A novel non-radioactive assay for HIV-RT(RdDp)based on pyrosequencing for high-throughput drug screening

Current in vitro assays for the activity of HIV-RT(reverse transcriptase)require radio-labeled or chemically modified nucleotides to detect reaction products.However,these assays are inherently end-point measurements and labor intensive.Here we describe a novel non-radioactive assay based on the principle of pyrosequencing coupledenzyme system to monitor the activity of HIV-RT by indirectly measuring the release of pyrophosphate(PPi),which is generated during nascent strand synthesis.The results show that our assay could monitor HIV-RT activity with high sensitivity and is suitable for rapid highthroughput drug screening targeting anti-HIV therapies due to its high speed and convenience.Moreover,this assay can be used to measure primase activity in an easy and sensitive manner,which suggests that this novel approach could be wildly used to analyze the activity of PPi-generated and ATP-free enzyme reactions.

单宁在抗艾滋病研究中的应用

本文综述了近十年内各类单宁（包括没食子单宁、鞣花单宁、缩合单宁和复杂单宁）及单宁衍生物在抗艾滋病研究中的应用情况。

用艾滋病毒和马传染性贫血病毒逆转录酶筛选抗艾滋病毒中药的研究

作者研究了艾滋病病毒逆转录酶(HIV—RT)抑制剂PFA、Suramine对HIV—RT和马传染性贫血病病毒逆转录酶(EIAV—RT)的抑制作用。对HIV—RT、EIAV—RT的50％抑制浓度(IC_(50)),PFA分别为0.2μmol、9.8μmol,Suramin分别为17μmol、19.9μmol。以HIV—RT和EIAV—RT作为靶酶,筛选了30多种中药复方、单味药提取物及中药成分,发现虎杖、田七粉等5种中药粗提物,槲寄生黄酮、白毛夏枯草黄酮、马兜铃酸等7种成分及1种复方小柴胡汤提取物对两种酶有不同程度的抑制作用。两种酶作用平行,但不如HIV—RT敏感,表明HIV—RT可用于筛选抗艾滋病药物。

金丝桃素与乙基金丝桃素的全合成及对人免疫缺陷病毒逆转录酶的抑制活性

金丝桃素与乙基金丝桃素的全合成及对人免疫缺陷病毒逆转录酶的抑制活性赵晶张致平陈鸿珊陈湘红（中国医学科学院医药生物技术研究所，北京１０００５０）近年发现由贯叶金丝桃（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍｐｅｒｚｏｒａｔｕｍ），三棱三叶金丝桃（Ｈ．ｔｒｉｑｕｅｔｒｉｆ...

山竺果壳的化学成分(英文)

从山竺（Garcinia mangostana）果壳中分离得到6个化合物，通过MS，1D NMR以及与文献对照鉴定它们为4个[口山]酮类化合物：α-rnangostin（1），β-mangostin（2），γ-mangostin（3），5，9-dihydroxy-8-methoxy-2，2-dimethyl-7-（3-methylbut-2-envl）-2H，6H-pyrano-[3，2-b]-xanthen-6-one（4），以及表儿茶素（epicatechin，5）和一个双苄类化合物egonol（6）。其中化合物5和化合物6为首次从该植物中分离得到。对化合物1～5进行抗HIV-1 RT活性筛选结果表明，化合物2和化合物5在浓度200μg/ml的条件下，其对HIV-1 RT抑制率分别为41．97％和47．72％；同一实验结果显示化合物1，3和4没有抑制HIV-1 RT作用。

1-(3-酞酰亚胺基-2-氧丁基 )-4-取代苯基哌嗪的合成及抗HIV-1逆转录酶活性(英文)

目的 合成新型的非核苷类 (双杂环苯基 )化合物 ,并观察其抗HIV1 逆转录酶 (HIV1 RT)活性。方法 以氮芥盐酸盐为起始原料 ,与不同取代苯胺反应 ,得到相应的不同取代的哌嗪盐酸盐 ,并与 1 溴 3 酞酰亚胺基 2 丁酮 (4)缩合 ,得到目标化合物。结果 合成 11个目标化合物 (5～ 15 )。经1HNMR ,红外和元素分析确定结构。结论 经HIV逆转录酶P 6 6蛋白测定 ,化合物 11,14 ,10和 13有一定抑制HIV1 RT活性 ,其IC50 分别为 2 9 80 ,35 2 0 ,4 3 77和 6 3 76 μmol·L-1。

