UPLC-MS/MS研究抗肿瘤化合物HK-7在不同种属肝微粒体中的代谢稳定性和代谢酶表型

目的:应用体外肝微粒体孵育体系,研究抗肿瘤化合物HK-7在人、SD大鼠、昆明种小鼠、恒河猴和比格犬的肝微粒体中的代谢稳定性,确定HK-7在人肝微粒体中的代谢表型。方法:通过UPLC-MS/MS检测方法,测定在各个种属中孵育后的HK-7剩余浓度,考察它们的代谢稳定性及体外代谢动力学参数。采用化学抑制剂法预测HK-7在人肝微粒体中的代谢表型。结果:在人、SD大鼠、昆明种小鼠、恒河猴和比格犬的肝微粒体中,HK-7的体外代谢半衰期t1/2分别为44.91,83.42,72.70,48.93和66.21 min;体外固有清除率CLint分别为0.031,0.016,0.019,0.028和0.021 m L·min^(-1)·mg^(-1);在人肝微粒体中HK-7主要被细胞色素CYP2C9,CYP2E1和CYP3A4催化代谢。结论:HK-7在肝微粒体中的代谢存在种属差异,人肝微粒体中参与HK-7代谢的酶可能有CYP2C9,CYP2E1和CYP3A4,其中CYP2E1贡献最大。

止消通脉宁对TGF-β_1诱导的HK-2细胞Smad2、3、7 mRNA表达的影响

目的:探讨止消通脉宁对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)Smad 2、Smad 3、Smad 7的影响。方法:将HK-2细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基培养;实验分为6组:空白对照组、单纯TGF-β1诱导组(TGF-β110 ng/mL)、空白血清对照组(TGF-β110 ng/mL+10%空白血清)、中药含药血清低剂量组(TGF-β110 ng/mL+10%低剂量止消通脉宁含药血清)、中药含药血清中剂量组(TGF-β110 ng/mL+10%中剂量止消通脉宁含药血清)、中药含药血清高剂量组(TGF-β110 ng/mL+10%高剂量止消通脉宁含药血清)。药物干预24小时后,荧光定量PCR检测Smad 2、smad 3、Smad 7的mRNA表达。结果:HK-2细胞经TGF-β1诱导后,Smad 2、smad 3的mRNA表达显著上升,Smad 7的mRNA表达下降,与空白对照组相比有显著性差异(P<0.05),但经止消通脉宁含药血清干预后,Smad 2、smad 3的mRNA表达逐步下降,Smad 7的mRNA表达上调,与单纯TGF-β1诱导组相比有显著性差异(P<0.05)。而空白血清无此作用。结论:止消通脉宁能够调控TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞转分化Smad信号通路mRNA表达的作用,在一定程度上具有抑制肾间质纤维化的作用。

蛇葡萄素的抗肿瘤作用研究

目的:研究蛇葡萄素在体内外对肿瘤生长的抑制作用。方法:用MTT法测定蛇葡萄素对人鼻咽癌HK-1细胞和人乳腺癌MCF-7细胞的体外细胞毒实验;观察蛇葡萄素对C57BL/6小鼠移植性B16黑色素瘤的体内抑瘤作用;用流式细胞仪测定含药小鼠血清对B16细胞周期及细胞增殖的影响。结果:蛇葡萄素对人鼻咽癌HK-1细胞及人乳腺癌MCF-7细胞的IC50分别为50.0μg/ml及79.4μg/ml。在100mg/kg、150mg/kg及200mg/kg的剂量下,与生理盐水对照组比较,蛇葡萄素对C57BL/6小鼠移植性B16黑色素瘤的抑瘤率分别为25.54%(P<0.05)、32.03%(P<0.01)及54.55%(P<0.001);60mg/kg氮烯咪胺(阳性对照组)的抑瘤率为59.31%,与200mg/kg的药物组比较无显著性差异(P>0.05);在150mg/kg及200mg/kg蛇葡萄素腹腔给药后10min的小鼠含药血清的作用下,B16细胞的G1期和G2/M期细胞数增高,S期细胞数减少,分裂增殖指数分别降低19.1%及21.7%。结论:蛇葡萄素对体外肿瘤细胞HK-1和MCF-7的增殖,及体内小鼠移植性B16黑色素瘤的生长均具有显著的抑制作用。

