肝癌相关肿瘤抗原AFP新的HLA-A2/A24限制性CTL表位的预测及分析

目的:预测肝癌肿瘤抗原AFP新的HLA-A2/A24限制性CTL表位,为肝癌CTL表位肽的筛选及鉴定提供依据。方法:选择与肝癌密切相关的肿瘤抗原AFP为研究目标,采用NetCTL1.2Server远程预测系统进行HLA-A2/A24限制性CTL表位预测。结果:共预测出与肝癌相关的肿瘤相关抗原AFP的8个HLA-A2限制性CTL表位,13个HLA-A24限制性CTL表位。结论:应用NetCTL1.2Server法预测CTL表位是一种高效准确的预测方法。所预测的肿瘤抗原AFP的HLA-A2/24限制性CTL表位经实验筛选、鉴定后,可为肝癌治疗性疫苗的制备选择合适的CTL表位提供依据。

人类白细胞抗原HLA-A基因多态性与HBV携带的相关性研究

目的探讨人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)基因多态性与乙型肝炎病毒(HBV)感染的相关性。方法收集云南省昆明市延安医院健康体检者静脉血样本501例,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HBV二对半,根据HBV二对半检测结果分为HBV携带组和既往感染组以及健康对照组3组,用序列特异性引物聚合酶链反应(polymerase chain reaction with sequence specific primers,PCR-SSP)基因分型技术检测HLA-A抗原的基因型,将HBV携带组和健康对照组以及HBV既往感染组和健康对照组的HLA-A基因多态性的分布频率进行比较。采用SPSS17.0软件进行数据统计分析。结果健康对照组HLA-A2阳性数占比47.49%,等位基因频率数占比31.29%;健康对照组基因分布频率总体与中华骨髓库发布的中国常见及确认的HLA-A等位基因表一致。HBV携带组HLA-A2阳性数占比63.04%,等位基因频率数占比42.23%,携带者的HLA-A2阳性率和等位基因频率差异有统计学意义(P<0.05);HBV既往感染组HLA-A2阳性数占比56.14%,等位基因频率数占比35.97%,既往感染组的HLA-A2阳性率和等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05)。结论HLA-A2基因可能是慢性乙型肝炎HBV携带者的易感基因。

β2微球蛋白-接头蛋白2-人类白细胞抗原A24(β2m-linker 2-HLA A24)蛋白的生物信息学分析、真核表达与鉴定

目的应用生物信息学方法对β2微球蛋白-接头蛋白2-人类白细胞抗原A24(β2m-linker 2-HLA A24)蛋白进行结构、功能预测分析,并对该蛋白进行真核表达与纯化。方法运用在线蛋白质分析软件ProtParam预测β2m-linker 2-HLA A24蛋白理化性质;磷酸化位点预测软件NetPhos和蛋白质二级结构预测软件SOPMA分析其磷酸化位点和二级结构;并利用蛋白质结构模型预测工具SWISS-MODEL建立三级结构模型。构建含组氨酸标签(His tag)的重组质粒pcDNA3.4/β2m-linker 2-HLA A24-His tag,在Expi293F细胞表达,经镍柱亲和层析获得β2m-linker 2-HLA A24蛋白;采用SDS-PAGE、Western blot、间接ELISA验证蛋白的纯度和性质。结果β2m-linker 2-HLA A24蛋白含有44个磷酸化位点,属于亲水性蛋白,二级结构以无规卷曲为主,并成功构建三级结构模型;成功构建pcDNA3.4/β2m-linker 2-HLA A24-His tag重组质粒,并在Expi293F细胞表达系统中获得可溶性表达。结论成功构建β2m-linker 2-HLA A24蛋白,生物信息学结果显示该蛋白具备与抗原肽结合并激活T细胞的功能。为后续联合使用该蛋白与抗原肽激活抗原特异性CD8^+T细胞实验奠定了基础。

