替米沙坦对尿酸盐刺激下HK-2肾小管上皮细胞干预研究

目的基于过氧化物酶增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)途径探讨替米沙坦对尿酸盐刺激下HK-2肾小管上皮细胞的干预作用。方法培养HK-2肾小管上皮细胞,随机分为7组,分别为对照组(NC组)、模型组(UM组)、替米沙坦组(UT组)、罗格列酮组(UR组)、GW9662组(UG组)、替米沙坦+GW9662组(UTG组)和罗格列酮+GW9662组(URG组),除NC组应用培养液外,其余6组在NC组基础上均加入600μmol·L-1尿酸盐溶液培养。培养48 h。流式细胞仪检测HK-2细胞hUAT、PPAR-γ蛋白表达及细胞凋亡率;Q-PCR及Western blotting检测HK-2细胞人生电型尿酸盐转运蛋白(hUAT)、PPAR-γ、转化生长因子-β1(TGF-β1)、环氧合酶2(COX-2)、单核巨噬细胞因子-1(MCP-1)基因及蛋白表达。结果与NC组比较,尿酸盐刺激后UM组细胞凋亡率增加,hUAT及PPAR-γ蛋白阳性细胞率减少(P<0.05);与UM组比较,替米沙坦、罗格列酮均能减少细胞凋亡率及上调hUAT及PPAR-γ蛋白阳性细胞率(P<0.05),PPAR-γ抑制剂后联合替米沙坦、罗格列酮治疗,与UT组、UR组比较,细胞凋亡率增加,hUAT及PPAR-γ蛋白阳性细胞率减少(P<0.05);UTG组与URG组比较,差异无统计学意义(P>0.05);与UC组比较,UM组hUAT、PPAR-γmRNA及蛋白表达下降,TGF-β1、COX-2、MCP-1 mRNA及蛋白表达增高(P<0.05);与UM组比较,替米沙坦、罗格列酮能上调hUAT、PPAR-γmRNA及蛋白表达,下调TGF-β1、COX-2、MCP-1 mRNA及蛋白表达(P<0.05);PPAR-γ抑制剂后联合替米沙坦治疗,与UT组、UR组比较,hUAT、PPAR-γmRNA及蛋白表达降低,TGF-β1、COX-2、MCP-1 mRNA及蛋白表达升高(P<0.05);UTG组与URG组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论替米沙坦具有类似罗格列酮激活PPAR-γ受体机制,可通过PPAR-γ途径调节小管细胞凋亡、减少氧化应激及改善间质纤维化而发挥肾脏保护作用。

过表达线粒体蛋白磷酸酶2C对人肾小管上皮细胞转录组的影响

背景:课题组前期研究发现相较于野生型小鼠,线粒体蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase 2Cm,PP2Cm)基因缺失小鼠明显发生肾功能衰竭的症状,因此推测PP2Cm可能在肾脏纤维化发展过程中发挥重要保护作用,然而其分子机制尚不明确。目的:探究PP2Cm基因对于人肾小管上皮细胞转录组的影响。方法:培养人肾小管上皮细胞,用质粒将PP2Cm基因转染进入人肾小管上皮细胞,荧光定量PCR实验和Western blot实验检测细胞中PP2Cm的表达,随后分别提取细胞RNA进行转录组测序,寻找转染组和对照组之间的差异性表达基因,利用生物信息学方法进一步对所得的差异基因进行GO分析和KEGG分析。结果与结论:通过测序分析,与未转染空白细胞相比,在转染PP2Cm基因的人肾小管上皮细胞中存在796个差异性表达基因,其中553个下调基因,243个上调基因,GO分析结果显示,上调表达的基因显著富集在细胞生物合成过程、蛋白质翻译、内在凋亡信号通路等;下调表达的基因显著富集在内皮细胞增殖、细胞黏附等信号通路;KEGG分析结果显示,显著上调表达的基因富集在氨基酸代谢、生物合成等代谢相关信号通路;下调表达的基因显著富集在泛酸和辅酶A的生物合成等信号通路。结果表明,PP2Cm过表达可以影响肾小管上皮细胞的一系列生物学过程相关的多条信号通路,可能在氨基酸代谢、生物合成等代谢相关信号通路中起重要作用。