草酸诱导HK-2细胞核苷酸结合寡聚化结构域样受体3炎症小体的激活在草酸钙肾结石形成中的作用及机制

目的探讨高浓度草酸作用于人肾小管上皮细胞HK-2后核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（NLRP3）炎症小体在草酸钙肾结石形成过程中的激活作用机制。 方法通过测定细胞培养基中乳酸脱氢酶（LDH）的含量、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色法分析草酸对HK-2细胞的毒性及损伤；使用相差显微镜观察高浓度草酸作用于HK-2细胞后细胞表面晶体黏附；通过Western blot法和实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）分别检测高浓度草酸作用于HK-2细胞后NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）及白细胞介素-1β（IL-1β）蛋白和mRNA表达量的影响，同时检测高浓度草酸作用于HK-2细胞后对透明质酸合酶1（HAS1）、透明质酸合酶2（HAS2）、透明质酸合酶3（HAS3）、骨桥蛋白（OPN）以及CD44 mRNA表达的影响，并采用二氯荧光黄二乙酸酯（DCFH-DA）检测活性氧自由基（ROS）；Western blot和FQ-PCR法分别检测使用ROS抑制剂N-乙酰基半胱氨酸（NAC）预处理HK-2细胞后高浓度草酸作用于细胞后NLRP3的蛋白及mRNA的表达水平变化；使用RNA干扰技术，将NLRP3-小干扰RNA（siRNA）和阴性对照（NC）转染HK-2细胞后，相差显微镜观察晶体黏附变化，FQ-PCR法分别检测HAS1、HAS2、HAS3、OPN以及CD44 mRNA表达水平变化。 结果使用不同浓度的草酸处理HK-2细胞24 h，测定LDH含量结果显示当草酸浓度为0.8 mmol/L时，细胞培养基中LDH开始比草酸浓度为0.6 mmol/L时显著增加[（528.37±25.65）比（300.55±17.18） mmol/L，P＝0.001]，DAPI染色法显示不同浓度草酸侧细胞数量分别为：55.67±3.30、52.33±6.13、52.33±2.05、58.00±9.09、50.00±1.63、47.33±2.05、33.67±3.30、20.33±2.05，当草酸浓度为1.0 mmol/L时，细胞数量开始比草酸浓度为0.8 mmol/L时明显减少（33.67±4.04比47.33±2.52，P＝0.008）；相差显微镜观察高浓度草酸＋一水草酸钙（COM）作用于HK-2细胞后晶体黏附数量明显多于对照组[（7.34±0.82）%比（5.29±0.73）%，P＝0.001]；高浓度草酸作用于HK-2细胞后24 h，通过Western blot和FQ-PCR发现，NLRP3、Caspase-1及IL-1β蛋白水平（1.82±0.04比1.00±0.02，P＝0.000；1.62±0.23比1.00±0.06，P＝0.021；1.37±0.16比1.00±0.18，P＝0.029）和mRNA表达（1.29±0.24比0.84±0.11，P＝0.011；2.16±0.29比1.04±0.14，P＝0.009；1.80±0.02比1.00±0.15，P＝0.002）均分别高于对照组，且HAS1、HAS2、HAS3、OPN以及CD44 mRNA（1.35±0.25比0.81±0.11，P＝0.049；2.46±0.29比0.84±0.14，P＝0.002；0.90±0.02比0.60±0.15，P＝0.039；1.68±0.27比1.00±0.22，P＝0.049；2.03±0.47比1.00±0.15，P＝0.040）表达水平亦均高于对照组；采用DCFH-DA检测ROS，发现草酸可引起细胞内发生氧化应激产生ROS（736.67±80.21比208.67±35.73，P＝0.001），并且ROS抑制剂NAC作用后NLRP3的蛋白表达水平明显降低（1.53±0.31比4.50±0.40，P＝0.001），而空白组与NAC组分别为0.90±0.10比1.00±0.26（P＝0.288）；与NC组比较，NLRP3-siRNA组细胞表面晶体黏附数量显著减少[（1.87±0.21）%比（3.57±0.12）%，P＝0.003]，且细胞内HAS1、HAS2、HAS3、OPN以及CD44 mRNA（1.06±0.07比2.44±0.47，P＝0.015；0.87±0.07比1.48±0.22，P＝0.021；1.24±0.16比1.72±0.10，P＝0.026；1.03±0.15比1.45±0.09，P＝0.026；0.63±0.07比1.31±0.12，P＝0.002）表达水平也明显下降。结论高浓度草酸通过HK-2细胞内ROS的产生激活NLRP3炎症小体，进而通过改变细胞表面黏附性来促进草酸钙肾结石的形成。