OVA66抗原肽与HLA-A2分子结合性和结合稳定性的研究

目的:建立利用T2细胞体外筛选肿瘤相关抗原OVA66中HLA-A2限制性抗原肽表位的实验方法。方法:应用计算机预测获得OVA66抗原中多个不同分值的九肽分子,在不同浓度(0.2μg/ml,2μg/ml,5μg/ml和20μg/ml)下与T2细胞共同孵育4h,并分别在其后的0,2,4h测定T2细胞表面HLA-A2分子的平均表达强度,抗原肽与HLA-A2的亲和力以20％MFI_(max)时的抗原肽作用浓度表示;抗原肽与HLA-A2分子结合稳定性以MFI(4h)/MFI(0 h)的百分比表示。结果:经计算机预测所获得的分值不同的4种候选OVA66抗原肽表位与T2细胞表面HLA-A＊0201的结合能力和结合稳定性显示出差别,并且与预测的分值不尽符合,其中L235和L238与HLA-A＊0201的结合力优于L236和L237。结论:利用T2细胞可以在体外初步筛选获得与HLA-A＊0201具有高亲和力的抗原肽。

谷氨酰转移酶2与基质金属蛋白酶2和白细胞分化抗原24对翼状胬肉复发的影响

目的研究谷氨酰胺转移酶（TGM）_2、基质金属蛋白酶（MMP）-2、白细胞分化抗原（CD）-24在翼状胬肉组织中的表达，探讨翼状胬肉手术后可能的复发机制。方法采用酶联免疫吸附法（ELISA）和免疫组织化学过氧化物酶法检测翼状胬肉和正常结膜组织中的TGM-2、MMP-2和CD-24的表达水平，比较翼状胬肉和正常结膜组织中TGM-2、MMP-2、CD-24表达的差异。结果MMP-2、CD-24和TGM-2的阳性颗粒的平均光密度在正常结膜组织标本中分别为0．87±0．30、0．75±0．32、3.78±0．29，在翼状胬肉标本中分别为3．62±0．96、4．65±0．86、0．98±0．65，翼状胬肉和正常结膜组织中MMP-2、CD-24和TGM-2阳性颗粒的平均光密度比较差异均有统计学意义（均P〈0．05）；ELISA法检测结果示TGM-2在翼状胬肉组织的表达水平较正常结膜组织减少[（1．9±0．4）比（4．8±0．9）]，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论MMP-2、CD-24和TGM-2是翼状胬肉复发的重要因素。

老年胆管细胞癌患者外周血糖蛋白抗原19-9与24-2水平变化及其临床意义

目的探讨血清糖蛋白抗原(CA)19-9与CA24-2水平动态表达在老年胆管细胞癌患者诊断、预后及复发中的临床意义。方法采用电化学发光免疫分析法,分别以年龄匹配的20例胆系良性疾病及20例正常人作对照,对26例老年胆管细胞癌患者外周血CA19-9与CA24-2水平进行检测。结果胆管细胞癌组外周血CA19-9与CA24-2表达阳性率分别为76.9%,69.2%,明显高于胆系良性疾病组(5.0%,10.0%)及正常对照组(0.0%,5.0%)(均P<0.01);CA19-9、CA24-2的均值分别[(1 571.82±291.75)、(181.69±71.80)U/ml]明显高于胆系良性疾病组[(28.52±10.61)、(16.26±11.50)U/ml]及正常对照组[(22.53±6.42)、(10.68±5.87)U/ml](P<0.01)。CA19-9与CA24-2联合检测阳性率(88.5%)明显高于单一检测(P<0.05)。临床影像学检查提示胆管细胞癌占位性病变的,同时CA19-9、CA24-2联合检测明显升高的患者术后经病理证实均为胆管细胞癌。未复发胆管细胞癌组术后1 w CA19-9、CA24-2水平较术前均明显下降(P<0.05);而术后复发组术后1 w血清CA19-9、CA24-2较术前亦明显下降(P<0.05);术后4 w下降最明显,术后12 w水平回升;姑息手术组手术前后CA19-9、CA24-2水平无显著变化(P<0.05)。结论动态监测血清CA19-9、CA24-2水平变化对于老年胆管细胞癌的临床诊断及术后复发的判断均有重要价值。

