棉花HKT基因家族的全基因组分析

HKT(high-affinity K+transporter)转运蛋白在调节植物体内K+/Na+转运,参与逆境胁迫调控中发挥重要作用。本研究利用生物信息学方法,系统分析了棉花HKT基因家族的分类、系统进化树、组织表达以及HKT蛋白的亚细胞定位、跨膜结构、基序情况等。结果显示,棉花中共有8个HKT基因家族成员,编码的8个HKT蛋白都定位到了质膜上,具有7~10个不等的跨膜数;系统进化树分析结果表明,棉花8个HKT基因家族成员大致分为2个小组,在进化树上分支比较近的HKT基因家族成员编码的HKT蛋白具有完全相同或者比较类似的motif类型和跨膜数;组织表达分析发现,克劳茨基棉仅有Gr HKT1;1和Gr HKT1;2 2个成员在200 mmol/L的Na Cl溶液处理0 h、3 h、12 h、72 h和144 h后具有不同程度的响应。

水稻HKT基因家族密码子使用特性分析

运用CodonW程序对水稻HKT基因家族密码子组成、同义密码子使用频率和全长编码区密码子使用各项参数进行计算和统计分析。结果表明:密码子适应指数(CAI值)与最优密码子使用频率(FOP)、密码子偏爱指数(CBI)均呈极显著正相关(P<0.01);有效密码子数(ENC)与同义密码子第3位碱基含量(C3s,G3s)、最优密码子使用频率(FOP)、密码子偏爱指数(CBI)、GC含量、GC3s均呈极显著负相关(P<0.01)。水稻HKT基因家族密码子使用的相对频率(RSCU)值>1的密码子多以G或C结尾。

伊蚊3HKT基因RNAi载体构建及口服对伊蚊的致死作用

构建伊蚊3HKT基因的RNAi表达载体pMaa7IR/3HKTIR,转化莱茵衣藻,将得到的转基因藻株喂饲伊蚊幼虫。结果表明,3HKT RNAi转基因藻株对伊蚊有一定的致死作用。伊蚊是登革热、寨卡病毒病、黄热病、基孔肯雅病的媒介昆虫;微藻是蚊子幼虫天然食物,在自然界广泛存在,并且小球藻、衣藻等可大规模生产、生产成本低廉,因此,可长期将其大规模投放在封闭区域,形成优势藻种。本研究可为生物杀蚊,阻断登革热、寨卡病毒病等恶性传染病的流行提供新思路。

盐胁迫下野菊离子的吸收转运情况及相关基因的表达

明确抗盐能力不同的野菊(Chrysanthemum indicum)株系在盐胁迫情况下的离子分布运输情况及相关基因的变化规律,从更深层次上认识野菊的抗盐机理。以前期筛选的2个高抗株系(H1、H2)、2个中抗株系(M1、M2)和2个低抗株系(L1、L2)的扦插苗为试验材料,置于含有NaCl(浓度为150 mmol/L)的霍格兰营养液中进行盐胁迫处理。测定6个离子指标(根、茎、叶的钠、钾离子的质量分数),并计算各株系中根、茎、叶钾钠离子质量分数比值(w(K^(+))∶w(Na^(+)))和不同部位离子选择性运输能力(S_((K^(+),Na^(+)))),分析盐胁迫对抗盐能力不同的野菊株系各部位离子质量分数、比例及运输情况的影响。采用生物信息学方法对野菊进行Na^(+)和H^(+)逆向转运蛋白基因(NHX)家族成员和高亲和性钾离子转运蛋白基因(HKT)的鉴定。并利用qRT-PCR技术,测定盐胁迫下抗盐能力不同的野菊株系在根、茎、叶中NHX、HKT基因不同时间点的表达水平。研究结果表明:与对照组相比,野菊各株系根、茎、叶的Na^(+)质量分数显著增加(P<0.05),K^(+)质量分数及w(K^(+))∶w(Na^(+))值均显著降低(P<0.05);多数情况下,野菊高、中抗株系各部位间的S_((K^(+),Na^(+)))值高于对照组。随着株系抗盐能力的降低,根、茎和叶中的Na^(+)质量分数呈持续上升趋势,而K^(+)质量分数及w(K^(+))∶w(Na^(+))值则呈持续下降趋势,各部位间的S_((K^(+),Na^(+)))值均呈现先升高后下降的趋势。共鉴定出6个野菊NHX家族成员(CiNHX1-6),1个野菊HKT基因(CiHKT1)。在盐胁迫后,野菊CiNHX2基因在高抗株系根部的表达上调幅度明显高于低抗株系,而该基因在H1、H2株系根、茎部中有着相同的表达模式。同样,CiNHX4基因在高抗株系根、叶部的相对表达量也大幅上调,该基因在H1、H2株系根、叶部中有着相同的表达模式。CiNHX1、CiNHX3、CiNHX5、CiNHX6在各株系的根、茎、叶中的表达水平并无显著变化,且总体上表达水平较低,其中CiNHX3在根部的表达量略高,CiNHX1、CiNHX6在叶部的表达量略高。野菊CiHKT1基因在根、叶部的表达受盐胁迫的影响较为明显,高抗株系的相对表达量上调幅度明显。野菊抗盐能力越强,其离子吸收、转运、分布情况受盐胁迫影响越小;盐胁迫下高抗株系能有效地外排Na^(+)并选择性地吸收K^(+),稳定体内的离子质量分数与分布;中抗株系受胁迫影响相对较大,但可以通过选择性运输K^(+)来防止Na^(+)的过量对地上部分造成毒害。CiNHX2、CiNHX4、CiHKT1与野菊株系抗盐能力强弱密切相关,是野菊抵御盐胁迫的关键基因。