右美托咪定通过激活Nrf2/HO-1/GPX4通路抑制肾小管上皮细胞的铁死亡

目的 探讨右美托咪定(DEX)对Erastin诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)铁死亡的保护作用及其机制。方法 构建Erastin诱导的HK-2细胞铁死亡模型。将HK-2细胞分为对照组、Erastin模型组、Erastin+2.5μmol/L DEX组、Erastin+5μmol/L DEX组、Erastin+10μmol/L DEX组,采用CCK-8法检测细胞的存活率。将HK-2细胞分为对照组、Erastin模型组、Erastin+10μmol/L DEX组、Erastin+10μmol/L DEX+ML385(Nrf2抑制剂)组。采用CCK-8法检测细胞的存活率;使用细胞亚铁比色法测试盒检测细胞内Fe^(2+)水平的变化;应用流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)的含量;使用丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)试剂盒检测细胞中MDA及GSH含量;Western blotting检测细胞中核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶-1(HO-1)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)蛋白的表达。结果 与对照组相比,Erastin组的细胞存活率显著被抑制(P<0.001),同时细胞中GSH含量降低(P<0.001),Fe^(2+)、ROS以及MDA含量升高(P<0.001);与Erastin组相比,Erastin+10μmol/L DEX组的细胞存活率明显升高(P<0.001),10μmol/L DEX显著升高细胞中GSH含量(P<0.001),显著降低Fe^(2+)、ROS以及MDA含量(P<0.001),并且显著上调细胞中Nrf2、HO-1和GPX4蛋白的表达(P<0.001)。使用ML385后,Nrf2/HO-1/GPX4通路被抑制(P<0.001),细胞存活率降低(P<0.001),GSH含量降低(P<0.001),而Fe^(2+)、ROS以及MDA含量升高(P<0.05)。结论 DEX对Erastin诱导的HK-2细胞铁死亡具有保护作用,其机制可能是通过激活Nrf2/HO-1/GPX4通路实现抗氧化应激从而抑制铁死亡。

丹参酮Ⅱ_(A)对尿酸诱导的HK-2细胞凋亡及肾小管上皮细胞-间充质转分化的影响

目的:探讨尿酸诱导HK-2细胞纤维化后丹参酮Ⅱ_(A)对细胞增殖、凋亡及肾小管上皮细胞-间充质转分化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的影响。方法:体外培养HK-2细胞,分为4组:正常对照组、模型组、DMSO组、丹参酮Ⅱ_(A)组。观察各组细胞形态,并用CCK-8法检测各组细胞活力,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,免疫荧光及Western Blot检测各组EMT标志性蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。结果:与正常对照组比较,模型组及DMSO组细胞形态发生明显改变,细胞活力显著降低,细胞凋亡比例显著升高,E-cadherin蛋白表达显著降低,α-SMA蛋白表达显著升高(P<0.05);与模型组及DMSO组比较,丹参酮Ⅱ_(A)组细胞形态得到明显改善,细胞活力显著增强,细胞凋亡比例显著降低,E-cadherin蛋白表达显著升高,α-SMA蛋白表达显著降低(P<0.05);模型组与DMSO组比较各项检测指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论:丹参酮Ⅱ_(A)能抑制尿酸的诱导HK-2细胞凋亡,并通过上调E-cadherin的表达,下调α-SMA的表达,缓解尿酸的诱导HK-2细胞EMT,从而起到抗肾纤维化的作用。

雷公藤甲素诱导自噬促进人肾小管上皮HK-2细胞凋亡

目的研究自噬在雷公藤甲素(triptolide,TP)诱导人肾近端小管上皮HK-2细胞凋亡中的作用。方法以HK-2细胞为研究对象,CCK-8法检测细胞存活率;倒置荧光显微镜观察细胞形态变化;流式细胞术检测细胞凋亡率和线粒体膜电位MMP变化;激光扫描共聚焦显微镜观察细胞内LC3荧光强度变化;Western blot检测细胞凋亡及自噬相关蛋白cleaved caspase 9、caspase 9、Bax、Bcl-2、LC3、p62和Beclin 1的表达;采用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)和自噬激动剂雷帕霉素(rapamycin,Rap)研究自噬对TP诱导HK-2细胞凋亡的影响。结果TP降低HK-2细胞存活率,诱导细胞凋亡和自噬,降低MMP水平,增加胞内LC3Ⅱ荧光强度,上调Beclin 1表达,下调p62表达,升高cleaved caspase 9/caspase 9、Bax/Bcl-2和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值。此外,与TP组相比,3-MA+TP组细胞内LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和cleaved caspase 9/caspase 9比值降低,p62表达上升,细胞增殖的抑制作用和促凋亡作用减弱。相反,与TP组相比,Rap+TP组细胞内LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和cleaved caspase 9/caspase 9比值上升、p62表达下降,细胞增殖的抑制作用和促凋亡作用增强。结论TP能够诱导HK-2细胞发生自噬和线粒体途径介导的细胞凋亡,抑制HK-2细胞自噬可降低TP诱导细胞凋亡的发生,因此抑制自噬可能是减轻TP肾毒性的有效干预策略。