EB病毒潜伏膜蛋白2的抗原表位预测及其与HLA等位基因的相关性分析

目的分析EB病毒潜伏膜蛋白2(LMP2)的抗原表位;预测与EBV相关的HLA等位基因并进行分析。方法利用多种生物信息软件分析LMP2的同源性、B细胞抗原表位、T细胞相关表位以及与LMP2蛋白具有高结合力的HLA等位基因;研究该等位基因在中国各地的基因频率,从而推断EB的易感人群。结果EB病毒LMP2蛋白氨基酸序列比较保守,同源性在96.1%~100%之间;可能存在9个B细胞抗原表位,2个CTL细胞表位和2个Th细胞表位;HLA等位基因HLA-A*0201与LMP2结合力较强,在山西、北京、石家庄、天津、江苏、广州地区人群中的基因频率较高。结论预测了EB病毒LMP2蛋白的抗原表位,为EB病毒的疫苗研究和免疫诊断试剂的研制打下基础。HLA-A*0201与EB病毒相关性较高;EB病毒可能在山西、北京、石家庄、天津、江苏、广州地区更易发生传播。

多层螺旋CT增强扫描联合癌胚抗原、糖类抗原24-2、糖类抗原72-4检测对大肠癌术前分期诊断的价值研究

目的:探讨多层螺旋CT(MSCT)增强扫描联合癌胚抗原(CEA)、糖类抗原24-2(CA_(242))、糖类抗原72-4(CA_(724))对大肠癌术前分期诊断的价值。方法:选取大肠癌患者82例为大肠癌组,其中Ⅰ期39例,Ⅱ期24例,Ⅲ-Ⅳ期19例。选取同期进行体检的健康人群82例为健康组。对大肠癌患者进行MSCT检查。对所有研究对象进行血清CEA、CA_(242)、CA_(724)表达水平检测。对患者MSCT图像进行分析,统计分期诊断结果。比较两组CEA、CA_(242)、CA_(724)表达水平。比较不同分期大肠癌患者CEA、CA_(242)、CA_(724)表达水平。比较MSCT、CEA、CA_(242)、CA_(724)单项及联合对大肠癌患者术前分期诊断的价值。结果:MSCT检出大肠癌患者41例,其中Ⅰ期17例,Ⅱ期12例,Ⅲ-Ⅳ期12例。大肠癌组CEA、CA_(242)、CA_(724)表达水平明显高于健康组(均P<0.05)。不同分期大肠癌患者CEA、CA_(242)、CA_(724)表达水平比较差异有统计学意义,且随着临床分期进展呈逐渐上升趋势(均P<0.05)。MSCT联合CEA、CA_(242)、CA_(724)对大肠癌患者术前分期诊断的准确率分别为97.43%(Ⅰ期)、100.00%(Ⅱ期)、100.00%(Ⅲ-Ⅳ期),总检出准确率为98.78%,均高于MSCT、CEA、CA_(242)、CA_(724)单项检查(均P<0.05)。结论:MSCT增强扫描联合CEA、CA_(242)、CA_(724)检测可提高大肠癌患者术前分期诊断的准确性,为临床治疗方案选择提供重要参考信息。

结直肠癌患者血清循环肿瘤细胞、糖类抗原24-2、糖类抗原19-9水平及其与临床病理特征关系

目的:检测结直肠癌患者血清循环肿瘤细胞(CTC)、糖类抗原24-2(CA_(242))和糖类抗原19-9(CA_(199))水平,探讨它们与直肠癌患者不同临床病理特征的关系。方法:收集106例结直肠癌患者作为结直肠癌组,收集结直肠腺瘤患者100例作为结直肠腺瘤组,收集同期健康体检者100例作为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测CTC水平。采用全自动免疫分析仪检测CA_(242)和CA_(199)水平。比较三组研究对象CTC、CA_(242)、CA_(199)水平。比较不同临床病理特征结直肠癌患者CTC、CA_(242)、CA_(199)水平。分析CTC、CA_(242)、CA_(199)与结直肠癌患者不同临床病理特征的相关性。结果:结直肠癌组和结直肠腺瘤组患者CTC、CA_(242)、CA_(199)水平明显高于对照组,且结直肠癌组CTC、CA_(242)、CA_(199)水平明显高于结直肠腺瘤组(均P<0.05)。CTC、CA_(242)、CA_(199)水平在TNM分期为Ⅲ-Ⅳ期、分化程度为低分化、有淋巴结转移和肝转移的结直肠癌患者中明显升高(均P<0.05)。Spearman相关性分析结果显示,CTC、CA_(242)、CA_(199)水平与TNM分期、分化程度、淋巴结转移、肝转移密切相关(均P<0.05)。结论:CTC、CA_(242)、CA_(199)水平在结直肠癌患者中明显升高,且与结直肠癌患者临床病理特征密切相关。

