苦参碱和氧化苦参碱致HL7702细胞毒性研究

目的：探讨苦参碱和氧化苦参碱在体外对人正常肝细胞（HL7702）的影响。方法：①采用MTT法检测苦参碱和氧化苦参碱对肝细胞活力的影响;②采用光镜对给药后的细胞形态进行观察;③检测给予苦参碱和氧化苦参碱后,肝细胞培养上清液中的肝功能指标（ALT、AST、ALP、LDH）。结果：①MTT法显示,2.5~5mg/mL的苦参碱对HL7702细胞有明显的抑制作用（P〈0.01）,5mg/mL的氧化苦参碱能够显著性降低肝细胞活力（P〈0.05）;②光镜结果显示,给予苦参碱和氧化苦参碱后,细胞出现皱缩,变圆,体积变小,亮度增加,且药物浓度越大,呈现此状态的数目越多,苦参碱对HL7702细胞形态的影响大于氧化苦参碱;③5mg/mL的苦参碱和氧化苦参碱均能明显升高细胞上清液中的AST、ALP、LDH水平（P〈0.01或P〈0.05）,相同剂量苦参碱的上清液中AST、ALP、LDH水平的升高程度大于氧化苦参碱。结论：苦参碱和氧化苦参碱对肝脏可能具有毒性作用,且苦参碱的肝毒性作用大于氧化苦参碱。

蜂胶黄酮对环磷酰胺诱导HL7702细胞损伤的保护作用

目的探讨蜂胶黄酮(EPF)对环磷酰胺(CTX)诱导HL7702细胞凋亡的保护作用。方法将HL7702细胞按一定密度分别接种于96孔板和24孔板,培养24 h后,向各孔中分别加入CTX(4 ng/L)、CTX(4 ng/L)+EPF(20、30、40 ng/L),继续培养24 h,进行WST-1、AO/EB双染、Annexin-V-FITC/PI流式细胞染色。采用小鼠随机分组,试验组每天给予EPF 100、200、400 mg/mL灌胃,0.5 mL/支,连续给药10 d,同时注射CTX0.15 g/kg,共3 d。取血清检测过氧化氢酶(CAT)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)等活性及尿素氮(BUN)含量。结果 EPF与CTX共处理HL7702细胞生长抑制明显改善,当EPF浓度达到40 ng/mL时,促进生长作用呈现正比例曲线特征。试验组凋亡细胞明显减少,绝大多数细胞形态饱满,几乎没有死亡细胞。CTX单独处理的HL7702细胞组24 h晚期凋亡细胞占30.2%,CTX与EPF共处理细胞组凋亡细胞分别占19.2%、13.1%、7.1%。结论 EPF对CTX诱导的HL7702凋亡作用具有拮抗作用,可缓解CTX引起的毒性。

天麻素通过SIRT1/PGC-1α信号通路抗叔丁基过氧化氢诱导的HL7702细胞氧化损伤

目的 ：探讨天麻素对叔丁基过氧化氢诱导的人肝细胞HL7702氧化损伤的保护作用。方法：以叔丁基过氧化氢损伤人肝细胞HL7702建立氧化损伤模型,以不同浓度天麻素（5-20μmol/L）进行干预。采用MTT比色法检测细胞活力,光学显微镜观察细胞形态,罗丹明123染色法检测细胞线粒体膜电位改变,免疫印迹实验检测细胞中SIRT1和PGC-1α蛋白的表达。结果：不同浓度天麻素（5-20μmol/L）能够提高叔丁基过氧化氢作用的细胞存活率并呈时间-剂量依赖性,确定其最佳作用时间为24 h,最佳作用浓度为10μmol/L。与对照组相比,模型组细胞氧化应激作用明显增强,而天麻素10μmol/L作用24 h后,能够显著降低活性氧和丙二醛含量,升高超氧化物歧化酶活力;抑制叔丁基过氧化氢诱导的线粒体膜电位降低并显著增加SIRT1和PGC-1α蛋白的表达。结论 ：天麻素能够抑制活性氧对HL7702细胞的氧化损伤,其保护作用可能与抑制氧化应激引起线粒体功能损伤并上调SIRT1/PGC-1α蛋白表达有关。