杨桃根DMDD对高糖诱导的肾小管上皮细胞HK-2内质网应激IRE1α通路及炎症反应的抑制作用

目的研究杨桃根活性成分2-十二烷基-6-甲氧基-2,5-二烯-1,4-环己二酮(DMDD)对高糖诱导肾小管上皮细胞HK-2内质网应激及炎症反应的抑制作用。方法体外培养HK-2细胞,并分为正常组、高糖组、内质网应激抑制剂4-PBA组(5 mmoL·L^(-1))和DMDD高、中、低浓度组(8、4、2μmol·L^(-1))。各组细胞培养结束后,采用CCK-8法检测细胞存活率;ELISA检测细胞上清液中TNF-α、IL-6的水平;AO/EB染色法检测细胞凋亡;Western blot法检测细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达水平、内质网应激标志蛋白GRP78、CHOP的表达水平以及IRE1α通路相关蛋白(IRE1α、JNK)的磷酸化水平。结果与高糖组比较,DMDD各浓度组细胞存活率明显升高;TNF-α、IL-6水平,Bax/Bcl-2、GRP78、CHOP蛋白表达水平和IRE1α、JNK蛋白磷酸化水平均明显降低,细胞中橙红色荧光明显减少。结论DMDD可能部分通过抑制内质网应激及IRE1α通路相关蛋白的表达,减少炎症反应,达到HK-2细胞的保护作用。

枸杞多糖通过激活Nrf2/HO-1通路保护HK-2细胞氧化损伤的作用

目的分析枸杞多糖(LBP)干预对氧化损伤的人肾小管上皮细胞(HK-2)内的核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素氧合酶-1(HO-1)通路蛋白表达的变化,探索LBP拮抗HK-2细胞氧化损伤的分子机制。方法采用过氧化氢诱导HK-2细胞制备氧化损伤细胞模型,HK-2被分成4组:正常组、LBP组、氧化损伤组及LBP干预组。观察4组细胞的长势和形态变化;细胞活力测定法比较每组细胞的存活率;比色法分析氧化产物丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)的水平;免疫印迹技术检测细胞内Nrf2/HO-1通路蛋白Nrf2、HO-1的相对水平。结果正常组和LBP组相比,两组的细胞长势、形态和存活率,细胞产生MDA的量、SOD和GSH-Px的水平,通路蛋白Nrf2、HO-1的相对水平均无明显差异(均P>0.05);氧化损伤组和正常组相比,细胞皱缩变圆并脱落、贴壁细胞变少,存活率减少、MDA量增加、SOD和GSH-Px降低,通路蛋白Nrf2、HO-1的相对值下降(均P<0.05);LBP干预组和氧化损伤组相比,细胞长势、形状恢复、贴壁细胞较多,存活率增加、MDA量减少、SOD和GSH-Px升高,通路蛋白Nrf2、HO-1的相对值升高(均P<0.05)。结论枸杞多糖能通过激活Nrf2/HO-1通路提高HK-2细胞的抗氧化酶活性达到减轻细胞氧化损伤的目的。

人环状RNA_0114428对脂多糖诱导的人肾小管上皮HK-2细胞损伤的作用及其机制

目的:探讨人环状RNA_0114428(circ_0114428)对脂多糖(LPS)诱导的人肾小管上皮HK-2细胞损伤的作用,阐明circ_0114428通过调节微小RNA-139-5p(miR-139-5p)/转化生长因子β受体2(TGFBR2)轴改善HK-2细胞损伤的可能分子机制。方法:体外培养HK-2细胞,双荧光素酶报告基因实验验证miR-139-5p与circ_0114428和TGFBR2的靶向调控关系,CCK-8法筛选合适的LPS干预浓度和时间。给予10 mg·L^(-1) LPS干预12 h构建HK-2细胞损伤模型,HK-2细胞分为对照组、LPS组、LPS+circ_0114428沉默对照(LPS+si-NC)组、LPS+circ_0114428沉默(LPS+si-circ_0114428)组、LPS+circ_0114428沉默+miR-139-5p抑制剂对照(LPS+si-circ_0114428+in-NC)组和LPS+circ_0114428沉默+miR-139-5p抑制剂(LPS+si-circ_0114428+in-miR-139-5p)组,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组细胞中circ_0114428、miR-139-5p和TGFBR2 mRNA表达水平,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blotting法检测各组细胞中TGFBR2、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组细胞上清液中白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL^(-1)β)水平。结果:双荧光素酶报告基因实验,miR-139-5p与circ_0114428和TGFBR2存在靶向调控关系(t=10.171,P<0.05;t=7.682,P<0.05)。CCK-8法检测LPS干预的最佳浓度为10 mg·L^(-1),最佳干预时间为12 h。与对照组比较,LPS组HK-2细胞中circ_0114428表达水平、TGFBR2 mRNA和蛋白表达水平、Bax蛋白表达水平、细胞凋亡率及细胞上清液中IL-6、TNF-α和IL^(-1)β水平均明显升高(P<0.05),miR-139-5p表达水平和Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。与LPS+si-NC组比较,LPS+si-circ_0114428组HK-2细胞中circ_0114428表达水平、TGFBR2 mRNA和蛋白表达水平、Bax蛋白表达水平、细胞凋亡率及细胞上清液中IL-6、TNF-α和IL^(-1)β水平均明显降低(P<0.05),miR-139-5p表达水平和Bcl-2蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。与LPS+si-circ_0114428+in-NC组比较,LPS+si-circ_0114428+in-miR-139-5p组HK-2细胞中circ_0114428表达水平、TGFBR2 mRNA和蛋白表达水平、Bax蛋白表达水平、细胞凋亡率及细胞上清液中IL-6、TNF-α和IL^(-1)β水平均明显升高(P<0.05),miR-139-5p表达水平和Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论:circ_0114428能减轻LPS诱导的HK-2细胞损伤,其作用机制可能与调节miR-139-5p/TGFBR2轴有关。

