Ⅰ型人类免疫缺陷病毒潜伏激活剂的研究进展

艾滋病(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的获得性机体免疫缺陷综合征。高效抗反转录病毒治疗是目前治疗AIDS患者最有效的方法,其虽可降低病人体内病毒载量,但却不能彻底清除病毒。2012年“shock and kill”治疗策略被提出,该策略利用HIV潜伏激活剂(LRA)激活潜伏在CD4+T细胞内的HIV-1使其暴露,随后通过增强免疫系统或采用抗病毒药物消灭携带有病毒的宿主细胞,从而逐渐清除病毒潜伏库,最终实现艾滋病的功能性治愈。HIV-1潜伏机制主要有5种:表观遗传学调控、转录因子对基因的调控、免疫信号通路的调节、前病毒基因整合位点的影响和微RNA的影响。基于HIV-1的潜伏机制,目前有潜力作为LRA的药物主要包括表观遗传修饰剂、转录因子调节剂和免疫激活剂等。本文对以上几类药物的作用机制、代表性药物以及研究进展进行综述,以期为LRA研发提供思路。

HIV-1潜伏库研究进展

HIV-1在未经治疗的艾滋病患者体内虽可以持续复制,但也可潜伏在细胞内以逃避宿主的免疫清除,这一现象即病毒潜伏。病毒潜伏对抗病毒治疗带来了挑战,也引起人们的高度关注。本文对HIV-1病毒潜伏库的研究进展进行了综述。

扩增潜伏HIV-1 DNA序列实验方法的优化

目的对PCR扩增潜伏HIV-1DNA序列的实验方法进行优化。方法收集30例经高效抗逆转录病毒治疗（HAART）6~12个月的HIV-1感染者抗凝血标本,分别从外周血单个核细胞（PBMC）和高度纯化的CD4＋T细胞提取基因组DNA,巢式PCR扩增HIV-1env的C2-V5区,电泳检测扩增产物并进行DNA序列测定。结果同一患者PBMC纯化CD4＋T细胞标本扩增HIV-1env基因C2-V5区的效率（93.3%）明显高于直接从PBMC标本扩增该目的片段的效率（10.0%）。结论 PBMC纯化CD4＋T细胞后,再提取基因组DNA进行巢式PCR扩增,可提高扩增潜伏HIV-1DNA序列的效率。

一类具有潜伏感染细胞的时滞HIV-1传染病模型

提出了一类具有潜伏感染细胞的时滞HIV-1传染病模型,定义了基本再生数Ro,给出了无病平衡点P0(x0,0,0,0)和慢性感染平衡点P*(x*, 3*, y*, v*)的存在条件.首先利用线性化方法,得到了无病平衡点和慢性感染平衡点的局部渐近稳定性.进一步通过构造相应的Lyapunov函数,并结合LaSalle不变集原理,证明了当R0<1 时,无病平衡点P0(x0,0,0,0)是全局渐近稳定的;当R0>1时,慢性感染平衡点P*(x*, 3*, y*, v*)是全局渐近稳定的,但无病平衡点P0(x0,0,0,0)是不稳定的.结果表明,模型中的潜伏感染时滞和感染时滞并不影响模型的全局稳定性,并通过数值模拟验证了所得结论.

宿主细胞microRNAs对潜伏于静息初始CD4^+T细胞中HIV-1病毒的作用

microRNAs是参与靶基因转录后调控的一类非编码小RNA，它们可分别来源于宿主细胞RNA或病毒RNA。研究证实，病毒编码的microRNAs可靶向宿主细胞或病毒自身基因，调控其表达而实现免疫逃逸和相关致病作用；而宿主细胞编码的microRNAs在抗病毒感染过程存在防御作用，但亦有研究发现宿主细胞microRNAs在病毒感染复制中起促进作用，如miR-122和HCV感染。艾滋病患者的临床治疗是个世界难题。HIV-1病毒潜伏于静息性初始CD4＋T淋巴细胞是艾滋病患者接受临床治疗方案HAART最终失败的主要原因。其中，HIV-1的潜伏存在作用于病毒生命周期多个环节的多种因素的影响。本论文作者向我们展示了在基因转录后水平宿主细胞microRNAs在其中发挥的作用。