盐生植物和甜土植物HKT1基因密码子偏好性分析

HKT1是一种转运蛋白,能参与控制K^(+)/Na^(+)的选择性运输和K+的吸收,有助于提高植物的抗逆境能力。为研究盐生植物(盐角草、碱蓬和盐芥)与甜土植物(拟南芥、水稻和小麦)HKT1基因的特性与密码子偏好性,利用Codon W和EMBOSS程序分析3种盐生植物和3种甜土植物的HKT1基因密码子偏好性,并通过中性绘图和ENC绘图分析偏好性形成的可能因素,同时分别采用TBtools和MEGA7.0基于密码子使用频率和序列相似性进行聚类分析。结果表明,HKT1基因偏好性密码子有7个(RSCU>1),其中4个以U结尾,3个以A结尾,说明该基因偏好使用A和U结尾的密码子。盐生植物和甜土植物HKT1基因的ENC范围分别为44.95~55.39和52.22~52.96,其中除盐角草外的盐生植物HKT1基因的ENC均>50,基因密码子偏好性高于甜土植物;中性图谱和ENC图谱分析表明,基因的密码子偏好性受碱基突变的影响较大;RSCU和CDS的聚类分析表明,CDS序列聚类比RSCU值的聚类分析更能展现出不同物种的亲缘关系的远近。综上,盐生植物HKT1基因密码子偏好性较甜土植物强,这将为今后盐生植物和甜土植物HKT1基因的改造和功能验证研究提供一定参考。

六倍体小麦TaHKT2;2基因的克隆与多样性分析

为深入研究小麦HKT基因家族其他成员的作用,利用同源序列克隆技术和六倍体小麦基因组BAC文库克隆了小麦TaHKT2;2基因。TaHKT2;2定位于小麦第7同源群,分别命名为TaHKT2;2-7A、TaHKT2;2-7B、TaHKT2;2-7D。TaHKT2;2与TaHKT2;1基因结构相同,均由3个外显子和2个内含子组成。在系统进化树上TaHKT2;2与TaHKT2;1聚类形成1个分支。TaHKT2;2-7A、TaHKT2;2-7B、TaHKT2;2-7D的基因编码区分别为1 602 bp、1 602 bp、1 596 bp,但利用RTPCR技术未能在8个六倍体小麦中克隆TaHKT2;2-7D c DNA。采用克隆测序技术分析了12个六倍体小麦中TaHKT2;2的自然多样性,结果表明,TaHKT2;2-7A的序列多样性高于TaHKT2;2-7B和TaHKT2;2-7D。TaHKT2;2仅见少数碱基发生改变,在TaHKT2;2 P-loop区无氨基酸变异。TaHKT2;2 5'侧翼序列保守性低于其编码区。TaHKT2;2在小麦驯化过程可能受到选择,属于驯化基因。

节节麦HKT基因的克隆及生物信息学分析

高亲和性钾离子转运蛋白(high affinity K+transporter, HKT)是一类普遍存在于植物体内的离子转运载体,主要负责Na+运输或Na+-K+协同运输,在植物耐盐和维持体内离子稳态的过程中具有重要作用。为了挖掘和预测节节麦(Aegilops tauschii)中HKT基因的序列信息和功能,通过同源克隆技术,从节节麦中获得了HKT基因,命名为AsHKT (GeneBank:MH457099),并对其基因序列及编码蛋白的结构、理化特性和功能进行了生物信息学分析,结果表明,AsHKT基因的CDS (Coding sequence)序列长度为1 527 bp,最长开放读码框位于1~1 527 bp处,共编码508个氨基酸,分子式为:C2535H4052N662O705S29,蛋白分子量约为56.01 kD,是疏水性蛋白,结构稳定,有明显的跨膜结构域,其二维结构的组成元件有α-螺旋、延伸链和无规则卷曲,分别达到:37.4%,17.13%,45.47%,并且通过同源建模成功预测得到其三维结构。此外,系统进化分析表明,AsHKT基因与小麦7D染色体上的TaHKT2;2基因同源性最高,属于Ⅱ型HKT基因家族,本研究为节节麦和小麦的耐盐分子机理的解析以及节节麦HKT基因的进一步研究提供了参考和理论依据。