氨磷汀通过上调PKM2表达增强肾近端小管上皮细胞抵抗顺铂毒性

目的探究氨磷汀缓解顺铂肾毒性的分子机制。方法在肾近端小管上皮细胞系HK-2及原代细胞中,采用CCK-8细胞活性实验检测氨磷汀对顺铂细胞毒性的抑制作用。通过在线数据库tabula-muris分析肾脏组织各细胞亚群PKM2的表达。通过流式细胞术检测细胞凋亡比例。通过荧光定量PCR和蛋白免疫印迹实验检测细胞中PKM2基因表达。通过小RNA干扰技术敲低细胞中PKM2基因表达。结果氨磷汀显著增强HK-2细胞和原代肾近端小管上皮细胞抵抗顺铂的毒性。在顺铂处理的细胞中,随着氨磷汀浓度的增加,细胞的活力从0.37增加到0.45至0.77(P<0.001)。另外,随着氨磷汀浓度的增加,HK-2细胞中PKM2基因表达依次增加,在1μmol/L浓度时增加到8.76倍(P<0.001)。在HK-2细胞中干扰PKM2基因表达,氨磷汀对顺铂的细胞毒性的保护作用显著受到抑制。顺铂诱导的细胞凋亡比例、标志蛋白Cleaved-PARP和Cleaved-caspase3的表达被氨磷汀显著抑制。单细胞数据分析的结果表明,相对于肾脏组织其他细胞亚群,PKM2在肾近端小管上皮细胞中表达最低。结论氨磷汀通过上调肾近端小管上皮细胞PKM2的表达抑制顺铂诱导的细胞凋亡,从而缓解顺铂的细胞毒性。

线粒体未折叠蛋白反应在棕榈酸诱导肾小管上皮细胞脂质聚集中的作用

目的探讨线粒体未折叠蛋白反应(mitochondrial unfolded protein reaction,UPR^(mt))对肾小管上皮细胞(human kidney 2,HK-2)脂代谢的影响。方法采用棕榈酸(palmitic acid,PA)诱导HK-2细胞内脂质聚集,分别予siRNA抑制UPR^(mt)或巴多索隆(the 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic acid,CDDO)增强UPR^(mt)。油红染色观察细胞内脂质聚集情况,线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)测定线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP),Mito-SOX测定线粒体内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量,Western blotting检测HSP60、LONP1、CLPP、ACOX1、PPARα、PGC1α、CPT1α蛋白表达。结果PA诱导HK-2细胞脂质聚集、MMP降低、ROS产生增多及UPR^(mt)关键蛋白HSP60、LONP1表达降低;抑制UPR^(mt)可加剧PA导致的脂质聚集、MMP降低、ROS产生增多,HSP60、LONP1表达进一步降低;增强UPR^(mt)可缓解PA导致的脂质聚集、MMP降低、ROS产生增多以及HSP60、LONP1表达降低。结论PA诱导的HK-2细胞脂质聚集可能与线粒体功能障碍有关,UPR^(mt)在该过程中对HK-2细胞具有保护作用。

