正常人骨髓基质细胞对HL-60和HL-60/VCR细胞凋亡易感性的影响

为了观察正常人骨髓成纤维样基质细胞系HFCL对白血病敏感细胞HL-60和多药耐药细胞HL-60／VCR 凋亡易感性的影响,先建立HL-60或HL-60／VCR细胞与HFCL细胞共培养体系;采用瑞氏-吉姆萨染色和吖啶橙／ 溴化乙啶(AO／EB)染色,分别在光镜和荧光显微镜下进行形态学观察;TUNEL检测晚期凋亡细胞,流式细胞术检 测细胞周期、凋亡峰和annexin V阳性的早期凋亡细胞;Western blot检测Bcl-2、活化的胱冬蛋白酶(caspase)-3蛋 白和P糖蛋白(Pgp)的表达变化。结果表明,经topotecan(TPT)处理后的HL-60和HL-60／VCR细胞,在光镜和荧光 显微镜下均有典型的凋亡细胞形态学改变,这些改变具有时间和剂量依赖性;annexin V染色后能检测到早期凋亡 细胞;细胞周期显示:G1期细胞比例增高,S期减低,并有明显凋亡峰;TUNEL能检测到许多阳性细胞;同时出现活 化的caspase-3,伴有Bcl-2的表达下调,但与HFCL细胞共培养后,经TPT处理的HL-60和HL-60／VCR细胞中早期 和晚期凋亡细胞有所减少,凋亡峰减低,而且活化的Caspase-3表达减弱,Bcl-2蛋白表达上调,且以直接接触组为 甚。结论:正常骨髓成纤维样基质细胞HFCL能轻度降低白血病HL-60和HL-60／VCR细胞对TPT的凋亡易感性, 并有caspase-3和Bcl-2重要信号传导分子的参与。

mTOR信号通路影响人早幼粒白血病细胞株HL60的趋电性

生物电信号指导的细胞定向迁移行为在多细胞生物体的重大生理和病理过程中发挥重要作用,然而电信号指导细胞定向迁移的机制并不清楚.利用体外直流电刺激探究细胞定向迁移机制是研究生物电信号指导细胞行为常用的手段.作者对人早幼粒白血病细胞株HL60的趋电性作用进行了研究,发现在300 mV/mm的直流电场中,HL60细胞发生明显朝向电场阴极的趋电性运动,其趋电性指数和轨迹速度分别为0.89±0.04和9.72±0.38μm/min;Rictor敲低突变株的趋电性与野生型之间无限制性差异.利用高浓度mTOR的特异性抑制剂PP242药物处理HL60细胞后,细胞在直流电场中的趋电性指数降低到0.82±0.06,运动速度也被显著抑制.以上研究结果表明,mTOR信号通路在HL60细胞的趋电性运动中发挥了一定的作用,但Rictor并不是关键基因.研究结果为开发生物电场依赖的靶向药物提供了理论基础.

HL-60/VCR多药耐药细胞株耐药机制的研究

背景与目的:白血病细胞对化疗药物的耐药是白血病治疗失败的主要原因,多药耐药细胞株为白血病多药耐药机制和逆转多药耐药性的研究提供了良好的模型。为探讨药物诱导产生多药耐药机制,我们对HL-60/VCR细胞的耐药机制进行了研究。方法:应用流式细胞术和一组抗体,对药物敏感细胞株HL-60和多药耐药细胞株HL-60/VCR细胞的耐药相关蛋白P-gp、MRP、LRP、BCRP、GST-π,以及凋亡调节蛋白bcl-2、bax、bcl-x、bad的表达进行分析。结果:在HL-60/VCR细胞株中,耐药相关蛋白P-gp、MRP、BCRP、GST-π分别是其在HL-60细胞株中的18.62、1.19、1.50、1.32倍,而LRP无变化。凋亡抑制蛋白bcl-2、bcl-x分别是其在HL-60细胞株中的2.48、1.25倍,凋亡调节蛋白bad是HL-60细胞株中的1.08倍;而凋亡诱导蛋白bax反而降低,是HL-60细胞株中的0.88倍。结论:多种机制参与HL-60/VCR的多药耐药,涉及耐药蛋白P-gp、MRP、BCRP和GST-π的表达增强,而且凋亡调节蛋白bcl-2、bax、bcl-x、bad均可能参与其耐药机制的形成。

