HIV-Tat蛋白转导域在医学研究中的应用

HIV Tat蛋白转导域 (proteintransductiondomain ,PTD)是新近发现的一种在蛋白转导过程中能高效穿过生物膜的结构域 ,它能将与其共价连接的多肽、蛋白质及DNA等分子跨膜导入几乎所有的组织和细胞 ,甚至可以通过血脑屏障 ,转导效率很高而且对细胞没有损伤。TAT融合蛋白系统被认为是一种很有前途的运载工具 。

BH3-HIV-TAT抗前列腺癌的活性

目的:探讨人工合成的BH3-HIV-TAT肽对前列腺癌细胞株LNCaP增殖的影响。方法:以25、50、1000μmol/L的BH3-HIV-TAT处理LNCaP细胞12或24h,以激光共聚焦显微镜观察BH3-HIV-TAT肽的细胞定位;观察经BH3-HIV-TAT肽处理后,LNCap细胞凋亡过程中核染色质的形态学变化;用流式细胞仪分析不同时间不同浓度的短肽对细胞凋亡程度和周期的影响;以MTS/PMS测定,分析短肽对LNCaP细胞的增殖是否有浓度依赖性的影响。结果:激光共聚焦检测结果显示BH3-HIV-TAT肽主要定位在细胞核内;LNCap细胞经短肽处理后,可观察到分为2期的细胞凋亡过程;流式细胞仪检测结果证实了短肽对细胞凋亡程度和周期的影响;MTS/PMS测定表明该短肽具有浓度依赖性的抗前列腺癌细胞的活性。结论:BH3-HIV-TAT肽可有效地诱导前列腺癌细胞株LNCaP的凋亡,从而影响其增殖,实验结果为癌症靶向性治疗提供了依据。

甲基苯丙胺与HIV-Tat蛋白协同改变大鼠血脑屏障通透性的氧化应激作用机制

目的观察甲基苯丙胺与HIV-Tat蛋白协同对大鼠血脑屏障的作用机制.方法雄性SD大鼠每天2次腹腔注射给予MA10 mg/kg的同时尾静脉注射给予HIV-Tat 400 ng/kg,连续7 d,给药结束24 h后随机取10只大鼠尾静脉注射伊文思蓝检测脑组织EB含量,随机取5只大鼠断颈取脑,用于SOD活力、GSH和MDA含量的测定.余下2只大鼠快速断颈取脑,戊二醛-锇酸溶液固定前额叶皮质部分,透射电镜观察结构变化.结果与正常对照组相比,实验组脑组织中EB含量不同程度增加,提示实验组血脑屏障通透性增加(P<0.05);MDA含量升高、SOD活力和GSH含量不同程度降低,提示实验组氧化应激反应增强(P<0.05).MA+Tat组与MA组、Tat组相比,EB含量升高明显,提示MA与HIV-Tat蛋白联用能协同增加血脑屏障通透性;MDA含量显著升高,SOD活力、GSH含量明显下降,提示MA与HIV-Tat蛋白联用能协同增强大鼠脑组织氧化应激反应(P<0.01);NAC+MA+Tat组与MA+Tat组相比,EB含量降低,提示NAC能一定程度拮抗MA与HIV-Tat蛋白对血脑屏障通透性的影响(P<0.01);MDA含量下降,SOD活力、GSH含量明显升高,反映NAC能在一定程度拮抗MA与HIV-Tat蛋白对大鼠脑内氧化应激反应增强作用(P<0.01).各实验组在电镜下观察到血脑屏障一系列超微结构改变,如脑微血管内皮细胞肿胀变薄,血管周围胶质细胞和星形胶质细胞肿胀,胞饮小泡增加等,这些改变以MA+Tat组最为显著.结论 MA和HIV-Tat蛋白能改变血脑屏障通透性,两者具有协同作用,协同作用机制可能与氧化应激有关.