微囊藻毒素LR影响人肝细胞HL7702的ERK及JNK的蛋白磷酸化

微囊藻毒素（Microcystin,MCYST）是蓝藻的一些属产生的次级代谢产物,在发生水华的水体中普遍存在。微囊藻毒素LR（MCLR）是微囊藻毒素中存在最为普遍且毒性作用最强的一种。已有研究表明,微囊藻毒素可以诱发肝毒性并且与人群中的肝癌发生密切相关[1,2],因此进一步阐明其致毒机理具有重要的意义。

RGD活性肽对环磷酰胺诱导HL7702正常肝细胞损伤的保护作用

目的探讨含RGD序列的抗肿瘤多肽T30肽对环磷酰胺诱导HL7702细胞凋亡的保护作用。方法将HL7702细胞按一定密度分别接种于96孔板和24孔板,培养24 h后向各孔中分别加入环磷酰胺(CTX)(浓度为4μg/ml),CTX+RGD-T30(浓度依次为20、40、60μg/ml),继续培养24 h,进行WST-1、AO/EB双染、Annexin-V-FITC/PI流式细胞染色。结果 RGD-T30肽与CTX共处理HL7702细胞生长抑制明显改善,当RDG-T30肽浓度达到40μg/ml时,促进生长作用呈现正比例曲线特征。RDG-T30肽组凋亡细胞明显减少,绝大多数细胞形态饱满,几乎没有死亡细胞。CTX单独处理的HL7702细胞组24 h晚期凋亡细胞占30.2%,CTX与RDG-T30共处理细胞组凋亡细胞分别占19.2%和13.1%、7.1%。结论 T30肽对CTX诱导的HL7702凋亡具有拮抗作用。

用肝肾共培养体系研究细胞毒性的方法学考察

目的建立肝肾共培养体系,并证明此体系的合理性与可行性方法采用MTT法比较川楝素(20、40、80、160μg/mL)、葛根素(200、100、50、25μg/mL)、苦参碱(5、2.5、1.25、0.625 mg/mL)、汉防己乙素(50、25、12.5、6.25 mg/mL)在肝肾单独培养和共培养体系中对肝、肾细胞活力的影响。结果 2种体系中:川楝素仅对肝细胞的活力有抑制作用,葛根素对肝肾细胞均无抑制作用,苦参碱对肝细胞活力的抑制程度大于肾细胞,汉防己乙素对肾细胞活力的抑制程度大于肝细胞。结论用肝肾细胞共培养体系与单独培养体系进行实验得出的结果一致,这2种体系均可用于药物对细胞的毒性研究,其中共培养体系能更好地反映药物对靶器官的选择性。

PPAR-α激动剂Wy14643减轻肝细胞系氧化应激损伤

目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)-α激动剂Wy14643对过氧化氢(H2O2)诱导HL7702肝细胞损伤的保护作用及其机制。方法 RT-PCR、Western blot分别检测H2O2损伤后HL7702肝细胞PPAR-αmRNA及蛋白表达。Wy14643预孵育细胞,观察其对H2O2损伤HL7702肝细胞活性、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性及NF-κB活化的影响。结果 H2O2可诱导HL7702细胞PPAR-αmRNA及蛋白表达降低,200和300μmol/L H2O2损伤后蛋白表达量由0.69±0.04分别降至0.48±0.05和0.38±0.03(P<0.01);Wy14643能够抑制H2O2诱导的HL7702细胞活性降低、SOD、CAT活性下降及NF-κB的激活。结论 Wy14643减轻H2O2诱导的肝细胞损伤,并增强细胞的抗氧化能力,可能与抑制NF-κB的活化有关。