应用人类全基因组芯片检测多药耐药白血病细胞株HL-60/VCR与敏感细胞株HL-60基因的表达差异

本研究利用基因芯片技术检测白血病多药耐药细胞株HL-60/VCR及其亲本细胞株差异基因表达谱,探讨急性白血病多药耐药机制。本试验提取白血病细胞株HL-60及其多药耐药细胞株HL-60/VCR的mRNA,在反转录及体外转录过程中分别用生物素进行标记,与Affymetrix公司人类全基因组芯片U133A杂交,用Affymetrix专用芯片扫描仪G2500AGeneArrayScanner及MicroarraySuite、MicroDBTMGeneChipLIMS、GeneChipDMT分析软件系统处理杂交信号获取结果。结果表明:白血病细胞株HL-60及其耐药株HL-60/VCR差异显示基因5507条,其中耐药细胞株中上调表达基因3100条,下调表达基因2407条;差异极显著性基因1040条,表达上调435条,下调605条,涉及与细胞生长活动及信号转导相关的基因。结论:多基因参与白血病细胞株的多药耐药机制,基因芯片技术是并行分析多个基因、探讨白血病多药耐药机制的有效方法。

血管内皮生长因子反义核酸对细胞株HL60及耐药细胞株HL60/VCR的抑制作用

目的探讨反义血管内皮生长因子(AS-VEGF)对HL60、耐药细胞株HL60/VCR的影响及其机制,包括基因水平的耐药相关基因(Bcl-2,Mcl-1,MDR1,MRP,GSTπ,TopoⅡα,TopoⅡβ)和蛋白水平的耐药相关蛋白P糖蛋白(P-gp)表达量变化。方法分子生物学方法构建AS-VEGF表达真核载体,通过脂质体转染技术将其转染至细胞株HL60和耐药细胞株HL60/VCR内,观察并绘制细胞生长曲线,ELISA法检测细胞培养上清VEGF表达量变化,RT-PCR法从mRNA水平检测细胞内耐药相关基因表达,蛋白质印迹方法从蛋白水平检测细胞表面P-gp表达。结果1.25mmol/L的AS-VEGF真核表达载体转染HL60和HL60/VCR细胞株后继续培养24和48h与未转染组比较均可明显抑制细胞生长,细胞生长减慢;转染组细胞48与24h相比较VEGF、MDR1、MRP、GSTπ和TopoⅡβ的表达量均明显减少,Bcl-2、Mcl-1和TopoⅡα表达量则无明显变化;转染组HL60/VCR细胞表面P-gp表达量48与24h相比较也明显减少。结论AS-VEGF可通过抑制白血病细胞生长,改变细胞内的微环境和细胞膜相关蛋白转运通道,降低细胞解毒能力和自我修复能力逆转白血病细胞多药耐药。

干扰素对白血病多药耐药细胞HL60/VCR的影响

目的观察α干扰素(IFN-α)对白血病耐药细胞株HL60/VCR细胞对柔红霉素耐药性的逆转作用。方法选择HL60/VCR及HL60细胞为靶细胞,分为4组进行实验,即HL60+IFN-α组、HL60/VCR+IFN-α组、HL60+生理盐水组、HL60/VCR+生理盐水组,4组于体外分别经生理盐水、IFN-α两种培养基处理后,测定柔红霉素对每组细胞的细胞抑制率。结果 HL60/VCR+IFN-α组的抑制率与HL60/VCR+生理盐水组比较差异有统计学意义(P<0.001),与敏感细胞比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论柔红霉素对经IFN-α处理后的HL60/VCR细胞的抑制率明显增强,说明IFN-α具有一定的逆转HL60/VCR细胞对柔红霉素耐药性的作用。

正常人骨髓成纤维样基质细胞对HL-60/VCR耐药细胞增殖的影响

目的 观察正常人骨髓成纤维样细胞系HFCL对白血病多药耐药细胞HL-60／VCR增殖和分化的影响。方法 采用四唑氮蓝(MTT)法进行HL-60／VCR细胞药物敏感实验。建立HL-60／VCR细胞和HFCL细胞共培养体系,苔盼蓝拒染法测定生长曲线;硝基四氮唑蓝(NBT)确定细胞分化;流式细胞仪检测细胞周期和CD11b、CD13、CD14、CD33细胞表面抗原进一步鉴定细胞分化;Western blot检测增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)和P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)。结果 HL-60／VCR细胞对多种药物耐药。与HFCL细胞共培养后,HL-60／VCR细胞生长受抑,且与HFCL细胞直接接触组的抑制作用>用transwell组。同时发现HL-60／VCR细胞与HFCL细胞共培养后,G1期细胞增多,S期细胞减少;同时CD11b和CD14表达增高,CD13和CD33变化不大;且NBT阳性细胞轻度增多。Western blot检测结果显示,PCNA表达下调,以直接接触组为甚。但是P-gp表达无变化。结论 正常人骨髓成纤维样细胞HFCL能抑制白血病MDR细胞HL-60／VCR的增殖,抑制PCNA的表达,出现G1期阻滞,并部分向单核细胞分化。