过表达Sirt3通过Keap1/Nrf2通路调控高糖应激诱导的肾小管上皮细胞衰老

目的:本研究拟观察过表达沉默信息调节因子3(silent information regulator 3,Sirt3)对高糖(high glucose,HG)诱导的肾小管上皮细胞应激性衰老的影响,并进一步探究过表达Sirt3对Kelch样ECH关联蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)/核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)通路活性的影响,探讨其可能的作用机制。方法:本研究以HK-2细胞为模型,应用质粒转染过表达Sirt3,采用ML385(Nrf2特异性抑制剂)阻断Keap1/Nrf2通路,按照预定细胞分组给予不同刺激,Western blot法检测Sirt3、Keap1、Nrf2、衰老相关蛋白P16和P21蛋白的表达,DCHF-DA标记法检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的积聚,衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-Gal)染色法检测细胞衰老状况。结果:(1)与正常糖对照组相比,高糖刺激48 h后,衰老相关蛋白P16和P21的水平显著升高(P<0.05);与高糖+空载质粒转染对照组相比,过表达Sirt3后,P16和P21的表达明显降低(P<0.05),SA-β-Gal阳性细胞减少,且显著逆转高糖环境下HK-2细胞内ROS的蓄积。(2)与正常糖对照组相比,高糖环境下HK-2细胞中Nrf2、醌氧化还原酶1(NADPH quinone oxidore-ductase 1,NQO1)蛋白水平降低,Keap1蛋白表达水平升高(P<0.05);与高糖+空载质粒转染对照组相比,转染Sirt3质粒后,Nrf2及其下游蛋白NQO1的表达增加,同时核Nrf2的表达显著增加(P<0.05)。(3)进一步应用ML385抑制Keap1/Nrf2通路活性,结果显示,与高糖+转染Sirt3质粒组相比,加入ML385后Nrf2、NQO1和血红素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)蛋白表达降低,衰老相关蛋白P16和P21的表达明显升高(P<0.05)。结论:高糖环境下,过表达Sirt3可通过上调Keap1/Nrf2通路的活性,促进Nrf2向细胞核易位,减少细胞内ROS蓄积,从而减轻应激性衰老。

穿心莲内酯减轻脂多糖诱导的肾小管上皮细胞铁死亡机制

目的探讨穿心莲内酯(AG)对脂多糖(LPS)诱导的脓毒症肾小管上皮细胞(HK-2细胞)铁死亡的影响及其作用机制。方法采用LPS处理HK-2细胞,模拟脓毒症HK-2损伤体外模型,进一步用5、10、20、40μmol/L的AG进行干预,将细胞随机分为对照组(Control)、LPS组、LPS+二甲亚砜(DMSO)组、AG组。采用CCK-8法检测细胞活力,筛选出最适LPS和AG浓度;比较各组中细胞形态变化,肾损伤标志物中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)和肾损伤分子-1(KIM-1)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和活性氧(ROS)水平,以及铁死亡调控蛋白溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)和铁蛋白(Ferritin)的表达水平,评估AG处理对细胞的保护作用。结果与Control组相比,10μg/mL LPS诱导的HK-2细胞中细胞活力及GSH含量下降,细胞皱缩、贴壁能力差,氧化产物MDA和ROS含量以及肾损伤标志物NGAL和KIM-1水平明显升高,SLC7A11、GPX4蛋白表达水平降低,Ferritin蛋白表达水平增高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。而在使用AG干预后,与LPS组相比,细胞活力升高,GSH含量、SLC7A11和GPX4蛋白表达水平升高,而Ferritin蛋白表达水平降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);MDA含量和ROS荧光强度以及肾损伤标志物NGAL和KIM-1水平下降,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论AG对LPS诱导的HK-2细胞损伤具有保护作用,其机制可能是激活SLC7A11/GPX4通路,减少氧化应激,上调抗氧化酶活性,减轻细胞铁死亡。

tRF-1:30对高糖诱导的肾小管上皮细胞炎性因子表达的影响

目的探讨tRF-1:30(tRF-1:30-Gln-CTG-4)对高糖(HG)诱导的肾小管上皮细胞(RTECs)中炎性因子表达的影响及分子机制。方法将小鼠RTECs分为Control组、HG组、HG+tRF-1:30 mimic组、HG+tRF-1:30 NC组、HG+si-IKZF2组(IKAROS家族锌指2,tRF-1:30抑制剂)、HG+si-NC组。实时荧光定量PCR检测tRF-1:30、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和IKZF2 mRNA的水平。酶联免疫吸附试验检测炎性因子水平,Western blot检测IKZF2蛋白表达水平,双萤光素酶报告实验验证tRF-1:30和IKZF2的关系。结果在HG诱导的RTECs中炎性因子的表达水平显著升高,而tRF-1:30表达水平显著降低。过表达tRF-1:30显著降低HG诱导的RTECs中炎性因子的表达水平。IKZF2在HG诱导的RTECs中显著高表达,进一步敲低IKZF2可抑制炎性因子的释放,而过表达tRF-1:30后IKZF2的表达水平下调。双萤光素酶报告实验进一步验证tRF-1:30与IKZF2可能存在靶向关系。结论过表达tRF-1:30可能通过负向调控IKZF2的表达进而抑制HG诱导的RTECs炎性因子的释放。