干崖子橐吾的化学成分研究

目的 :研究云南民间使用的草药干崖子橐吾药用部位的化学成分 ,为其资源开发提供化学基础。方法 :运用层析法、结晶法等手段分离了 8个化合物 ,并通过理化常数及波谱方法鉴定了结构。结果 :8个化合物的结构为 :9α-hydroxypinoresinol( 1 ) ,1 1 -hydroxyeremophil-6 ,9-dien-8-one( 2 ) ,大黄素 ( 3) ,大黄素甲醚 ( 4 ) ,大黄素甲醚 -8-O-β-葡萄糖苷 ( 5 ) ,东莨菪内酯 ( 6 ) ,β-谷甾醇及胡萝卜苷。结论 :以上 8个化合物均为首次从干崖子橐吾中分离得到 ,其中化合物 3、4、5为首次从橐吾属中分离得到 ,化合物 1～ 6经过初步抗 HIV-1 RT活性测试 ,没有明显的抗 HIV-1

贯叶连翘有效成分金丝桃素与HIV逆转录酶相互作用的研究

采用理论计算化学分子动力学模拟方法研究金丝桃素的分子结构,并从分子水平上研究金丝桃素与HIV逆转录酶的相互作用.建立了酶-抑制剂复合物模型,分析可能的相互作用关系和作用机理.研究结果表明,金丝桃素分子结构具有刚性特征.金丝桃素与HIV逆转录酶以氢键相互作用和∏-∏相互作用结合.

RT-PCR扩增HIV-1基因gag区多个片段早期诊断HIV感染

目的 :建立 RT- PCR(逆转录多聚酶链式反应 )扩增 HIV核酸的检测方法并将其应用到 HIV感染的早期诊断中。方法 :合成 HIV- 1(艾滋病毒 1型 )基因组 gag区 9条引物 ,从 HIV1+2蛋白印迹法确定为抗体阳性、并经病毒载量检测阳性的 HIV感染者血浆中提取 HIV- 1RNA,应用 9条引物的随机组合 RT- PCR扩增 HIV gag区核酸片断 ,筛选出扩增灵敏度最高的 3个扩增片断。从血浆 HIV病毒载量大于 5 0 0 copy/ ml的 HIV感染者和正常人血浆中提取病毒 RNA,应用上述 3个扩增片断的引物组合 RT- PCR扩增样本核酸 ,PCR产物经凝胶电泳观察 ,判断待检病人是否感染。结果 :该方法的敏感性为 96 % ,特异性为 10 0 % ,3个片断扩增灵敏度分别为 76 %、 87%、 73%。结论 :应用 RT- PCR扩增 HIV核酸保守区多个基因片断 ,具有较高的灵敏度和特异度 ,方法简单 ,可以应用到

深圳地区HIV-1感染者的本底耐药水平调查初探

[目的]建立一套完善,可靠,适合深圳人群的HIV-1耐药性基因型检测方法,调查分析深圳地区未接受抗病毒治疗的HIV感染者/AIDS患者的病毒株耐药突变及其本底流行情况。[方法]从未接受抗病毒治疗的HIV-1感染者血浆中提取病毒RNA,采用RT-PCR扩增目的基因片断,并对扩增片断进行序列测定和分析。[结果]通过HIV-1耐药性基因型检测法能够获得1300bp长度的目的基因片断。经序列分析所得的21份RT基因结果中有8份对NRTI产生耐药突变(38.5%),5份对NNRTI产生耐药突变(23.81%);另外分析所得的12份PR基因结果中1份产生对蛋白酶抑制剂主要耐药突变(8.33%),5份产生对蛋白酶抑制剂次要耐药突变(41.67%)。[结论]HIV-1耐药性基因型检测法能有效地监测HIV-1感染者血浆中的耐药性病毒株的存在,并且检测结果表明,深圳地区未接受抗病毒治疗的HIV-1感染者中已经存在耐药突变株。