雷帕霉素对急性髓系白血病细胞系HL-60和HL-60/VCR生长的抑制作用

为了探讨mTOR抑制剂雷帕霉素对急性髓系白血病(acute myeloid leukemia;AML)细胞的增殖和药物敏感性的影响。以AML细胞株HL-60和多药耐药HL-60/VCR细胞系为研究对象,采用MTT法测定生长曲线和流式细胞术检测细胞周期;Western blot检测P糖蛋白(P-glycoprotein,Pgp)的表达。结果显示:与空白对照组细胞比较,雷帕霉素能抑制HL-60和HL-60/VCR细胞生长增殖(p<0.05),且随着浓度升高,增殖抑制率逐渐增高,24-72小时的细胞增殖抑制率随着时间的延长而有所增高(p<0.05),同时可阻滞细胞从G1期到S期的细胞周期转换。雷帕霉素抑制HL-60/VCR细胞的Pgp蛋白的表达。与柔红霉素单独应用相比,雷帕霉素50nmol/L、100nmol/L与柔红霉素联合应用使HL-60和HL-60/VCR细胞增殖抑制率明显增高(p<0.05),尤其是当先加雷帕霉素,而24小时后再加柔红霉素时。结论:mTOR抑制剂雷帕霉素对HL-60和多药耐药的HL-60/VCR细胞的生长均有抑制作用,除伴G0/G1期阻滞外,还增加细胞对柔红霉素的敏感性,这为临床难治性AML治疗提供新的治疗手段。

ASON对急性早幼粒白血病细胞株HL60/VCR多药耐药的逆转作用

目的:探讨反义寡核苷酸(ASON)对耐长春新碱的急性早幼粒白血病细胞(HL60/VCR)多药耐药(mdr1)的逆转效果。方法:以HL60/VCR细胞为模型,合成正、反义寡核苷酸作用于HL60/VCR细胞,采用RT-PCR方法、流式细胞术及药敏试验等观察细胞mdr-1mRNA表达、mdr-1基因产物P-糖蛋白(P-gp)的表达和对药物长春新碱(VCR)的敏感性。结果:反义寡核苷酸处理的细胞mdr-1mRNA表达、P-gp表达较正义组及HL60/VCR细胞显著降低,且可明显提高HL60/VCR细胞株对长春新碱的敏感性。结论:反义寡核苷酸具有逆转HL60/VCR细胞多药耐药的作用。其作用机制可能是抑制mdr1mRNA的转录,使P-gp的表达受到明显抑制,提高对长春新碱的敏感性。

蟾毒它灵诱导急性早幼粒细胞白血病HL⁃60细胞铁死亡的机制研究

目的探究蟾毒它灵(Bufotalin)对急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)细胞HL‐60铁死亡的作用及机制。方法用不同浓度(0.1、0.5、1.0、2.0、4.0μg·mL^(-1))蟾毒它灵分别作用于APL细胞HL‐60,使用光学显微镜观察细胞的形态学变化;采用CCK‐8法检测细胞的存活率情况;采用Western blot法检测细胞中铁死亡相关蛋白CD71、xCT、FTH1、GPX4的表达水平;采用谷胱甘肽(GSH/GSSG)检测试剂盒检测细胞内GSH和GSSG的含量变化;采用脂质氧化(MDA)检测试剂盒测定细胞内MDA的含量变化。将0.5μg·mL^(-1)蟾毒它灵、0.1μmol·L^(-1)Fer‐1和0.5μg·mL^(-1)蟾毒它灵+0.1μmol·L^(-1)Fer‐1分别作用于HL‐60细胞,使用光学显微镜观察细胞形态学变化,并用Western blot法检测铁死亡相关蛋白的表达水平。结果不同浓度蟾毒它灵处理HL‐60细胞后,细胞形态呈现出哑铃型、梭形等不规则形状,细胞的存活率降低,且呈时间‐剂量依赖关系。与对照组相比,蟾毒它灵可降低铁死亡相关蛋白GPX4、xCT、FTH1的表达水平和总谷胱甘肽的含量(均P<0.01),升高CD71蛋白的表达水平和MDA含量(均P<0.05)。蟾毒它灵与铁死亡抑制剂Fer‐1联合处理HL‐60细胞后,与对照组比较,HL‐60细胞的生长数量和形态学无明显变化,CD71、xCT、FTH1、GPX4蛋白表达水平的差异也无统计学意义(均P>0.05)。结论蟾毒它灵可抑制APL细胞HL‐60的增殖并诱导铁死亡,其可能通过GPX4介导的抗氧化途径和铁代谢途径实现。