从噬菌体抗体库中筛选抗HIV-Tat蛋白单链抗体

目的从Tomlinson(I+J)噬菌体抗体库中筛选人源化抗HIV-Tat蛋白单链抗体(scFv)并进行鉴定。方法以HIV-Tat蛋白为抗原,通过"吸附-洗脱-扩增"过程从噬菌体抗体库中筛选特异性抗Tat蛋白单链抗体,对其进行基因序列测定,并检测其抗原结合活性。结果经过筛选,获得了1株能与Tat蛋白特异性结合的阳性克隆,经检索kabat数据库,发现其轻、重链可变区分别属于VκⅠ型、VHⅢ型。结论利用噬菌体抗体库技术可以不经过免疫制备出高特异性的人源化抗Tat蛋白单链抗体。

穿膜肽HIV-Tat_(49-57)和CTL表位融合多肽疫苗的初步免疫学效应研究

目的 探讨穿膜肽HIV Tat4 9- 57将CTL表位带入活细胞胞质并将其投入MHC Ⅰ类抗原提呈途径的可能性。方法 应用多肽固相合成技术 ,分别合成含HIVTat4 9- 57和HLA A2 1限制性CTL优势表位MART 12 7- 35的 18肽和该CTL表位 9肽。采用间接免疫荧光与激光共聚焦显微镜技术 ,分别对上述 18肽和 9肽的穿膜能力进行了动态观察。进一步用标准51 Gr释放试验分别检测了上述 18肽和 9肽在HLA A2 1阳性健康者外周血单个核细胞 (PBMC)中诱导的表位MART 12 7- 35特异性CTL活性。结果 18肽能够穿过活哺乳动物细胞质膜进入胞质 ,并呈现出时间、剂量依赖关系 ;而 9肽则无此效应。与 9肽相比 ,18肽在体外诱导出了明显增强的特异性CTL活性 (P <0 0 5 )。结论 穿膜肽HIVTat4 9- 57可有效携带CTL表位穿过细胞膜进入胞质 ,并有效激发出针对该表位的特异性CTL应答 。

GLUT1在甲基苯丙胺与HIV-Tat蛋白协同诱导大鼠血脑屏障通透性改变中的作用研究

目的观察甲基苯丙胺(METH)与HIV-Tat蛋白协同诱导大鼠血脑屏障通透性的改变,探讨GLUT1在METH与HIV-Tat蛋白协同诱导血脑屏障通透性改变中的作用。方法40只雄性SD大鼠随机分成4组,对照组(每日10mL·kg^-1生理盐水)、METH组、HIV-Tat蛋白组、METH+HIV-Tat蛋白组。建立血脑屏障损伤的大鼠模型:采用腹腔注射METH(每日10mg·kg^-1)和尾静脉注射HIV-Tat蛋白(每日400ng·kg^-1)的方法。模型建成功后检测各组脑区伊文思蓝(EB)的含量,并通过Western-Blotting和免疫组织化学观察各组脑中GLUT1表达情况。结果与对照组相比,METH组、HIV-Tat蛋白组和METH+HIV-Tat蛋白组脑组织的EB含量明显增加;分别与METH组和HIV-Tat组相比,METH+HIV-Tat蛋白组脑组织内EB含量明显升高。此外,免疫组化和WB结果显示,与对照组相比,METH组、HIV-Tat蛋白组和METH+HIV-Tat蛋白组表达GLUT1的水平不同程度降低(P<0.01);分别与METH组和HIV-Tat蛋白组相比,METH+HIV-Tat蛋白组GLUT1的表达水平明显降低(P<0.05)。结论METH和HIV-Tat蛋白可协同作用诱导大鼠血脑屏障通透性发生改变,而GLUT1在METH和HIV-Tat蛋白的协同作用中可起调节作用。