百萨偃麦草ThbGSK和ThbHKT1基因的同源克隆与表达分析

百萨偃麦草(Thinopyrum bessarabicum Lve,2n=2x=14,JJ)是小麦改良的重要亲缘物种。为了解GSK和HKT1基因在百萨偃麦草耐盐胁迫中的作用,本研究采用同源克隆的方法从百萨偃麦草中扩增获得了糖原合成酶激酶基因ThbGSK及高亲和性钾离子转运蛋白基因ThbHKT1的全长cDNA,ThbGSK基因全长1 233bp,与水稻、短柄草、小麦等物种的氨基酸一致性为93.92%～99.02%,表明GSK基因在这些物种间具有较高的保守性;聚类分析表明,ThbGSK与小麦TaGSK关系最近。ThbHKT1基因全长1 602bp,与水稻、小麦、短柄草、大麦等物种的氨基酸一致性为66.17%～92.87%,说明HKT1基因在这些物种间变异较大;聚类分析表明,ThbHKT1与大麦HvHKT1关系最近。RT-PCR和荧光定量PCR分析表明,经250mmol.L-1 NaCl胁迫处理后,GSK基因在百萨偃麦草和中国春诱导0～24h的叶片中表现为组成型表达,而HKT1基因在百萨偃麦草和中国春中均表现为诱导后上调表达。

拟南芥HKT1基因pCAMBIA载体构建及转基因材料筛选

探索盐胁迫作用机理并将其运用到农业生产领域中,对培育耐盐作物具有非常重要的现实意义。土壤环境中过量的Na+会干扰植物根对其他离子的吸收,导致植物生理代谢紊乱、离子失衡。在拟南芥中,已有研究证明HKT1基因在盐胁迫信号通路中扮演十分重要的角色,控制着Na+的吸收、转运和储存。文章通过正向和反向遗传学手段,发现一个转录因子MYBX在分子水平正向调控基因HKT1的表达,并通过构建HKT1过表达载体、获得含有测序正确质粒的农杆菌、侵染拟南芥突变体mybx,最终筛选获得1300-HKT1/mybx转基因植株,从而可以进一步验证MYBX和HKT1之间的关系。

高粱SbHKTs基因的克隆及其在拟南芥中的功能验证

本试验克隆了高粱HKT(high affi nity potassium transporter)基因家族3个成员Sb HKT1;4,Sb HKT1;5和Sb HKT2;1,并分析比较了这些基因在拟南芥中转运钠、钾离子的特性以及在抗旱方面的作用。结果表明,外界高浓度钠胁迫对各转基因植株的生长均有一定的影响,但这种抑制作用可在外源添加足量钾离子的情况下得到不同程度的缓解。此外,干旱胁迫下,转基因植株表现出优于突变体的抗旱性。这些结果表明,高粱HKT基因不仅在作物耐盐方面具有重要作用,同时在植物抗旱中也具有一定的功能。

植物HKT转运蛋白基因的研究进展

HKT转运蛋白是存在质膜上的一种离子运输体,是生物界普遍存在的负责Na+运输和K+-Na+同向运输的一种跨膜蛋白。HKT转运蛋白受到HKT家族基因表达调控。过量表达的HKT家族基因能够提高植物Na+转运或K+-Na+同向转运蛋白活性,使植物体内Na+再循环、降低体内Na+浓度、维持K+/Na+比值、保持细胞正常生理功能从而提高植物的耐盐性。该研究主要对HKT家族基因的发现、克隆与SOS、NHX等基因的相互作用以及其表达蛋白的结构、功能与耐盐之间的关系进行了综述,旨在了解其功能和作用机理,为植物耐盐基因工程奠定基础,获得耐盐的转基因植物。

不同水稻种质在不同生育期耐盐鉴定的差异

以21份水稻(Oryza sativa)种质为材料,用1.5%Na Cl处理种子8天后测定发芽率。在苗期用不同浓度NaCl水培处理10天,测定叶片死亡率等指标和高亲和性K+转运基因(HKT)家族变异。在成株期选3份种质,用不同浓度NaCl盆栽处理,在开花期和籽粒蜡熟期测定植株可溶性糖和生物量等指标,以明确各种质不同生育期的耐盐差异和关键指标。结果表明,在NaCl胁迫下,种子发芽率受到显著影响。苗期盐胁迫后,各种质的平均叶片死亡率变幅最大。在被鉴定的8个耐盐种质中,HKT家族的7个基因除OsHKT2;4外均存在。在≤1 g·kg–1盐胁迫下植株可溶性糖含量表现出刺激增长效应。CG15R单株生物量与盐浓度呈正相关,且随盐浓度的增加而缓慢增长。在≤1 g·kg–1时,中花9号的生物量随盐浓度的增加而增加。水稻耐盐性具有明显的阶段发育特异性,且不同发育阶段的耐盐性之间无相关性。叶片死亡率与蜡熟期生物量可分别作为苗期和成株期耐盐鉴定的关键指标。CG15R可作为高耐盐种质进行深入分析和利用。