HIV-1型衣壳蛋白P24在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

用聚合酶链式反应 (PCR)从 HIV - 1gag基因序列中扩增出衣壳蛋白 (P2 4)基因 ,插入表达载体p GEX- 4T3中 ,构成重组质粒 p GEX- p2 4,在大肠杆菌 BL 2 1中高效表达出重组 P2 4。经 Glutathione- Sepharose4B亲和层析纯化后 ,重组 P2 4在间接 EL ISA和免疫印迹中表现出很高的抗原特异性和免疫反应性。

抗HIV-1核心抗原p24单克隆抗体的制备及特性的初步鉴定

目的 :建立分泌抗HIV 1p2 4单克隆抗体 (mAb)的杂交瘤细胞株 ,并对其特性进行初步鉴定。方法 :以纯化的基因工程制备的p2 4抗原免疫BALB/c小鼠 ,取免疫小鼠的脾细胞与Sp2 /0骨髓瘤细胞融合 ,经HAT、HT选择培养及有限稀释法进行克隆化后 ,用间接ELISA法及Dotblot对其进行筛选和特性鉴定。结果 :筛选到 2株可分泌抗HIV 1p2 4mAb的杂交瘤细胞 ,其腹水效价为 1×10 -5,亲和力为 1.7× 10 4～ 1.8×10 4mol/L ,mAb的Ig亚类均为IgG1。两株mAb与HBcAg、HCVRNA阳性血清及HIVgp4 1等均无交叉反应 ,只与HIV 1p2 4抗原阳性血清产生特异反应。结论 :成功地建立了 2株可分泌抗HIV 1p2 4mAb的杂交瘤细胞 ,为进一步研制HIV 1p2

HIV-1p24蛋白在大肠肝菌中的高效可溶性表达、一步纯化及抗原性分析

合成引物扩增HIV 1p2 4基因 ,并将其克隆到 pQE 30质粒中 ,使其在大肠杆菌E .coliM 15中以IPTG诱导高效表达 ,经SDS PAGE分析 ,该表达产物约占菌体总蛋白 2 0 % ,并且以可溶蛋白的形式存在于细菌裂解液上清之中。经镍离子柱亲和层析一步纯化 ,洗脱产物中 p2 4蛋白纯度达95 %。ELISA分析表明 ,该蛋白可与HIV感染者血清发生特异性免疫反应。以此蛋白交联Sepharose 4B ,亲和层析纯化HIV感染者血清中的抗体 ,用所得抗体与HIV确认试剂反应 ,发现该纯化抗体仅与确认试剂中的 p2 4蛋白反应。上述结果表明在大肠杆菌中已经高效表达了可溶性HIV 1p2 4蛋白 。

HIV-1Gagp24蛋白的纯化及复性

为制备高纯度p24 抗原,在变性条件下,将大肠杆菌表达的重组p24 蛋白,使用Ni-NTA 亲和层析法进行了纯化。对包涵体中的p24 蛋白进行层析纯化时,回收率略有提高,但蛋白纯度(81% )低于菌体裂解纯化洗脱物(94% )。菌体中及纯化、复性后的目的蛋白均能与抗HIV-1 p24 单克隆抗体发生特异性反应。用纯化的p24 蛋白免疫小鼠,4 周时小鼠血清抗p24 平均抗体效价达1∶400。试验结果表明,大肠杆菌表达的HIV-1 p24 全菌体裂解物纯化后,可用作HIV-1 检测试剂的原料。

HIV-1 P24截短体与gp41截短体的融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定

用基因重组技术将截短的HIV 1p2 4基因和gp41基因连接成嵌合基因 ,插入质粒 pGEX 4T3,构建成重组表达质粒pGEX F。将 pGEX F转化大肠杆菌BL2 1。经IPTG诱导表达 ,pGEX F在大肠杆菌BL2 1中获得了高效表达。融合蛋白P2 4 gp41经Glutathione Sepharose4B亲和层析纯化后 ,用间接ELISA和免疫印迹检测HIV抗体阳性血清和正常人血清 ,P2 4 gp41只与HIV抗体阳性血清反应 ,证明获得的融合蛋白P2 4 gp41有很强的抗原特异性和免疫反应性 。