新等位基因HLA-A*24:233与HLA*-A26:89的分析确认

背景:分子生物学新技术的发展和大量应用加快了中国发现HLA新等位基因的步伐。新等位基因的发现不仅给HLA家族增加了新成员,同时也为研究民族或地区的优势基因或消失基因(不适合客观环境的基因)找到了突破点。目的:确认2个新的HLA等位基因,并分析其核苷酸序列。方法:应用PCR-SBT、GSSP测序基因分型技术对两份中华骨髓库供者样本进行HLA高分辨分型,发现2个样本HLA-A位点均为异常基因,与已知同源性最高的等位基因型进行序列比对,分析核苷酸序列的差异。结果与结论:2个样本HLA-A位点与目前已知的相应HLA-A等位基因序列均不一致,样本1与其同源性最高的A*24:02:01的差异表现在第3外显子区域中的第360位碱基由G>C,导致第96位密码子由谷氨酰胺变为组氨酸,样本2与其同源性最高的A*26:01:01比较差异表现在第2外显子区域中第97位碱基由T>C,导致编码的第9位密码子由酪氨酸变为组氨酸。结果表明两个样本为HLA-A位点的新等位基因,已提交GenB ank进行注册,并已被WHO HLA因子命名委员会正式命名为HLA-A*24:233与HLA-A*26:89。

可溶性HLA-A2-肽复合物的体外折叠与生物素化

目的 :可溶性HLA A2 抗原肽复合物的体外折叠复性与生物素化。方法 :原核高效表达的HLAH链及 β2m,在抗原肽 (EB病毒的膜潜伏蛋白LMP2A的NH2 CLGGLLTMV COOH残基 )的存在下 ,通过稀释复性折叠成HLA A2 抗原肽复合物 ,并在BirA酶的作用下进行生物素化 ,使生物素结合到HLA A2 抗原肽复合物中的H链C端。利用特异性抗体 (mAbW6 / 32和兔抗人 β2m抗体 )及链霉亲合素进行ELISA和Westernblot,检测稀释复性和生物素化的折叠产物。结果 :折叠复合物中 ,主要含有HLAH链聚合体、HLA A2 肽复合物单体及 β2m3种成分 ,其中H链聚合体与HLA A2单体可生物素化。结论 :成功地获得生物素化的HLA A2 抗原肽复合物单体 ,为进一步构建四聚体及制备人工抗原提呈细胞奠定了基础 ,也为过程复杂的HLA

HLA-A等位基因与2型糖尿病糖尿病肾病的相关性

目的:探讨2型糖尿病糖尿病肾病的发生与HLA-A等位基因间的关系。方法:利用基因芯片技术,根据HLA不同基因亚型的独特序列设计特异性的寡核苷酸分型探针,制成DNA分型芯片。用带荧光标记的PCR产物与芯片上的探针杂交,再应用特定计算机软件对杂交信号进行分析对比,以此确定样品的基因亚型。结果:天津地区2型糖尿病患者HLA-A2,A11,A24等位基因频率明显高于正常对照组,A33等位基因频率明显低于对照组;2型糖尿病并发肾病患者HLA-A11等位基因频率明显高于无肾病患者,HLA-A34等位基因频率明显低于无肾病患者。结论:HLA-A2,A11,A24可能是2型糖尿病的易感基因,HLA-A33等位基因则可能是2型糖尿病的保护基因;HLA-A11有可能是糖尿病肾病的易感基因,HLA-A34则可能是其保护基因。

猪苓多糖通过调节HuR介导bcl-2表达诱导T24细胞凋亡

目的研究猪苓多糖(polyporus polysaccharide,PPS)对膀胱癌T24细胞凋亡的作用及其机制。方法 T24细胞常规培养后加入不同剂量PPS,利用Hoechst染色、流式细胞术检测PPS对细胞凋亡的影响,利用q RT-PCR检测PPS对T24细胞bcl-2 m RNA表达水平及其稳定性的影响,通过Western Blot法检测PPS对T24细胞bcl-2蛋白、人抗原R(human antigen R,Hu R)蛋白的表达及对Hu R蛋白胞浆及胞核内分布的影响。结果与对照组比较,中、高剂量的PPS作用24 h后,T24细胞凋亡明显增多(P<0.05),bcl-2 m RNA稳定性降低(P<0.05),bcl-2蛋白及m RNA表达减少(P<0.05),总Hu R蛋白没有明显变化,但胞浆Hu R蛋白表达下降(P<0.05),胞核Hu R蛋白表达升高(P<0.05)。结论 PPS可诱导T24细胞凋亡,其作用可能与影响Hu R在细胞内定位,降低bcl-2 m RNA稳定性及减少bcl-2蛋白表达有关。