马缨丹根:化学成分及抑制HIV逆转录酶活性

用硅胶柱层析分离马缨丹(Lantana camara L.)根部乙醇浸提物获得25个组分,其中三个组分对HIV逆转录酶(HIV reverse transcriptase,HIV RT)活性有抑制作用。使用减压柱层析从部分组分中分离获得了6个五环三萜类化合物,它们的结构经波谱分析分别鉴定为齐墩果酮酸(oleanonic acid,1)、路路通内酯(liquidambariclactone,2),马缨丹烯A(lantadene A,3)、马缨丹烯B(lantadene B,4)、齐墩果酸(oleanolic acid,5)和25-羟基-齐墩果酸(25-hydroxy-oleanolic acid,6)。其中,化合物2和6首次从马鞭草科植物中分离得到,同时,首次报道了化合物6的单晶结构。

多糖化合物抗HIV活性及应用

多糖类化合物种类繁多 ,许多多糖化合物在体内或体外表现出良好的抗HIV活性 ,多糖能够作用于HIV复制周期的多个环节 ,影响tat、gp1 2 0、RT等多个病毒蛋白的功能。目前 ,已有多糖被用于杀微生物剂、抗病毒辅助治疗、抗机会性感染等临床研究中 ,多糖在临床上存在抗凝血活性、生物利用度低等问题 。

HIV-1 gag与gp41基因片段的序列特征与亚型研究

本文对华北地区出入境39例HIV-1阳性样本(中国21例,非洲17例,东南亚1例)的gag和env两个基因片段进行了序列特征和亚型对比分析。发现了A、A1、A3、B、C、G亚型和重组亚型03_AB、01_AE、AG、02_AG、07_BC、08_BC、CD和06_CPX共14个亚型,其中重组亚型占57.2%(8/14)。表明HIV-1基因变异较快,亚型分布广泛,重组亚型有增多趋势。此外发现26.7%(8/30)的样本,其gag和env基因区亚型表现不一致。提示在研究HIV-1亚型中应综合gag和env两个基因区的序列特征进行亚型分析。

集合HIV RNA RT-PCR方法验证及其在IDUs中窗口期检测的应用

目的对已建立的集合艾滋病病毒(HIV)RNA逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行实验室验证,并将其应用于静脉吸毒人群中窗口期的检测。方法采用50∶1、10∶1、1∶1三级集合HIV RNA RT-PCR方法进行盲样验证及可重复性验证。结果(1)集合HIV RNA RT-PCR方法盲法验证的结果和预期值一致,重复性验证中9个一级集合的病毒载量对数值的变异系数为6%,单因素方差分析P>0.05,方法的重复性良好。(2)检测3 570份吸毒人群的HIV抗体阴性血清或血浆样本。对发现的RNA阳性感染者进行追踪采样,发现2例HIV RNA窗口期阳性。追踪随访,HIV-1抗体阳转。结论集合HIV RNA RT-PCR方法具有良好的实验性能,可应用于HIV高危人群窗口期检测。

用两步MS-PCR结合ELISA检测HIV-1逆转录酶基因的耐药性突变

高效抗逆转录病毒治疗法(HAART)的推广使用有效地抑制了HIV-1病毒的传播和艾滋病(AIDS)的发病率、死亡率。近年来,HIV-1逆转录酶基因突变所导致的耐药性已成为HAART治疗失败的主要原因,耐药性突变的检测对于指导病人用药以及新药开发具有重要意义。发展了一种检测HIV-1逆转录酶基因耐药性突变的新方法。采用两步MS-PCR方法检测HIV-1B亚型野生型和耐药突变型逆转录酶基因突变,检测点包括M41L、K70R、K103N、Y181C和T215,并在两步MS-PCR基础上,设计比野生型引物长的突变型引物,结合微孔板杂交ELISA呈色技术检测各点突变。结果显示,简化的两步MS-PCR能保持灵敏度和特异性高的优点,ELISA的阳性结果与阴性结果的比值(P/N)达到要求,两步MS-PCR结合ELISA方法灵敏度高,操作简单、结果直观、成本低、相对耗时短且能进行高通量检测,使其无论在HIV-1耐药性突变及其它的点突变检测中都具有较好的临床应用前景。