甲基苯丙胺与HIV-Tat蛋白协同致大鼠纹状体NMDA受体NR2B亚基和iNOS的表达

目的观察甲基苯丙胺(MA)与HIV-Tat蛋白协同作用致大鼠相关脑区N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体NR2B亚基和诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)的表达变化,探讨MA与HIV-Tat协同作用对神经系统的影响.方法 50只健康雄性SD大鼠随机分为实验组:MA组(10 mg/kg MA,每日2次腹腔注射,连续4 d)、HIV-Tat组(10μg HIV-Tat注入大鼠脑纹状体)和MA+HIV-Tat组(按MA组注射MA 4 d后按HIV-Tat组注入HIV-Tat);对照组:生理盐水腹腔注射或纹状体内注射.各组大鼠分别于注射结束后48 h和7 d处死,麻醉后用多聚甲醛灌注,取出脑组织并固定,石蜡包埋,作冠状切面,用免疫组化和蛋白免疫印迹法对中毒大鼠纹状体中NMDA受体NR2B亚基和iNOS的表达进行观察,并进行图像分析,测量其平均光密度值,与对照组比较并进行统计学分析.结果各实验组与对照组比较,纹状体内NMDA受体NR2B亚基和iNOS的表达均有不同程度增高,差异具有统计学意义(P<0.05);其中MA+HIV-Tat组与MA组、HIV-Tat组比较,NMDA受体NR2B亚基和iNOS的表达显著增高(P<0.05).结论 MA与HIV-Tat蛋白的共同作用能够显著增加NMDA受体NR2B亚基和iNOS的表达,揭示NMDA受体NR2B亚基和iNOS参与了MA与HIV-Tat蛋白的协同神经毒性机制.

MA与HIV-Tat协同作用致大鼠相关脑区ROS、GSH-PX和SOD的变化

目的观察甲基苯丙胺(MA)与HIV-Tat蛋白协同作用致大鼠相关脑区活性氧(ROS)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和超氧化物歧化酶(SOD)的变化,探讨协同作用对神经系统的影响。方法 50只健康雄性SD大鼠随机分为实验组:MA组(10mg/kg MA,每日两次腹腔注射,连续4d)、HIV-Tat组(10μg HIV-Tat注入大鼠脑纹状体)和MA+HIV-Tat组(按MA组注射MA 4d后按HIV-Tat组注入HIV-Tat);对照组:生理盐水腹腔注射或纹状体内注射。各组大鼠分别于注射结束后48h和7d处死,取各脑区脑组织制作匀浆;荧光分光光度计检测ROS含量,酶标仪检测GSH-PX和SOD吸光度,再根据蛋白质的浓度分别计算其活力。结果各实验组与对照组比较,各脑区ROS含量有不同程度增高,GSH-PX和SOD活力则有不同程度下降,差异具有统计学意义(P<0.05);其中MA+HIV-Tat组与MA组和HIV-Tat组比较,ROS含量升高显著,GSH-PX和SOD活力下降明显(P<0.01)。结论 MA和HIV-Tat协同作用能够产生大量的ROS,并降低GSH-PX和SOD的活力,揭示ROS、GSH-PX和SOD参与了MA与HIV-Tat的协同神经毒性作用。

HIV-Tat蛋白诱导神经细胞自噬的研究进展

HIV-Tat蛋白是由HIV-1病毒感染细胞后分泌的反式转录激活因子,在HIV感染神经损害中发挥重要作用,是引起艾滋病相关脑病的重要致病因子。自噬即自我吞噬,主要作用是供给机体营养,但异常自噬则引起细胞死亡。HIV-Tat蛋白可以诱导神经细胞自噬,从而使细胞死亡,但引起自噬的机制及信号转导通路不清楚。本文主要从HIV-Tat蛋白诱导神经细胞自噬的机制、信号转导通路等方面进行综述,旨在为进一步研究HIV-Tat蛋白与细胞自噬的关系及寻找新的治疗药物靶点提供参考。

HIV-Tat蛋白转导域的研究进展

HIV-Tat蛋白转导域具有穿膜活性,能够将与之共价连接的多肽、蛋白、核酸等生物大分子快速而高效地转导入细胞内部,且对细胞无毒副作用,在药物转运及疾病治疗等领域有着广阔的应用前景。本文对HIV-Tat蛋白的结构、穿膜机制及转导域功能的应用作一综述。

HIV-Tat蛋白神经毒性机制的研究进展

HIV-Tat蛋白是人类免疫缺陷病毒-1型(HIV-1)基因编码的一种被称为反式转录激活因子,是HIV转录和复制所必须的一个很重要的调控蛋白。HIV感染细胞的早期即表达该蛋白,Tat蛋白能够由被感染细胞合成并释放到细胞外,脑脊液和血清中,能改变非感染细胞的结构和功能,特别是对神经元的结构与功能,从而促进艾滋病(AIDS)脑病的发生和发展,也就是说在中枢神经系统,HIV病毒对于神经系统的损伤多为间接损伤,主要依靠其合成蛋白,如Tat蛋白。Tat蛋白进入脑后,可以选择性地对中枢神经细胞产生毒性作用,引起神经元的凋亡,导致中枢神经系统发生病理性改变,如艾滋病痴呆(HAD)和艾滋病相关性脑炎(HIVE),然而HIV-Tat蛋白的神经毒性机制并不完全清楚。本综述将讨论HIV-Tat蛋白神经毒性及其可能的机制,为将来的研究和艾滋病脑病的防治提供更加有利的方向。