HIV-1病毒储存库在HIV持续感染中的作用

清除HIV-1的一个重要的障碍就是在HIV感染的过程中,病毒能够潜伏在某个亚群的细胞中。这些亚群细胞的易感性、生命周期、繁殖能力及其在细胞生理和免疫条件改变的情况下周期性产生病毒的能力对病毒的持续存在都是很重要的影响因素。记忆性CD4+T淋巴细胞、骨髓来源的单核-巨噬细胞及造血祖细胞都被认为是HIV-1前病毒DNA的储藏库。本文对HIV-1持续存在有意义的细胞及清除这些潜伏感染细胞可能的策略进行综述。

DC-SIGN诱导的信号通路在HIV-1前病毒活化中的作用

目的研究HIV-1 gp120蛋白与DC-SIGN结合对HIV-1前病毒的活化作用及其信号通路机制。方法将DC-SIGN表达质粒和HIV-1 5’末端重复序列(5’LTR)报告质粒转染293T细胞,以HIV-1 gp120蛋白、野生型HIV-1、VSV-G-p NL4.3假病毒分别刺激,检测HIV-1 5’LTR的活性。慢性感染HIV-1的CEM-Bru细胞转染DC-SIGN表达质粒,以HIV-1 gp120蛋白刺激,检测HIV-1Tat mRNA和HIV-1 p24蛋白表达水平。特异性抑制ERK、P38和NF-κB信号通路,再用gp120刺激DC-SIGN(+)CEM-Bru细胞,检测HIV-1前病毒的活化。结果在DC-SIGN(+)293T细胞中,HIV-1 5'LTR可以被HIV-1 gp120激活。HIV-1 gp120蛋白及DC-SIGN刺激DC-SIGN(+)CEM-Bru后,HIV-1 Tat mRNA和HIV-1 p24蛋白表达水平明显升高,提示其早期和晚期HIV-1前病毒复制,用抗体阻断DC-SIGN可抑制潜伏HIV-1活化。HIV-1 gp120/DC-SIGN通过NF-κB信号通路在激活潜伏HIV-1前病毒。结论 HIV-1gp120可通过结合DC-SIGN激活NF-κB信号通路介导HIV-1前病毒活化。

nPKC-PKD3信号传导途径介导Prostratin活化HIV-1转录

采用HIV-LTR-Luc稳定细胞株分析其荧光素酶活性,研究Prostratin活化潜伏的艾滋病毒的分子机制.实验结果表明:随药物浓度升高和处理时间延长,Prostratin能明显激活HIV-1转录.采用PKC抑制剂拮抗nPKC活性,能有效阻断Prostratin对HIV-1的激活;反之,过表达nPKC能激活HIV-1转录.最后,敲低PKD3高效拮抗Prostratin激活的HIV-1转录.因此,nPKC-PKD3信号途径参与Prostratin活化HIV-1转录,从而激活潜伏的艾滋病毒.本研究为开发新的抗艾滋病药物筛选模型提供了可靠的理论依据.

靶向EBV潜伏膜蛋白1的单克隆抗体促进HIV相关EBV阳性伯基特淋巴瘤细胞凋亡的分子机制

目的制备和筛选抑制伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma,BL)的抗EBV潜伏膜蛋白1(latent membrane protein-1,LMP1)单克隆抗体。方法人工合成EBV潜伏膜蛋白1的跨膜结构域5(transmembrane domain 5,TMD5),并以此为抗原,采用杂交瘤法制备抗TMD5单抗。ELISA法测定小鼠腹水中的抗体效价。7-氨基放线菌素D(7-Aminoactinomycin D,7-AAD)/Annexin V-PE双标记流式细胞术和JC-1染色联合流式细胞术测定线粒体膜电势评估单抗对BL细胞系Daudi细胞的促凋亡活性。蛋白质印迹法测定Daudi细胞内促存活信号通路p38-MAPK/IKK/NF-κB相关蛋白的表达水平。结果经过2轮筛选,获得R2-2-5E-6C和R2-2-8D-3A两种单抗,这2种单抗均能与TMD5发生抗体-抗原特异性结合,而与GAPDH无免疫反应。与NC组相比,R2-2-5E-6C组和R2-2-8D-3A组处理后的Daudi细胞中Annexin V+7-AAD+细胞所占百分比增加;JC-1荧光强度<104的细胞所占百分比增加;胞内p38-MAPK、IKK和NF-κB的表达水平降低(P<0.05)。结论筛选获得的抗TMD5单抗R2-2-5E-6C和R2-2-8D-3A可通过抑制LMP1介导的p38-MAPK/IKK/NF-κB信号通路的活性促进BL凋亡。