3株肝细胞在硝酸纤维素膜界面上生长的初步研究

目的在体外培养的条件下,观察3株肝细胞在硝酸纤维素膜材料上的生长情况,研究膜的细胞相容性及理化性能的改变,初步探讨硝酸纤维素膜作为一种新的组织工程膜材料用于构建生物人工肝生物反应器中细胞的载体材料的可行性。方法将生物人工肝常用的细胞:肝肿瘤细胞HepG2、C3A、永生化HL7702细胞株分别接种在浸泡处理后的硝酸纤维素膜片上常规培养,在普通光学显微镜以及扫描电镜观察肿瘤细胞在此种膜上的贴壁情况和细胞形态。同时行免疫细胞化学染色和细胞功能检测。结果细胞经常规染色、透明处理后,在光镜下观察到膜上生长的细胞保持了较好的增殖状态及细胞形态;免疫细胞化学染色结果表明,膜上细胞特异性标志物表达良好。培养液上清的生化检测表明培养细胞的主要分泌、代谢功能与常规培养无明显差异;扫描电镜下膜表面细胞呈集落式三维生长,增殖明显。结论硝酸纤维素膜能促进细胞黏附,并且与细胞有良好的相容性。硝酸纤维素膜作为一种良好的细胞黏附生长介质的同时,还具有可以在其上面直接进行相关培养物观察和检测的优点。

表没食子儿茶素没食子酸酯对黄曲霉毒素B1致肝细胞氧化损伤的保护作用

目的:观察表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对黄曲霉毒素B1(AFB1)致人正常肝细胞(HL7702细胞)氧化损伤的影响。方法:将HL7702细胞分为正常对照组、溶剂对照组(0.3%DMSO)、AFB1染毒组和低、中、高剂量EGCG组(5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL)。AFB1染毒组用60μg/mLAFB1作用细胞24h,建立肝HL7702细胞氧化应激模型。低、中、高剂量EGCG组预先用相应浓度EGCG处理细胞1h,再加入60μg/mLAFB1作用24h。用CCK-8法检测细胞存活率,DCFH-DA荧光探针法检测细胞内活性氧(ROS),并检测细胞培养上清液中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)以及受损细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的含量。结果:与对照组相比,AFB1染毒组ALT、AST、MDA及ROS水平明显升高,肝细胞存活率、SOD酶活性明显降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);与AFB1染毒组相比,EGCG处理可使ALT、AST、MDA及ROS水平明显降低,肝细胞存活率、SOD活性明显升高(均P<0.05)。结论:EGCG可明显减轻AFB1诱导的肝细胞损伤,其作用机制可能与抗氧化损伤有关。

乙型肝炎病毒全x蛋白体外诱导肝星状细胞炎症反应并促进肝细胞凋亡

目的探究乙型肝炎病毒(HBV)全x蛋白(HBwx)诱导肝星状细胞(HSCs)炎症反应和促进肝细胞凋亡的作用及其机制。方法取LX2细胞,分为对照组、脂多糖(LPS)处理组、转染HBwx处理组和LPS联合转染HBwx处理组。采用Western blot法检测自噬相关蛋白p62和LC3及炎症相关蛋白NLRP3和pro-IL表达,采用ELISA法检测培养上清IL-1β水平;收集上述各组LX2细胞培养上清刺激HL7702细胞培养,使用流式细胞仪检测HL7702细胞凋亡。结果经HBwx质粒转染的LX2细胞在细胞质表达HBwx蛋白;与正常组比,LPS组、HBwx组和LPS联合HBwx组LC3表达显著减低,而p62表达显著增强(P<0.05);与正常组比,LPS组、HBwx组和LPS联合HBwx组NLRP3和pro-IL1表达显著增强(P<0.05);与正常组比,LPS组、HBwx组和LPS联合HBwx组IL-1β分泌显著增多(P<0.05);与正常组比,LPS、HBwx和LPS联合HBwx处理HL-7702细胞凋亡水平显著增强(P<0.05);与LPS组或HBwx组比,LPS联合HBwx处理HL-7702细胞凋亡水平进一步增强(P<0.05)。结论HBwx作用于HSCs抑制自噬并促进细胞炎症反应,HSCs分泌IL-1β,诱导肝细胞凋亡。

