外阻断PD-1/PD-L1通路可恢复CD8^+T细胞功能。