HIV-1核心抗原p24基因的表达、纯化及抗原性分析

目的在原核系统中表达全长HIV-1 p24抗原,并对其抗原性进行鉴定。方法利用PCR技术从HIV-1全基因质粒(BH-10)中扩增p24抗原基因,通过酶切消化后连接到表达载体pET22b上,用此连接产物转化大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导,表达p24抗原。运用双酶切技术、SDS-PAGE电泳检测插入基因片段的正确性,并用W estern B lot(WB)及ELISA法对表达产物的抗原性进行检测。结果PCR产物和构建的重组质粒pET22b-p24经双酶切插入的外源基因片段均为690 bp,与预期p24抗原全基因片段大小一致。纯化蛋白SDS-PAGE电泳,可见1条相对分子量约26×103的外源表达蛋白带,与预期大小一致,未见杂蛋白带。WB结果显示重组蛋白与HIV-1阳性血清呈特异性反应,与健康人血清没有反应。ELISA检测p24抗原灵敏度为93.94%(62/66),特异性为93.33%(28/30)。结论构建了HIV-1 p24表达载体pET22b-p24,并在原核细胞中高效表达,其表达产物具有良好的抗原性,为研制HIV抗体确认试剂奠定了良好的基础。

铁蛋白笼形纳米颗粒应用于HIV-1 P24抗原高灵敏检测的研究

目的构建以铁蛋白笼形纳米颗粒为基础的分子展示平台,并应用于HIV-1 P24抗原检测,实现低丰度、高灵敏检测。方法采用分子生物学手段,构建生物素耦联的铁蛋白笼形纳米颗粒,基于链霉亲和素与生物素特异性结合,将其应用于HIV-1 P24抗原的酶联免疫吸附测定(ELISA)检测中,并测试其检测灵敏度。结果构建出具有链霉亲和素特异性结合能力的生物素化铁蛋白笼形纳米颗粒,应用到HIV-1的P24抗原ELISA检测中,实现0.1 ng/mL的检测下限,显著提高检测灵敏度。结论成功建立基于铁蛋白笼形纳米结构的分子展示平台,以HIV-1 P24抗原ELISA检测为例,该平台能够应用于低丰度、高灵敏检测。

HIV-1型核衣壳蛋白P24截短体在大肠杆菌中的表达,纯化和鉴定

用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）从ＨＩＶ１ｇａｇ基因中扩增出衣壳蛋白Ｐ２４截短体（ｔＰ２４）基因，插入质粒ｐＧＥＸ４Ｔ３中构成重组表达质粒ｐＧＥＸｔｐ２４，将ｐＧＥＸｔｐ２４转化大肠杆菌ＢＬ２１后获得了高效表达，表达量占菌体总蛋白量的３４３８％。经Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析纯化的截短体Ｐ２４纯度为９２７７％。纯化的截短体Ｐ２４在间接ＥＬＩＳＡ和免疫印迹检测ＨＩＶ抗体阳性血清和正常人血清中，具有很高的抗原特异性和免疫反应性。

HIV-1 CN54 Gag P55和P24蛋白的高效表达、纯化和鉴定

目的 探讨HIV 1中国株CN5 4GagP5 5和P2 4重组蛋白的高效表达并纯化 ,为研究HIV疫苗和诊断试剂创造条件。方法 分别将CN5 4GagP5 5和P2 4基因克隆至 pBV2 2 0和 pThioHisC载体 ,构建非融合表达载体 ;将重组质粒转化大肠杆菌BL2 1codonplus RIL ,对工程菌进行诱导表达。Western Blot检测目的蛋白 ,用DEAE SeparoseFF阴离子交换层析柱纯化目的蛋白 ;纯化的P5 5和P2 4抗原蛋白分别包被酶标板作ELISA检测。结果 P5 5以包涵体的形式表达 ,表达量占菌体总蛋白的 30 % ,P2 4实现了可溶性表达 ,表达量占总菌体总蛋白的4 0 % ;纯化后P5 5纯度达到 80 % ,P2 4纯度超过 90 %。Western Blot和ELISA检测均显示了良好的的灵敏度和特异性。结论 HIV 1CN5 4GagP5 5和P2 4抗原蛋白可在大肠杆菌中高效表达 ,纯化的抗原蛋白具有良好抗原性 。