急性早幼粒细胞白血病HL60细胞适配体亲和性鉴定方法的实验研究

目的用三种不同的检测方法鉴定HL60细胞适配体单链DNA(ssDNA)亲和性,比较不同方法的鉴定结果。方法用荧光显微镜、化学法(酶标仪)和流式细胞术三种方法,通过镜下观察、OD值、荧光强度和平衡解离常数等指标鉴定HL60细胞适配体的亲和性。结果荧光显微镜法可见在蓝色背景下,被标记的适配体(5’-FAM-ssDNA)与HL60细胞结合,发出绿色荧光,并应用ImageJ对该荧光结果进行分析,发现L36P的亲和性最高;化学法测定OD值,通过GraphPad Prism7制作柱状图并进行统计学分析,发现5条ssDNA与HL60细胞的亲和性均明显高于对照组(单个核细胞),且L36P的亲和性最高;流式细胞仪检测荧光强度,计算平衡解离常数,确定5条ssDNA与HL60细胞的亲和性由高到低依次为:L36P、L24P、L139P、L2P、L135P。结论荧光显微镜法可更直观地观察ssDNA与细胞的结合情况,化学方法(酶标仪)和流式细胞术可对结果进行定量分析,三种方法的检测结果基本一致。

锌带蛋白(ZNRD1)小干扰RNA对HL-60/VCR细胞耐药性逆转的研究

为探讨以锌带蛋白(ZNRD1)基因作为靶分子进行白血病多药耐药基因治疗的可行性,以Western blot检测ZNRD1在白血病细胞中的表达;构建ZNRD1基因的小干扰RNA载体并将其转导入HL-60/VCR细胞,G418筛选稳定转染细胞株;MTT法检测细胞转染前后生长速度和药物敏感性的变化;western blot检测细胞转染前后凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和耐药相关蛋白P-gp,MRP的表达变化。结果表明,ZNRD1在HL-60/ VCR细胞中的表达明显高于HL-60细胞;转染后的细胞对长春新碱和阿霉素的敏感性增强,且低表达P-gp 和Bcl-2。结论:该小干扰RNA真核表达载体能在一定程度上逆转白血病细胞的耐药性。

HL60/VCR白血病细胞多药耐药机制的初步探讨

目的探讨白血病细胞产生耐药的机制,以及VEGF在白血病细胞产生耐药过程中的作用。方法采用反复暴露并逐渐提高诱导药物浓度的方法建立HL60/VCR多药耐药细胞系,MTT法检测细胞的耐药性及交叉耐药性;RT-PCR检测诱导前后mdr1、MRP、TopoⅡα、GSTπ和VEGF mRNA的表达情况。结果诱导后的HL60/VCR耐药细胞不仅对VCR高度耐药,对其他类化疗药物亦具有交叉耐药性;与HL60相比,HL60/VCR的mdr1、TopoⅡα和VEGF mRNA的表达明显增强,GSTπmRNA的表达无明显变化;HL60和HL60/VCR均不表达MRP mRNA。结论耐药基因mdr1和TopoⅡα以及VEGF共同参与HL60/VCR多药耐药的形成。

HL60/VCR耐药细胞荷瘤鼠模型的建立

目的建立白血病HL60/VCR耐药细胞株移植动物模型方法。方法将生长状态良好的耐药细胞株HL60/VCR1.0×107/0.2ml接种到BALB/c-nu/nu裸小鼠皮下,定期观察裸鼠生长状况,测量移植瘤大小,留取标本检测不同脏器肿瘤负荷及多药耐药基因MDR1表达情况。结果 2.0×106HL60/VCR细胞皮下接种BALB/c-nu/nu裸小鼠,成瘤率为67.7%,免疫组化检测荷瘤裸鼠肝脏和脾脏均可见巢状分布白血病细胞,PCR检测成瘤组织表达MDR1基因。结论皮下移植可成功建立耐药细胞株荷瘤鼠模型,为研究多药耐药细胞株动物体内生物学行为及逆转多药耐药提供了动物模型。