HIV-1潜伏库调控剂的研究进展

HIV-1潜伏库的存在导致艾滋病无法彻底治愈。因此,迫切需要开发高效低毒、成药性良好的HIV-1潜伏库调控剂以实现艾滋病的功能性治愈。本文综述了2019年以来潜伏库调控剂的研究进展,涵盖药物发现策略、生物活性和作用机制。本文对于发现具有临床应用价值的HIV-1潜伏库调控剂具有重要的指导意义。

人免疫缺陷病毒1型潜伏感染激活剂研究现状

高效抗逆转录病毒治疗（HAART）对控制HIV-1进展效果显著，但病毒潜伏库的存在导致病毒无法完全清除。HIV-1感染后，潜伏库建立早，半衰期长，长期处于静息状态，是根治HIV-1感染的主要障碍之一。目前清除病毒潜伏库的方法有潜伏感染激活剂、免疫治疗和基因治疗等。此文主要讨论了HIV-1潜伏感染激活剂相关内容。

HIV-1储存库激活剂体外激活效应研究

目的探讨人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)储存库激活剂的体外激活效应,为临床应用提供参考。方法分离得到健康供血者外周血中的CD4^+T细胞,构建HIV-1潜伏感染的原代细胞模型。用不同浓度(0.5、1、2μmol/L)的帕比司他(Panobinostat)、伏立诺他(SAHA)(Vorinostat)、BIX-01294、JQ-1、Bryostatin-1、GS-9620、地西他滨(Decitabine)、戒酒硫(Disulfiram)、Sirolimus分别处理细胞,在不同作用时间(1、3、5 d)后利用流式细胞分析仪检测每种药物对HIV-1储存库细胞的绿色荧光蛋白(GFP)表达效率及细胞存活率,并确定每种激活剂的最佳激活浓度和作用时间。结果通过对由HIV-1启动子驱动的GFP表达效率及细胞存活率的统计分析,明确了在该细胞模型中这9种HIV-1储存库激活剂的最佳作用浓度和作用时间:Panobinostat的最佳激活浓度为1μmol/L,最佳作用时间为3 d;SAHA的最佳激活浓度为2μmol/L,最佳作用时间为1 d;JQ-1、Bryostatin-1和GS-9620在该模型中的最佳激活浓度均为1μmol/L且最佳作用时间均为1 d;BIX-01294、Decitabine、Disulfiram、Sirolimus在该模型中的最佳激活浓度均为0.5μmol/L且最佳作用时间均为1 d。横向对比发现,浓度为1μmol/L,作用时间为3 d的Panobinostat与浓度为0.5μmol/L,作用时间为1 d的Sirolimus在这9种药物中的激活效率最高,且对细胞存活无明显影响。结论系统比较确认了9种病毒储存库激活药物在体外细胞模型中的激活效率,及最佳作用浓度和时间,为后续这些药物的临床实验研究提供重要参考。

VP-16对HIV-1潜伏感染再激活作用的研究

目的探索依托泊苷(VP-16)对人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)潜伏感染的激活作用并研究其潜在的分子机制。方法将HIV-1潜伏感染细胞系J-Lat分为二甲基亚砜(DMSO)处理组、VP-16处理组及伏立诺他(SAHA)处理组,利用流式细胞技术检测细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)阳性比例,评估高浓度VP-16对HIV-1潜伏感染的激活效率;通过流式细胞技术检测VP-16在不同作用浓度及不同作用时间下对HIV-1潜伏感染的激活效果;通过流式细胞技术检测在VP-16作用下J-Lat细胞中CD25、CD69及白介素-6(interleukin-6,IL-6)的表达情况;运用双荧光素酶报告系统检测VP-16对HIV-1长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)转录水平的影响;使用蛋白质印迹技术(western blot,WB)检测VP-16作用下蛋白沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)及核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)乙酰化p65的表达水平;利用慢病毒介导的靶向SIRT1短发夹RNA(SIRT1 short-hairpin RNA,SIRT1-shRNA)敲低J-Lat细胞的SIRT1表达并检测相应的激活效果。结果流式细胞技术分析结果显示,VP-16能够特异性地激活HIV-1潜伏感染细胞系J-Lat,其激活效果存在浓度依赖和时间依赖;VP-16激活HIV-1潜伏感染的同时会一定程度上调J-Lat细胞的CD25及CD69,但IL-6的表达水平无明显变化;双荧光素酶报告实验提示VP-16通过NF-κB信号通路正向调控HIV-1 LTR的转录水平;WB结果表明VP-16能够抑制SIRT1的蛋白表达并促进NF-κB p65的乙酰化水平;慢病毒SIRT1-shRNA成功敲低J-Lat细胞中SIRT1的mRNA和蛋白表达,能够有效激活HIV-1潜伏感染。结论VP-16通过抑制SIRT1表达从而上调NF-κB p65的乙酰化水平,继而促进HIV-1 LTR的转录并最终激活HIV-1的潜伏感染。