HIV-1 p24抗原检测的应用研究

目的 :用抗HIV 1p2 4单克隆抗体和多克隆抗体构建的间接ELISA试剂 ,检测HIV 1抗体阳性及其它样品 ,探讨应用的可行性。方法 :采用单克隆抗体固相、兔抗HIV 1p2 4抗体夹心 ,羊抗兔HRP结合物的间接ELISA法。结果 :显示试剂盒HIV 1p2 4抗原检出灵敏度为 5 0pg/ml(基因工程抗原 ) ;特异性 99 46 % ;HIV抗体阳性血样阳性率 3 2 % ;抗体阴性的特殊人群血样阳性率 3 9% ;抗体不确定血样阳性率为 15 4% ,明显高于抗体阳性和阴性组血样。病毒培养 1d ,抗原效价 1∶80 ,第 3天可达1∶5 12 0。结论 :该间接夹心HIV 1p2 4抗原检测试剂灵敏度高、特异性好 ,可应用于HIV感染的辅助检测及病毒的基础研究。

抗HIV-1 p24单克隆抗体的制备、特性鉴定及初步应用

目的:制备抗HIV1p24单克隆抗体(mAb)及特性鉴定。方法:采用细胞融合技术制备可稳定分泌抗HIV1p24mAb的杂交瘤细胞。选择高效价、识别不同抗原表位的mAb纯化后,分别包被ELISA板及作为酶标记mAb,建立双mAb夹心ELISA法,检测400份正常人血浆,20份抗HIV抗体阳性(p24抗原阴性)的血浆,20份HIV1感染的细胞培养上清及HIV1p24抗原国家参考品,并同时用进口p24抗原检测试剂盒进行对比检测。结果:经细胞融合、筛选、克隆化,共获得10株可分泌高效价mAb的杂交瘤细胞。纯化的腹水mAb经配对试验,选A值≥2.50的2株mAb建立的双mAb夹心ELISA法,敏感性可达2.5ng/L,且与进口试剂盒检测结果的一致性良好。结论:建立了具有高度敏感性和特异性的双mAb夹心ELISA法,为研制可用于检测HIV1p24抗原的试剂盒奠定了基础。

金磁微粒为载体的免疫PCR检测HIV-1 p24

目的建立以金磁微粒为载体的免疫PCR HIV-1 p24检测体系。方法以金磁微粒作为免疫PCR的载体并通过载体的特异性和非特异性反应验证其可行性;以小鼠抗HIV-1 p24单克隆抗体作为捕获抗体包被金磁微粒,生物素化的羊抗p24多克隆抗体作为检测抗体;报告DNA用生物素标记的引物通过PCR扩增预先制备,并通过链亲和素的桥联标记生物素化的多抗,被两抗体夹心捕获的人重组HIV-1 p24抗原通过PCR扩增报告DNA的方式予以检测;并对检测的灵敏度和线性检测范围进行分析。结果金磁微粒上偶联抗体的效率可〉95%,偶联抗体的一致性较好,几乎不产生非特异性吸附,分离与洗涤步骤更简便更彻底;免疫PCR检测p24的灵敏度为0.1ng/L,比ELISA法检测的灵敏度高1.5×10^4倍,线性检测范围为p24浓度在0.1～100ng/L。结论金磁微粒是较理想的免疫PCR反应载体,金磁微粒为载体的免疫PCR检测HIV-1 p24是一种可兹应用的高灵敏度的检测方法。