甲基苯丙胺与HIV-Tat蛋白协同损伤血脑屏障的研究进展

血脑屏障(blood brain barrier,BBB)是维持中枢神经系统(central nervous system,CNS)内外环境稳定的结构,在保护CNS免受外界危险因素刺激中发挥着重要作用。甲基苯丙胺(methamphetamine,METH)滥用对人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染者的BBB具有协同损害作用,极大提高了艾滋病相关神经认知障碍(HIV-associated neurocognitive disorders,HAND)及艾滋病痴呆(HIV-associated dementia,HAD)的发生率。现将对METH与HIV-Tat蛋白损伤BBB的研究进展进行综述,旨在为进一步研究两者协同损伤BBB提供参考,并为相关治疗药物的研发提供依据。

HIV-1转录延伸调控潜伏感染的分子机制

人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)作为获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的主要致病病原体,目前尚无有效治愈方法。现有的抗逆转录病毒疗法(ART)虽然可以有效抑制病毒复制,但却无法清除潜伏感染的细胞。因此,当前面临的主要挑战是找到安全、有效的方法清除HIV-1潜伏储存库。HIV-1潜伏维持和再激活分子机制的研究已经揭示了HIV-1转录延伸过程在其中所起的核心作用。本综述主要概述HIV-1转录延伸的具体分子过程以及对潜伏感染的调控作用,为进一步探究HIV-1如何实现潜伏和活跃转录之间的平衡提供理论支持,为实现AIDS治愈提供新方向。

甲基苯丙胺与HIV-1 Tat蛋白单独及协同诱导神经炎症机制的研究进展

甲基苯丙胺(methamphetamine,METH)滥用和人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染是当今世界面临的极其严重的公共卫生和社会问题。METH与HIV-1 Tat蛋白可单独及协同诱导神经毒性,而神经炎症是引起神经毒性的重要机制之一。神经炎症可由神经胶质细胞、细胞因子、NLRP3炎性小体等介导调控。该文综述了近年来METH与HIV-1 Tat蛋白单独及协同诱导神经炎症机制的研究进展,旨在为将来进一步探索两者协同诱导神经炎症的机制以及有效的药物干预靶点提供参考和依据。

HIV-1Tat基因的融合构建及在大肠杆菌中的高效表达

目的: 在E.coliBL21(DE3)中高效表达Tat蛋白。方法: 用PCR方法构建HIV- 1Tat基因全序列, 同时将Tat基因进行定点突变(AAG28替换为CAG, AAG50替换为CAG),以消除天然Tat蛋白的转录活性。将突变的Tat基因与伴侣10(chap10)基因连接后, 共同亚克隆入表达载体pET28a中,并在E.coli中表达, 表达产物用Westernblot进行鉴定。结果: 分别通过 3轮PCR, 成功地构建了Tat基因全序列。构建的重组质粒pET28a- chap10 Tat在E.coliBL21(DE3)中得到高效表达。Westernblot分析表明, 在相对分子质量 (Mr)为24 000处有 1条特异性的带。结论: chap10基因与HIV- 1Tat全基因的融合构建, 使Tat蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为其在爱滋病发病中作用研究奠定了基础。

我国HIV-1 B'/C重组流行株Tat蛋白的表达、纯化及功能分析

根据全国HIV分子流行病学研究发现,B'和C亚型HIV-1在我国发生了重组,并以优势株形式在我国广泛流行。为了探讨这种HIV-1B'/C重组毒株tat基因的变异与其表型之间的关系,利用pET表达系统在大肠杆菌中高效表达了三种不同基因变异类型的Tat蛋白,重组蛋白占菌体总蛋白的26%,Westernblot显示较好的反应原性,并通过金属鏊合层析纯化了目的蛋白。荧光素酶活性检测表明:体外表达的Tat蛋白具有明显的生物学活性,可以反式激活HIVLTR引导的报告基因的表达;三种Tat蛋白在激活活性上的差异与流行现场检测的病毒载量的高低存在明显的对应关系,说明tat基因的变异可以引起病毒生物学特性的改变,进而影响病毒的流行特征。此结果为进一步研究我国HIV重组毒株的基因变异特征及变异规律奠定了基础。