槐杞黄通过激活Nrf2/HO-1信号通路减轻高糖诱导的HK-2细胞氧化应激

目的:探讨槐杞黄(HQH)是否通过激活Nrf2/HO-1信号通路减轻高糖诱导的HK-2细胞氧化应激。方法:将HK-2细胞随机分为:正常组、渗透压对照组、高糖组、槐杞黄组和卡托普利组。采用CCK-8法检测细胞活力;荧光探针检测ROS水平;试剂盒检测SOD活性、MDA和GSH含量;免疫荧光法检测Nrf2的表达;qRT-PCR法检测IL-6、IL-1β和TNF-α以及Nrf2/HO-1 mRNA表达水平;Western blot法检测Nrf2/HO-1通路的表达。结果:与正常组比较,高糖组细胞存活率明显降低(P<0.0001);细胞中ROS、MDA含量升高(P<0.0001),SOD和GSH活性降低(P<0.0001);Nrf2的表达降低;IL-6、IL-1β和TNF-αmRNA表达量均明显升高(P<0.001);Nrf2/HO-1蛋白和mRNA表达量明显减少(P<0.001);与高糖组相比,槐杞黄组细胞存活率明显升高(P<0.05);细胞中ROS、MDA含量明显降低(P<0.0001),SOD和GSH活性升高(P<0.01);Nrf2的表达增加;IL-6、IL-1β和TNF-αmRNA表达量明显降低(P<0.01);Nrf2/HO-1蛋白和mRNA表达量均明显升高(P<0.01)。结论:槐杞黄可能通过激活Nrf2/HO-1信号通路,提高机体抗氧化水平,改善高糖诱导的HK-2细胞氧化损伤。

葛根异黄酮调控LncRNA TTTY15对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响

目的探讨葛根异黄酮对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响与机制。方法采用高糖诱导人肾小管上皮细胞HK-2建立糖尿病肾病模型,随机分为NG组、HG组、HG+葛根异黄酮L组、HG+葛根异黄酮M组、HG+葛根异黄酮H组、HG+si-NC组、HG+si-TTTY15组、HG+葛根异黄酮+pcDNA组、HG+葛根异黄酮+pcDNA-TTTY15组;噻唑蓝(MTT)法、流式细胞术分别检测细胞增殖及凋亡;利用试剂盒检测超氧化物歧物酶(SOD)活性与丙二醛(MDA)水平;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-10水平;qRT-聚合酶链反应(PCR)法检测TTTY15表达量。结果与NG组比较,HG组细胞增殖抑制率和细胞凋亡、TTTY15表达及MDA、TNF-α、IL-1β水平显著升高,SOD活性和IL-10水平显著降低(P<0.05);与HG组比较,HG+葛根异黄酮L组、HG+葛根异黄酮M组、HG+葛根异黄酮H组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率降低、TTTY15表达量及MDA、TNF-α、IL-1β水平显著降低,SOD活性和IL-10水平显著升高(P<0.05),且呈剂量依赖性;与HG+si-NC组比较,HG+si-TTTY15组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率及MDA、TNF-α、IL-1β水平显著降低,SOD活性和IL-10水平显著升高(P<0.05);与HG+葛根异黄酮+pcDNA组比较,HG+葛根异黄酮+pcDNA-TTTY15组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率及MDA、TNF-α、IL-1β水平显著升高,SOD活性和IL-10水平显著降低(P<0.05)。结论葛根异黄酮可通过抑制TTTY15表达而促进细胞增殖及抑制细胞凋亡、氧化应激、炎症反应从而减轻高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤。