HIV-1P24抗原国家参考品的研制

收集正常人、HIV感染者和疑似感染者血浆以及HIV-1病毒培养裂解液,对其进行HIV抗体、HIVP24抗原、HCV抗体和HBsAg检测,对HIVP24抗原阳性者进行HIVRNA检测,并对部分样品进行基因分型。以NIBSCP24抗原标准品的系列稀释样品作为线性灵敏度参考品。经过实验筛选出20份阴性参考品,10份阳性参考品,10份线性灵敏度参考品,2份精密性参考品,共同组成HIV-1P24抗原国家参考品,经多家不同的试剂进行标定,制定了相应的标准。稳定性研究结果表明,反复冻融三次对该参考品的稳定性没有影响。由此,初步建立了HIV-1P24抗原国家参考品,该参考品将对HIV-1P24抗原、HIV抗体/P24抗原联合检测试剂的质量控制提供重要依据。

免疫PCR检测HIV-1 p24的实验研究

目的以HIV-1 p24为检测对象,建立以金磁微粒为固相载体的免疫PCR检测技术。方法以鼠抗HIV-1 p24单克隆抗体作为捕获抗体,包被金磁微粒,以生物素化的羊抗p24多克隆抗体作为检测抗体。报告DNA为甘蓝型油菜肉桂酰辅酶A还原酶基因的一个片段,用生物素标记的引物通过PCR扩增预先制备,通过链亲和素的桥联标记生物素化的多抗,被两抗体夹心捕获的人重组HIV-1 p24抗原通过PCR扩增报告DNA的方式予以检测。并且优化了免疫PCR的检测条件,对检测灵敏度进行了分析。结果为降低非特异性扩增,链亲和素和用于标记的DNA的浓度分别控制在0.1mg/L和10ng/L。免疫PCR检测的灵敏度为0.1ng/L,比ELISA法检测的灵敏度高1.5×104倍。结论金磁微粒为载体的免疫PCR检测HIV-1 p24抗原是一种灵敏度较高的检测方法。

HIV-1gag基因p24编码区的变异性分析

目的 了解我国HIV感染者p2 4蛋白编码区的基因变异情况。 方法 收集我国河南及上海地区 2 8份已经证实的HIV - 1感染患者的血浆标本并抽提出RNA ;采用逆转录和Nested PCR的方法扩增所需的目的基因 ,使用DNA测序仪直接测序 ;应用CLUSTALW、PHYLIP等软件包对序列进行比对及进化树分析。结果 2 8份gag样本中 2 5份为B亚型 ,3份为A亚型。与共享序列相比 ,2 5例B亚型的 p2 4编码区中发生核苷酸改变的位点比例为 0 .4 %～ 4 .8% ,平均为 1.4 % ,其中A→G占 2 0 .5 % ,G→A占 17.3% ;3例A亚型发生核苷酸改变的位点比例平均为 0 .2 4 %。在所有变异位点中均未发现G→A的高度突变。B亚型和A亚型内的基因离散率平均为 2 .9%和 0 .5 8% ,A亚型与B亚型之间的基因离散率平均为 11.1%。 2 5例B亚型根据基因序列所推测的p2 4蛋白发生氨基酸改变的比例为 0 .4 %～ 5 .2 % ,平均为 2 .2 %。进化树分析表明在我国河南地区HIV感染B亚型多为与泰国株相近的B’亚型。结论 HIV 1p2 4编码区仍相对保守 。

适于HIV-1 p24抗原检测试剂的单抗制备与筛选

目的制备抗HIV-1p24单克隆抗体(单抗,McAb),并利用双抗体夹心ELISA法建立HIV-1p24抗原检测试剂。方法以基因工程原核重组抗原HIV-1p24蛋白免疫BALB/c小鼠,利用常规杂交瘤技术和间接ELISA法制备单克隆抗体,单抗经纯化和HRP标记后,利用双抗体夹心ELISA筛选检测p24蛋白的最佳配伍单抗以期建立HIV-1p24抗原检测试剂。结果成功筛选到16株稳定分泌抗HIV-1p24单抗的杂交瘤细胞株,并从中筛选出最佳单抗配伍组合“16G12+2F2b-HRP”,该组合对p24蛋白的检测灵敏度为20pg/mL,对感染性克隆pNL4-3表达的HIV病毒培养上清检测呈阳性,对100份HIV阴性人血清无非特异性反应,显示出良好的检测灵敏度和特异性。结论本研究初步成功地建立了HIV-1p24抗原的检测试剂,并为最终建立HIV第四代诊断试剂(HIV Ag/Ab Assay)奠定了坚实的基础。