二甲基甲酰胺对HL7702肝细胞毒性及线粒体膜电位的影响

目的观察二甲基甲酰胺(DMF)对HL7702肝细胞的细胞活力、凋亡及线粒体膜电位的影响,探讨DMF引起肝细胞凋亡的可能机制。方法 HL7702肝细胞给予50、100、150、200和250 mmol/L DMF处理,于24 h后检测其细胞存活率,乳酸脱氢酶(LDH)释放量。根据细胞毒性测试结果设置对照组及DMF染毒组(200 mmol/L)。流式细胞术检测DMF对HL7702细胞凋亡以及对线粒体膜电位的影响。结果 DMF剂量依赖性地降低HL7702细胞的存活率,其中150、200和250 mmol/L DMF组与对照组相比,细胞存活率明显降低;并且,随着DMF染毒浓度增加,释放至细胞外的LDH的含量增加,与DMF浓度呈正相关。200 mmol/L DMF染毒24 h后,与对照组相比,细胞凋亡率增加,差异有统计学意义(P<0.001),线粒体膜电位降低,差异也有统计学意义(P<0.001)。结论 DMF对HL7702细胞的毒性作用具有剂量依赖性,DMF引起HL7702线粒体膜电位的改变与DMF导致细胞凋亡有关。

血清药理学方法评价叔丁基对苯二酚的安全性

运用血清药理学方法评价食品抗氧化剂叔丁基对苯二酚的毒性。大鼠灌胃700 mg/kg叔丁基对苯二酚后,分别于0.08、0.25、0.50、24.00、48.00 h采血,分离血清。以人正常肝细胞HL7702为研究对象,采用MTT法检测叔丁基对苯二酚、含叔丁基对苯二酚及其代谢物血清的细胞毒性,在倒置显微镜下观察细胞生长形态变化。结果表明:虽然高浓度的叔丁基对苯二酚会抑制细胞生长,并使细胞形态学特征改变,但叔丁基对苯二酚经体内代谢后的血清对细胞生长无显著性抑制作用。因此,在卫生标准许可范围内,叔丁基对苯二酚食用安全。

rhGLP-1(7-36)对肝细胞Akt/GSK3信号通路的影响

目的观察rhGLP-1(7-36)对肝细胞Akt/GSK3信号通路的影响。方法培养人HL7702细胞系至对数生长期,将其分为实验组和空白对照组,分别用含rhGLP-1(7-36)100nM的培养基、不含rhGLP-1(7-36)的培养基培养90min。用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测两组Akt、糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase,GSK3)、糖原合酶(glycogen synthase,GS)水平。结果与空白对照组(1.00±0.00)比,实验组p-Akt(Thr308)蛋白相对表达水平(1.81±0.28)明显增加(P=0.01),Akt及p-Akt(Ser473)蛋白表达水平无明显变化;实验组p-GSK3α(Ser21)(1.27±0.09)、p-GSK3β(Ser9)(1.24±0.09)蛋白表达水平明显升高(P值分别为0.003、0.002),GSK3α及GSK3β蛋白表达水平无明显变化;实验组p-GS(Ser641)蛋白表达水平(0.70±0.16)降低(P=0.03),GS蛋白表达水平无明显变化。结论GLP-1可抑制GSK3/GS信号通路,激活GS活性,促进糖原合成。