穿膜肽HIV Tat蛋白的研究进展

经数十年的研究发现HIV—ITat蛋白的转导域具有穿膜活性,能将外源性的生物学分子如多肽、寡核苷酸、DNA、蛋白、质粒甚至颗粒性物质携带入多种哺乳动物活细胞质膜及核膜,并且对细胞不会产生毒副作用。尽管其穿膜途径的具体机制,目前尚不十分清楚,但却不影响其在生命科学研究领域,包括基础研究和临床研究中的应用。HIV-ITat蛋白转导域的发现及应用,为生物学研究领域开辟了一条新的探索途径。

HIV-1 Tat蛋白对人类疱疹病毒8型复制的影响

用HindⅢ将HIV-1Tat101蛋白编码基因从pEV质粒中切出,BamHI、NotⅠ将绿色荧光蛋白(GFP)编码基因从表达质粒pcDNA3 1+/GFP中切出,分别插入到质粒LZRSpBMN-Z中,构建成重组反转录病毒表达质粒LZRS-Tat101和LZRS-GFP。采用磷酸钙转染法将两重组质粒转染到含反转录病毒env、gal和pol编码基因的包装细胞Phoenix(ΦNX)中,嘌呤霉素筛选获得稳定细胞系。分别收集稳定细胞系分泌的病毒上清,并感染体外培养的原发性渗出性淋巴瘤(PEL)BCBL-1细胞。收集LZRS-GFP重组病毒感染的BCBL-1细胞进行流式细胞计数,检测GFP表达水平。收集LZRS-Tat101重组病毒感染的BCBL-1细胞,提取蛋白作Westernblot,检测Tat蛋白表达状况;取细胞总RNA作Northernblot和定量PCR,检查HHV-8次要衣壳蛋白ORF26mRNA转录水平。重组LZRS-Tat101病毒进一步感染HL3T1细胞(HeLa细胞包含HIV-1-LTR/CAT报告基因),收集感染细胞提取蛋白,检测CAT活性,评价Tat生物学功能。PCR扩增HHV-8复制和转录激活蛋白Rta启动子区上游序列,并克隆至pGL-3载体中,构建Rta启动子+虫荧光素酶(Luciferase)报告基因重组质粒。此重组质粒进一步电转染预先感染了LZRS-Tat101病毒的BC-3细胞,TPA刺激后收集细胞,检测Luciferase活性。结果显示:①重组反转录病毒感染BCBL-1细胞,一次感染?

HIV-1 tat基因改造及其蛋白表达、纯化与抗体制备

目的:为了方便实验室工作中HIV-1B'/C亚型及C亚型Tat蛋白的检测,制备了相应的Tat蛋白及其抗体。方法:将我国HIV-1B'/C亚型流行株tat基因的第1个外显子和HIV-1C亚型tat基因的第2个外显子融合在一起,将密码子替换为大肠杆菌的优势密码子,通过合成引物、PCR拼接的方法,获得目的基因序列;在原核系统中与pET32a+载体中的His·Tag、Trx·Tag及S·Tag进行融合表达;目的蛋白经Ni+金属螯合层析柱纯化后,用于免疫家兔,制备多克隆抗体。结果:PCR拼接获得306bp的目的基因序列;在原核系统中融合表达得到相对分子质量约31000的融合蛋白,占菌体总蛋白的21%。纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备了多克隆抗体,Western印迹结果显示,获得的多克隆抗体与HIV-1B'/C亚型的Tat蛋白反应良好;间接免疫荧光结果表明,获得的多克隆抗体与HIV-1B'/C亚型和C亚型的Tat蛋白都能产生特异性反应。结论:制备的多克隆抗体能够使用间接免疫荧光方法检测HIV-1C亚型的Tat蛋白,使用Western印迹方法和间接免疫荧光方法都能检测HIV-1B'/C亚型的Tat蛋白。