蟾蜍灵诱导人白血病HL60细胞凋亡的初步研究

目的 :探讨中药蟾蜍灵诱导白血病HL6 0细胞凋亡作用。方法 :应用台盼蓝染色法测定HL6 0细胞的生长曲线 ,应用相差显微镜、电子显微镜和DNA琼脂糖凝胶电泳等技术分析细胞凋亡。结果 :蟾蜍灵与HL6 0细胞共育时 ,能明显抑制细胞生长 ,细胞呈典型的凋亡形态学改变 :细胞皱缩 ,染色质凝集 ,沿核膜内侧分布 ,呈新月形 ,可见由膜包被细胞内容物的凋亡小体的产生 ;细胞DNA裂解成 180～ 2 0 0bp及其倍数的片段 ,电泳得到特有的梯形条带。结论 :蟾蜍灵诱导细胞凋亡是其抗肿瘤的作用机制之一。

补骨脂素对HL60细胞凋亡及细胞内Ca^(2+)浓度影响的探讨

目的:探讨补骨脂素对HL60细胞凋亡的影响,以及细胞内Ca2+浓度与凋亡之间关系。方法:采用MTT比色分析法测定补骨脂素对HL60的细胞毒性影响,流式细胞仪及激光共聚焦显微镜测定HL细胞内Ca2+浓度和凋亡比率。结果:补骨脂素对HL60细胞生长具有抑制作用,补骨脂素促进细胞凋亡比率,细胞凋亡与Ca2+浓度成正相关。结论:补骨脂素影响HL60细胞凋亡,Ca2+介导的细胞凋亡是补骨脂素抑制肿瘤细胞生长的可能机制之一。

通关藤诱导白血病细胞U937,HL60细胞凋亡的实验研究

目的探讨通关藤抑制白血病细胞增殖作用及其机制。方法以不同浓度的通关藤提取物制剂处理白血病细胞U937、HL60，1～5d，以四甲基偶氮唑盐（MTY）法检测对细胞增殖的影响，以Annexin V／P1双染法检测细胞的凋亡程度，Western blot检测凋亡相关蛋白caspase3，PARP改变，以JC-1染色法检测线粒体跨膜电位（△ψm）水平。结果通关藤提取物制荆呈时间和剂量依赖性抑制U937、HL60细胞增殖，50μL／mL时能明显降低线粒体跨膜电位（△Ⅲm），活化caspase3，剪切PARP，诱导细胞凋亡。结论通关藤提取物制剂对U937、HL60白血病细胞有显著的抑制和诱导凋亡作用，能通过降低线粒体跨膜电位途径触发白血病细胞凋亡。

可见光响应掺氮TiO_2的制备及对白血病HL60细胞体外杀伤效应的研究

采用硫酸钛与氨水反应制备掺氮TiO2。UV-Vis漫反射谱研究表明掺氮的TiO2在紫外区的吸收边明显红移(约20nm),并且在400nm^530nm出现新的吸收区域,光吸收阈值从380nm扩展到530nm。XPS分析表明,在TiO2掺杂的N为间隙态,而且还存在大量的氧空位。氧空位在导带下形成的窄带使得掺氮的TiO2在400nm^530nm出现新的吸收区域。用MTT法测量了掺氮TiO2杀伤白血病HL60细胞的活性。结果显示,无论有无可见光照射,掺氮TiO2对白血病肿瘤细胞杀灭效果明显好于未掺杂TiO2。

人参炔醇对HL-60细胞体外诱导分化作用的研究

目的 通过细胞形态学和增殖动力学研究人参炔醇对 HL-60细胞诱导分化作用。方法 采用台盼蓝染色及细胞计数器测定细胞存活量 ,流式细胞仪检测人参炔醇对细胞周期和分子标志表达的影响 ,观察信号通路阻断剂对人参炔醇诱导细胞分化的影响。结果 人参炔醇使 HL-60细胞倍增时间延长 ,诱导 HL-60向单核细胞分化 ,细胞集中于 G1 期 ,显著上调细胞表面 CD14分子表达 ,并中度上调 CD11b分子表达 ,Rpc AMPS及 H7均可使人参炔醇诱导的 HL-60细胞 NBT阳性率降低。结论 人参炔醇诱导 HL-60向单核细胞分化 ,与细胞内腺苷酸环化酶(c AMP) ,蛋白激酶 C(PKC)信号通路活化有关。