HIV-1抗体蛋白印迹确认与核酸检测复核对比研究

应用病毒核酸载量法NASBA和HIV-1 RNA的巢式逆转录PCR(nested RT-PCR)法与HIV抗体蛋白印迹(WB)方法,对经过初筛的44例HIV-1抗体阳性标本进行了对照检测研究。发现了2例(gp160、p24)和1例(gp160g、p120p、66、p24)的特殊阳性样本,经NASBA法和该RT-PCR法核酸检测为阴性;WB确认的4例gp160阳性带、1例p24、p17阳性带和13例p24阳性带,经NASBA法和该RT-PCR法核酸检测也为阴性;而WB确认的其余全部带型的抗体阳性标本经过NASBA法和该RT-PCR法检测均为阳性。该研究表明对只有gp160p、24和gp160、gp120p、66、p24的特殊阳性标本和以p24为主的抗体不确定标本需要用RT-PCR或NASBA方法进行核酸检测,以进一步确认。

HEPT类HIV-1逆转录酶抑制剂的研究进展

逆转录酶是设计抗艾滋病药物研究的选择性靶酶 ,从作用机制、构效关系等方面综述HEPT及其类似物作为HIV 1逆转录酶抑制剂的研究进展。

集合HIV-1 RNA RT-PCR方法在男男性行为人群艾滋病窗口期检测中的应用

目的:检出男男性行为人群中的艾滋病病毒(HIV)窗口期感染者并初步估计发病率。方法:采用20∶1、5∶1、1∶1三级集合HIV-1 RNA RT-PCR方法进行试验。结果:检测948份男男性行为人群HIV抗体阴性血浆,发现HIV-1 RNA阳性4例,追踪随访,HIV-1抗体阳转;初步估计HIV-1年发病率约为5.55%(95%CI,3.50%～7.59%)。结论:集合HIV-1 RNA RT-PCR方法具有良好的实验效果,可以用于HIV高危人群窗口期感染者的检测。

2004~2006年海南省HIV初筛阳性标本的复检及确认情况分析

目的 了解海南省近3年艾滋病病毒（HIV）抗体初筛阳性标本的复检及确认情况,促进实验室网络检测能力提高.方法 对海南省2004～2006年3年艾滋病筛查实验室初筛阳性送检样本及本室初筛阳性的428份样本进行复检与确认,并对其检测结果分析比较.结果 经本室酶联免疫吸附试验（ELISA）复检,由各筛查实验室送检的428份中,有85份HIV抗体阴性（85/414,20.5%）,其中2004年21份（占当年21.4%）、2005年44份（占当年26.2%）、2006年20份（占当年13.5%）;两种E1.1.qA或一种ELISA和一种快速法（雅培硒标或富士PA）均为阳性的240份,一种ELISA或一种快速法为阳性的103份,经WB试验确认277份为HIV-1抗体阳性（80.8%）,13例阴性（3.8%）,53例不确定（15.4%）.13例阴性样本中,ELISA法检测假阳性10例,快速法3例.两种ELISA或一种ELISA和一种快速法双阳性与WB的阳性符合率为93.3%.结论 应进一步加强实验室规范化管理,消除引起初筛试验假阳性结果因素.

HIV基因芯片在艾滋病母婴传播早期诊断中的应用

目的:建立适用于艾滋病母婴传播早期诊断的HIV基因芯片检测技术。方法:在产后180d内,采集HIV抗体阳性母亲所生婴幼儿的样本进行检测。从HIV基因组Gag区选取3对适宜引物,经逆转录-聚合酶链反应(RT PCR)扩增3个HIV目的基因片断。扩增产物纯化后与载体连接,转化到JM10 9宿主菌,接种平板培养,提取质粒。将探针点于尼龙膜上,制成基因芯片。样本提取DNA后与阳性对照质粒混合,地高辛标记显色观察结果,并和抗体检测结果相比较。结果:采用HIV基因芯片对9位HIV抗体阳性母亲所生婴幼儿进行检测,其中阳性2名,阴性7名,与抗体确认结果相比,敏感性和特异性均为10 0 0 %。结论:该方法能够对婴幼儿进行早期诊断,判断HIV母婴传播的方式,便于干预和治疗。