HIV-1 p24和SIV p27两种ELISA试剂盒检测SIV p27抗原的比较

目的由于检测SIV p27抗原试剂盒来源困难,有时不稳定,鉴于HIV-1 p24与SIVp27有较强的交叉抗原,本研究比较HIV-1 p24和SIV p27两种ELISA试剂盒检测SIV p27抗原得出的结果是否存在一定的相关性。方法 HIV-1 p24和SIV p27两种ELISA试剂盒定性和定量检测样品中SIV p27抗原,并对检测结果进行回归和相关分析。结果 HIV-1 p24和SIV p27两种ELISA试剂盒检测SIV p27抗原的灵敏度分别是150 pg/mL和62.5 pg/mL。两种试剂盒检测病毒液和血浆中SIV p27抗原的定性结果一致。定量结果的统计分析得出病毒液的直线回归决定系数R2=0.857,直线相关系数r=0.926,P<0.01,直线正相关程度较高;血浆的直线回归决定系数R2=0.512,直线相关系数r=0.716,P<0.05,直线正相关程度较低。结论 HIV-1 p24 ELISA试剂盒能够替代SIVp27 ELISA试剂盒定性检测病毒液和血浆中SIV p27抗原,但只能定量检测病毒液中SIV p27抗原。

分离型痘苗病毒表达载体的构建及HIV-1 gag p17-24的表达

目的:探索荧光蛋白作为报告基因以及His·Tag作为纯化标签在重组痘苗病毒表达系统中的应用.方法:将N-端融合His·Tag基因序列,插入痘苗病毒表达载体pSFJ2-16,并在其多克隆位点下游装入带有巨细胞病毒(CMV)启动子的突变型荧光蛋白基因(GFP),构建成N-端融合His·Tag并带有荧光蛋白报告基因的分离型痘苗病毒表达载体.再从pET-28中切出C-端融合His·Tag及多克隆位点序列,并与CMV-FP基因一同装入pSFJ2-16,构建成C-端融合His·Tag的分离型痘苗病毒表达载体.将人免疫缺陷病毒-1型(HIV-1)核心蛋白(gag)p17-24基因分别插入上述载体,并筛选出重组病毒.结果:实验表明,重组病毒表达了gag蛋白.结论:将His-Tag的纯化标签加入到通用型痘苗病毒表达载体中用于纯化表达的目的蛋白,该方法是可行的.荧光蛋白基因作为一个筛选标记基因应用于痘苗病毒载体系统还有待进行进一步研究.

在重组痘苗病毒中共表达HIV-1p24gag与hIL-6基因

以ＨＩＶ－１ ｐ２４ｇａｇ 与ｈＩＬ－６ 基因在重组痘苗病毒中的共表达研究为目的，将痘苗病毒复制非必需区血凝素（ＨＡ） 基因作为侧翼，把编码人白细胞介素６（ｈＩＬ－６）的基因片段克隆到真核表达质粒ｐ１６ＱＦ１ －２４ 的下游，构建成含有ＨＩＶ－ １ｐ２４ｇａｇ 和ｈＩＬ－６ 两种外源基因的重组表达质粒ｐ１６ＱＦ２４ －ＩＬ６ ，经同源重组和血凝素阴性空斑筛选，获得了重组痘苗病毒ｖ１６ＱＦ２４ －ＩＬ６．经间接免疫荧光试验、Ｄｏｔ－ ＥＬＩＳＡ 和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｏｌｔ 等检测证明，重组病毒能同时表达ｐ２４ｇａｇ 蛋白和ＩＬ－６ 蛋白，表达产物的相对分子质量分别为２－４×１０４ ，２－６×１０４ ．此种方式表达的外源蛋白持续释放，可产生更强的免疫效果，可望用于ＨＩＶ疫苗的研究．