iPLA2β通过调控铁死亡减轻高糖诱导的人肾小管上皮细胞损伤

目的探讨钙离子非依赖型磷酸酯酶A2β(iPLA2β)在高糖诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)中的表达,iPLA2β与铁死亡的关系以及iPLA2β对高糖诱导的HK-2细胞损伤的保护机制。方法用30 mmol/L葡萄糖刺激HK-2细胞,iPLA2β质粒转染构建过表达模型,铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)和铁死亡激活剂erastin作为铁死亡对照组。干预36 h后,试剂盒检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、铁含量,DCF免疫荧光检测细胞内活性氧(ROS)水平。Western blot法检测铁死亡指标ACSL4、GPX4、LPCAT3、TFR1的表达。结果高糖刺激可以降低HK-2细胞内iPLA2β的表达,HK-2细胞内ROS、MDA水平升高,GSH、SOD水平降低。Western blot结果显示ACSL4、LPCAT3、TFR1表达增高,GPX4表达降低。Fer-1干预后上述指标改善。过表达iPLA2β后,可降低KIM-1表达,减轻HK-2细胞损伤。进一步研究发现,过表达iPLA2β后可抑制高糖诱导的HK-2细胞的氧化应激和铁死亡。另外,erastin减弱了iPLA2β对高糖诱导的HK-2细胞损伤的保护作用。结论iPLA2β通过调控铁死亡减轻高糖诱导的HK-2细胞损伤。

右美托咪定通过SIRT3去乙酰化TFAM对HK-2细胞缺血再灌注损伤的影响

目的:探讨右美托咪定(Dex)通过沉默信息调节因子2相关酶3(SIRT3)去乙酰化线粒体转录因子A(TFAM)对肾小管上皮细胞(HK-2)缺血再灌注损伤(IRI)的影响。方法:人HK-2细胞株分为对照组、缺血再灌注(I/R)组、Dex组、SIRT3抑制剂(3-TYP)组及Dex+3-TYP组。除对照组外,其余各组均制备I/R模型,Dex组、3-TYP组及Dex+3-TYP组分别在I/R制备前分别给予Dex、3-TYP及Dex+3-TYP处理;I/R组及对照组在建模前加入等量生理盐水处理。观察各组细胞培养24h、48h的活性,检测细胞炎症因子[白介素细胞6(IL-6)、IL-8、IL-10]水平。提取线粒体,检测活性氧(ROS)、线粒体膜电位(MMP)、线粒体通透性转换孔(mPTP)开放程度及线粒体DNA(mtDNA)数量。免疫共沉淀(Co-IP)验证SIRT3与TFAM是否相互作用。结果:I/R模型建立后,IL-6、IL-8、ROS水平及TFAM乙酰化水平均升高,细胞活力(24/48h的OD值)、IL-10、MMP、mPTP、mtDNA水平及SIRT3表达均下降(P<0.05);I/R模型经3-TYP干预后上述变化加重(P<0.05);Dex干预I/R模型后,细胞活力增加,IL-10、MMP、mPTP、mtDNA水平及SIRT3表达均升高,IL-6、IL-8、ROS水平及TFAM乙酰化水平均下降(P<0.05);3-TYP与Dex共干预后Dex作用减弱(P<0.05);Co-IP验证结果显示SIRT3与TFAM均被沉淀,二者存在相互作用。结论:SIRT3去乙酰化TFAM参与Dex减轻HK-2细胞缺血再灌注损伤的过程。

Clusterin抑制人肾近曲小管上皮HK-2细胞的凋亡

Clusterin是一种硫酸糖蛋白.最近研究发现,clusterin具有抗凋亡作用,同时对肾细胞具有保护作用,但抗凋亡的具体机制仍不清楚.为研究clusterin及其不同功能区域在人肾近曲小管上皮HK-2细胞中的抗凋亡作用,构建了含有全长及缺失前导序列的clusterin重组质粒(分别命名为pIRES2-EGFP/cluac和pIRES2-EGFP/clubc).将重组质粒转染人肾近曲小管上皮HK-2细胞后,检测转染细胞中clusterin的表达及其抗Na2SeO3(10μmol/L)诱导的凋亡作用.Western印迹显示,转染pIRES2-EGFP/cluac的HK-2细胞培养上清及细胞裂解液中均可检测到clusterin蛋白表达,但转染pIRES2-EGFP/clubc的HK-2细胞仅在裂解液中检测到clusterin,在培养上清液中未检测到该蛋白表达.流式细胞术检验显示,HK-2/clubc细胞实验组出现明显凋亡峰,而HK-2/cluac细胞组则未见凋亡;两组的凋亡百分率之间也存在显著性差异(P<0.05).以Cy3标记的Annexin V染色后于荧光显微镜下观察细胞凋亡情况与FCM检测结果基本一致.上述结果证明,clusterin有明显的抑制人肾近曲小管上皮HK-2细胞凋亡的作用;clusterin前导序列是其发挥抗凋亡作用的必需功能区域,提示clusterin抗凋亡作用是通过细胞外途径产生的.