HIV-1潜伏储存库及其控制策略

高效抗逆转录病毒治疗（HAART）是人类在治疗人类免疫缺陷病毒（HIV）感染/艾滋病（AIDS）方面取得的一个重要成就。HAART不仅可以有效控制HIV复制,将血浆病毒载量降至现有常规检测方法测不出的水平,而且能重建艾滋病患者的免疫功能[1],延长患者生命,降低死亡率。HAART体系建立时人们希望能够完全清除患者体内的HIV,达到治愈AIDS的目的 ,

HIV-1潜伏和储存库研究进展

目前，无法根治HIV－1感染的主要障碍在于病毒可以在被它感染的某些细胞亚群中保持潜伏状态，即使成功应用HAART，潜伏的感染细胞也能够通过逃避病毒引起的免疫应答而存活很长时间。如果加以适当刺激，潜伏的细胞能够重新活化，产生具有感染性的病毒体。此文对HIV－1潜伏的机制和储存库研究进展进行了综述。

成视网膜细胞瘤结合蛋白4在HIV-1潜伏细胞中的作用研究

目的探讨成视网膜细胞瘤结合蛋白4（retinoblastoma protein associated proteins 48, RBBP4）分子在HIV-1潜伏中的作用及其机制。方法25 ng/ml的肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor alpha, TNF-α）和10 ng/ml的IL-2刺激HIV-1潜伏细胞CEM-Bru后，利用染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation, ChIP）分别研究细胞刺激前后RBBP4以及与RBBP4关联的组蛋白脱乙酰化酶1和2（histone deacetylase, HDAC1/2）在前病毒启动子长末端重复序列（long terminal repeat, LTR）上的结合变化。电转法对潜伏细胞进行RBBP4部分干扰后，利用ChIP检测HDAC1/2以及组蛋白H3乙酰化水平和RNA聚合酶Ⅱ （RNA polymerase Ⅱ，RNA PolⅡ） 在LTR的结合变化，RT-PCR检测HIV-1起始转录本和延长转录本的变化。结果在HIV-1潜伏细胞中RBBP4和HDAC1/2在LTR上结合与激活状态相比显著增加；将RBBP4部分干扰后，RBBP4在LTR上的结合明显减少，导致HDAC1和HDAC2在LTR上的结合也减少，并伴随着组蛋白3 （histone 3, H3）乙酰化水平的增加和RNA PolⅡ在LTR上结合的增加。此外，RBBP4干扰后HIV-1起始转录本明显增加。结论RBBP4能促进HIV-1潜伏，这种作用可能与组蛋白脱乙酰化酶HDAC1和HDAC2有关。

体外研究HIV-1潜伏库实验方法进展

HIV-1在未治疗的艾滋病患者体内，虽可以持续复制，但也可潜伏在细胞内以逃避宿主的免疫清除，这一现象即病毒潜伏。由于病毒潜伏对抗病毒治疗带来了挑战，也引起人们的高度关注。此文对体外研究HIV-1潜伏库的实验方法进展进行综述。

在抗病毒治疗中使用伏立诺他会破坏HIV-1的潜伏

目前使用的抗逆转录病毒药物可以控制病毒的复制，但是对感染HIV-1的患者来说，实现治愈的一个主要障碍在于HIV基因组能够融进休眠的CD4＋T细胞的DNA中，并处于潜伏状态，从而躲过免疫检测及药物进攻而在免疫系统中持久存在。这也是艾滋病患者停止药物治疗后再度出现感染的主要原因，为此患者需要终身使用抗逆转录病毒药物，但其耐药性、药物副作用以及成本等影响加大。而破坏和清除这些潜伏的病毒，正是找到艾滋病治愈方法的关键所在。