RhoC在肝癌细胞生长中的作用及分子机制

目的研究RhoC在肝癌细胞生长中的作用及分子机制，为抑制肝癌细胞生长寻找分子靶点。方法构建siRNA．RhoC载体，建立RhoC基因沉默的肝癌细胞株。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞生长，硝酸银染色检测细胞增殖，平板克隆实验检测细胞克隆形成能力，流式细胞术（FACS）检测细胞周期，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测细胞周期蛋白表达。PcDNA3-RhoC转染肝细胞，建立RhoC高表达细胞株，检测RhoC基因对正常肝细胞生长的影响。结果siRNA-RhoC载体转染Bel7402细胞后，RhoC基因表达的抑制效率为82．3％。细胞培养第4天，RNAi组吸光度（A）值为0．4 ±sO．10，显著低于Bel7402细胞组（0．73±0．11，P〈0．05）和阴性对照组（0．71±0．07，P〈0．05）。此后，RNAi组的细胞增殖速度持续低于Bel7402细胞组和阴性对照组，直到第7天实验结束。RNAi组的细胞核平均银染颗粒数明显少于Bel7402细胞组和阴性对照组（分别为1．23±0．35、3．47±0．93和3．17±0．78，均P〈0．01）；Go／G，期细胞显著升高[分别为（73．14±5．93）％、（57．05±5．97）％和（52．99±4．80）％，均P〈0．05]；cyclinD1表达下降（分别为0．45±0．21、1．25±0．24和1．12±0．15，均p〈0．05）；CDK4表达下降（分别为0．55±O．08、1．18±0．32和1．10±0．29，均P〈0．05）；p16表达升高（分别为1．07±0．23、0．36±0．12和0．35±0．13，均P〈0．01）；p21表达升高（分别为0．42±0．12、0．174±0．06和0．19±0．08，均P〈0．05）。HL7702细胞转染PcDNA3-RhoC质粒后，Rhoc高表达，至转染的第3天，RhoC转染组A值为0．83±0．10，显著高于HL7702细胞组（0．54±0．11，P〈0．05）和空载体对照组（0．58±0．55，P〈0．05）。其后，RhoC转染细胞生长速度持续高于HL7702细胞组和空载体对照组，直至第7天实验结束。结论RhoC是调控肝癌细胞生长的关键分子，是抑制肝癌细胞生长的良好分子靶点。

叔丁基对苯二酚对人正常肝细胞的毒性

目的:研究叔丁基对苯二酚在大鼠体内代谢后的浓度及在该浓度范围内的体外细胞毒性。方法:大鼠高剂量(700mg/kg)灌胃后,运用液相色谱/质谱联用法检测血清中叔丁基对苯二酚的浓度。以人正常肝细胞HL7702为研究对象,采用MTT法检测叔丁基对苯二酚的细胞毒性,采用倒置显微镜观察细胞形态变化,并评估叔丁基对苯二酚在体内浓度范围内的体外细胞毒性。结果:叔丁基对苯二酚抑制细胞生长,并使细胞形态学特征改变;随着浓度升高(0.01～1.2mmol/L)和细胞培养时间延长(12～48h),其对细胞的毒性作用加剧(细胞毒性等级0～4);细胞培养时间为12、24、48h时,半致死浓度分别为0.63、0.34、0.16mmol/L;大鼠血清中叔丁基对苯二酚的浓度≤0.12mmol/L,细胞毒性等级0～2级。结论:经口进入体内的叔丁基对苯二酚,代谢后的体内浓度不会引起高细胞毒性反应。

吴茱萸次碱对肝肾毒性的初步研究

目的:探讨吴茱萸次碱Rutecarpine(Rut)在体外对人正常肝细胞(HL7702)、人胚胎肾细胞(HEK293)的影响,采用共培养体系初步比较Rut对肝肾细胞活力的影响,并选用小鼠进行整体验证。方法:①采用MTT法检测Rut在肝肾细胞单独培养或共培养体系中对细胞活力的影响并采用倒置显微镜对细胞形态进行观察;②给予Rut后,检测肝肾细胞培养上清液中丙氨酸转氨酶(ALT),天冬氨酸转氨酶(AST),碱性磷酸酶(ALP),尿素氮(BUN),肌酐(Cr),乳酸脱氢酶(LDH)的变化;③整体实验观察静脉给予Rut对小鼠肝肾功能和组织病理学的影响。结果:①MTT法显示,2,4μg·mL-1的Rut使肝肾细胞活力均下降,且相同浓度下的Rut对肝细胞的抑制作用大于肾细胞;②4μg·mL-1的Rut使肝细胞上清液中的AST,ALP,LDH水平均升高(P<0.01);③整体实验表明,小鼠静脉给予10 mg·kg-1 Rut 7 d后,血清中的ALP水平有极显著的上升(P<0.01),ALT,AST,BUN,Cr水平只出现升高的趋势,病理学检查发现约1/3的小鼠肝脏出现肝细胞核分裂象增多,仅有1只小鼠肾脏出现嗜碱性病变。结论:大剂量Rut可能对肝肾具有一定的毒性作用,肝肾细胞共培养体系与细胞单独培养体系均可用于药物对细胞的毒性研究。