六味地黄汤通过miR-210/HIF-1α信号通路对CoCl_(2)诱导的HK-2细胞上皮间质转化的影响和机制研究

目的观察六味地黄汤(Liuwei Dihuang Decoction,LWDHD)调控miR-210/HIF-1α信号通路对CoCl_(2)诱导的HK-2细胞上皮间质转化(epithelial mesenchymal transdifferentiation,EMT)的作用和机制。方法体外培养HK-2细胞,分对照组(N组)、模型组(M组)、LWDHD血清组(LW组)、空白血清+miR-210过表达组(LV-miR-210组)、空白血清+mi R-210沉默组(LV-antimi R-210组)、空白血清+miR-210阴性对照组(LV-miR-210 NC组)、LWDHD血清+miR-210过表达组(LW+LV-miR-210组)、LWDHD血清+mi R-210沉默组(LW+LV-anti-miR-210组)、LWDHD血清+miR-210阴性对照组(LW+LV-miR-210 NC组),除N组外,其他各组加入CoCl_(2)处理。CCK-8法检测不同浓度LWDHD、CoCl_(2)在24 h后对HK-2细胞活性的影响并选择最佳干预浓度。细胞免疫荧光和Western blot法检测各组HK-2细胞中缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、β-联蛋白(β-catenin)、波形蛋白(Vimentin)、上皮钙黏素(E-cadherin)蛋白表达情况;qPCR法检测miR-210、HIF-1α、β-catenin、Vimentin m RNA表达情况。通过慢病毒感染HK-2细胞,实现miR-210的过表达和抑制,并加入CoCl_(2),观察miR-210、HIF-1α、β-catenin、Vimentin蛋白和mRNA表达以及LWDHD的干预作用。结果CCK-8结果显示,LWDHD、CoCl_(2)最佳干预浓度分别为10%、200μmol/L。与N组相比,M组细胞形态由铺路石样向长梭形改变,HIF-1α、β-catenin、Vimentin蛋白和mRNA表达升高(P<0.05,P<0.01),mi R-210m RNA表达升高(P<0.01),E-cadherin蛋白表达降低(P<0.01);与M组相比,LW组HIF-1α、β-catenin、Vimentin蛋白和mRNA表达降低(P<0.05,P<0.01),miR-210 mRNA表达降低(P<0.05),E-cadherin蛋白表达升高(P<0.01)。与LV-miR-210 NC组相比,LVanti-miR-210组HIF-1α、β-catenin、Vimentin蛋白和mRNA表达降低(P<0.05,P<0.01);与LV-miR-210 NC组相比,LV-miR-210组HIF-1α、β-catenin、Vimentin蛋白和mRNA表达升高(P<0.05,P<0.01)。在慢病毒转染各组的基础上,加入LWDHD处理后,LWDHD可降低各组HIF-1α、β-catenin、Vimentin蛋白和mRNA表达(P<0.05,P<0.01)。结论LWDHD抗纤维化作用机制与其下调miR-210/HIF-1α信号通路,抑制肾小管EMT有关。

化合物21(C21)抑制晚期糖基化终产物刺激引起的大鼠肾小管上皮细胞的细胞因子分泌

目的研究2型血管紧张素Ⅱ受体(AT2R)激动剂化合物21(C21)对晚期糖基化终产物(AGE)刺激的NRK-52E大鼠近端肾小管上皮细胞分泌的细胞因子的影响及潜在机制。方法培养NRK-52E细胞,分为正常对照组和(25、50、100、200)mg/L AGE-牛血清白蛋白(BSA)刺激组。培养48 h后收集细胞,采用实时定量PCR检测NRK-52E细胞白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA的表达。间接ELISA检测细胞培养上清液中的IL-6、TNF-α蛋白水平。然后先用25 mg/L AGE-BSA刺激NRK-52E细胞48 h后分别给予(0.01、0.05、0.1)mmol/L C21分别处理24 h,采用实时定量PCR检测细胞蛋白激酶C(PKC)、核因子κB p65(NF-κB p65)及转化生长因子β1(TGF-β1)mRNA的表达,Western blot法检测细胞中PKC、NF-κB p65、TGF-β1蛋白表达。结果不同剂量的AGE-BSA刺激NRK-52E细胞均可明显增加IL-6、TNF-α的mRNA表达,而以25 mg/L AGE-BSA刺激NRK-52E细胞时,其IL-6、TNF-α的蛋白分泌增加更明显。以25 mg/L AGE-BSA刺激NRK-52E细胞48 h后,(0.01、0.05、0.1)mmol/L C21分别处理24 h,均可显著抑制AGE-BSA所诱导的NRK-52E细胞PKC、NF-κB p65及TGF-β1 mRNA和蛋白的表达。结论AGE-BSA促进NRK-52E细胞IL-6、TNF-α、PKC、NF-κB p65及TGF-β1表达,C21则抑制其作用。