目的：利用AdEasy腺病毒载体系统构建含HIV-1病毒蛋白R（viral protein R，Vpr）基因的重组腺病毒，使之有效感染靶细胞前列腺癌细胞系PC-3，并在其中表达Vpr。方法：自表达载体pCI—neo—Vpr中扩增出Vpr基因，插入到pAdTrack—CMV中构...目的：利用AdEasy腺病毒载体系统构建含HIV-1病毒蛋白R（viral protein R，Vpr）基因的重组腺病毒，使之有效感染靶细胞前列腺癌细胞系PC-3，并在其中表达Vpr。方法：自表达载体pCI—neo—Vpr中扩增出Vpr基因，插入到pAdTrack—CMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdTrack—Vpr，经限制性内切酶Pme I酶切线性化后，利用磷酸钙介导法将其与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转化到BJ5183大肠埃希菌。挑选同源重组质粒，经Pac I酶切后回收大片段，并将其转染包装细胞AD293。利用荧光显微镜观察AD293细胞中绿色荧光蛋白（GFP）表达。收集第一代重组病毒上清，使之感染AD293细胞得到第二代病毒，如此反复感染AD293细胞3—4轮，使病毒大量扩增。梯度稀释法测定病毒滴度后，分别以感染复数（MOI）为1、5、10的病毒量感染靶细胞PC-3，荧光显微镜观察细胞中GFP表达，并利用RT＋PCR和蛋白质印迹技术分别从mRNA和蛋白水平检测目的基因的转录与表达情况。结果：经限制性内切酶检测、GFP表达和病毒上清液PCR证实成功构建了携带Vpr基因的重组腺病毒，滴度为3．0×10^8efu／ml。以MOI为5的重组腺病毒感染24h后，80％以上的靶细胞能够表达GFP，RT—PCR和蛋白质印迹能够同时检测到目的基因Vpr的转录与表达。结论：成功构建含Vpr基因重组腺病毒，并且病毒能够有效感染PC-3细胞，使得目的基因在其中获得大量表达，为进一步研究Vpr蛋白对PC-3肿瘤细胞的影响及其可能涉及的信号通路奠定了基础。展开更多
目的筛选出与流感病毒Non-structural protein 1(NS1)蛋白结合的人类宿主蛋白并加以分析,确定这些结合蛋白富集的方向及关键蛋白,为抗流感病毒的新药研发提供思路。方法将NS1样本、Biotin样本分别与HuProt^(TM)人类蛋白质组芯片进行杂...目的筛选出与流感病毒Non-structural protein 1(NS1)蛋白结合的人类宿主蛋白并加以分析,确定这些结合蛋白富集的方向及关键蛋白,为抗流感病毒的新药研发提供思路。方法将NS1样本、Biotin样本分别与HuProt^(TM)人类蛋白质组芯片进行杂交孵育,以两重复均满足Z-Score≥3为筛选条件对与NS1蛋白有结合的宿主蛋白进行筛选得到特异性检出蛋白,实验组(NS1蛋白)与对照组(Biotin)比值I Mean_Ratio≥1.4为条件筛选出显著特异性检出蛋白。用检出的195个蛋白进行GO(Biological Process,Molecular Function,Cellular Component)和KEGG_PATHWAY分析,通过蛋白-蛋白相互作用(PPI)及MCODE分析得到关键蛋白。结果获得显著特异性检出蛋白195个,GO分析结果显示这些蛋白主要参与了mRNA加工、RNA结合、蛋白结合,KEGG分析主要富集到RNA降解、氨基酸的生物合成等通路。得到的4个关键蛋白DDX6、HSPD1、PKLR、MTHFD1中DDX6与RNA的合成、翻译等过程相关,而NS1蛋白可以通过调控流感病毒RNA和宿主RNA促进病毒的感染,推测DDX6可能在该过程发挥作用;其他3个蛋白目前虽然没有明确的研究指明其与流感病毒有关系,但是能在其他RNA病毒的感染过程中发挥作用。结论与NS1结合的人类蛋白主要富集到RNA合成、加工、转录等过程中,MCODE分析得到的关键蛋白有潜力成为抗流感病毒新的靶点,但作用机制需要后续实验进行进一步验证。展开更多
文摘目的：利用AdEasy腺病毒载体系统构建含HIV-1病毒蛋白R（viral protein R，Vpr）基因的重组腺病毒，使之有效感染靶细胞前列腺癌细胞系PC-3，并在其中表达Vpr。方法：自表达载体pCI—neo—Vpr中扩增出Vpr基因，插入到pAdTrack—CMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdTrack—Vpr，经限制性内切酶Pme I酶切线性化后，利用磷酸钙介导法将其与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转化到BJ5183大肠埃希菌。挑选同源重组质粒，经Pac I酶切后回收大片段，并将其转染包装细胞AD293。利用荧光显微镜观察AD293细胞中绿色荧光蛋白（GFP）表达。收集第一代重组病毒上清，使之感染AD293细胞得到第二代病毒，如此反复感染AD293细胞3—4轮，使病毒大量扩增。梯度稀释法测定病毒滴度后，分别以感染复数（MOI）为1、5、10的病毒量感染靶细胞PC-3，荧光显微镜观察细胞中GFP表达，并利用RT＋PCR和蛋白质印迹技术分别从mRNA和蛋白水平检测目的基因的转录与表达情况。结果：经限制性内切酶检测、GFP表达和病毒上清液PCR证实成功构建了携带Vpr基因的重组腺病毒，滴度为3．0×10^8efu／ml。以MOI为5的重组腺病毒感染24h后，80％以上的靶细胞能够表达GFP，RT—PCR和蛋白质印迹能够同时检测到目的基因Vpr的转录与表达。结论：成功构建含Vpr基因重组腺病毒，并且病毒能够有效感染PC-3细胞，使得目的基因在其中获得大量表达，为进一步研究Vpr蛋白对PC-3肿瘤细胞的影响及其可能涉及的信号通路奠定了基础。