SBT、SSOP法分析湖北土家族妇女HLA-A2超型各等位基因及与宫颈癌的关联

目的通过检测湖北土家族人群HLA-A2超型(包含A*0201、A*0202、A*0203、A*0204、A*0205、A*0206、A*0207、A*6802、A*6901)各等位基因,分析与宫颈癌关联的等位基因及其结构与功能特点.方法提取湖北土家族正常人群236名育龄妇女及59例原发性宫颈癌患者外周血DNA,采用SBT(sequence based typing)、SSOP(Sequence Specific Oligonucleotide Probes)HLA基因分型技术,对HLA-A2超型各等位基因型进行分型,比较宫颈癌病例组和正常对照组中HLA-A2超型中相应等位基因型构成比的差异,并分析相关等位基因的结构特点.结果有7种HLA-A2超型等位基因HLA-A*0201(17.3%)HLA-A*0202(9.5%)HLA A*0203(1.4%)HLA-A*0204(3.8%)HLA-A*0205(3.1%)HLA-A*0206(10.8%)HLA-A*0207/0215N(9.8%),其中HLA-A*0202和HLA A*0206在正常对照组和宫颈癌病人组的构成比有显著性差异(p＜0.05),HLA-A*0202(OR=0.24,95%CI=0.05～0.48)和HLA A*0206(OR=0.2,95%CI=0.67～1.07)对于宫颈癌发生的易感性有保护作用.结论湖北土家族人群HLA-A*0201所占比例最高达17.3%,HLA-A*0202和HLA-A*0206对于宫颈癌发生的易感性有保护作用.

HLA-A2小干扰RNA的设计及沉默效果检测

背景:人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)是人的主要组织相容性复合物,在移植排斥反应中起关键作用。降低HLA的表达,可以延长移植物的存活时间。目的:设计HLA-A2小干扰RNA,检测其对HLA-A2表达沉默的作用。方法:设计4种HLA-A2 siRNA靶点序列构建其慢病毒表达体系,体外感染HLA-A过表达的293T细胞,观察4种靶点的敲减效率并筛选出有效靶点序列。体外培养人胚肺成纤维细胞,并用携带目的干扰序列的慢病毒感染人胚肺成纤维细胞,荧光显微镜下观察感染效率,应用Western blot检测在人胚肺成纤维细胞中对HLA-A2表达沉默的作用。结果与结论:根据Genbank中HLA-A2的mRNA序列,设计合成了3个小干扰RNA,在体外能有效的沉默HLA-A2在293细胞中的表达,将基因序列亚克隆入干扰载体后感染人胚肺成纤维细胞,也能有效的沉默HLA-A2的表达,效率达80%左右。

CDH17、CA24-2、CA72-4与CEA联合检测对胃癌诊断价值的研究

目的探讨胃癌组织及血清中肝肠-钙黏连蛋白(CDH17)、糖类抗原24-2(CA24-2)、糖类抗原72-4(CA72-4)与癌胚抗原(CEA)的表达水平及临床意义。方法选取石河子大学医学院第一附属医院40例胃癌患者、40例胃良性病变患者及40例健康体检者,采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)和电化学发光法检CDH17、CA24-2、CA72-4、CEA 4项指标在血清中的浓度,采用免疫组化方法观察CDH17、CA24-2、CA72-4、CEA在胃黏膜组织中的表达情况。结果胃癌患者血清CDH17、CA24-2、CA72-4、CEA含量明显高于胃良性病变组及健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05);CDH17、CA24-2、CA72-4、CEA在胃癌组织中的阳性表达率明显高于胃良性病变组及健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05);CDH17、CA24-2、CA72-4、CEA在胃癌患者血清中的含量可以反映其在肿瘤组织中的表达,二者水平呈正相关;联合检测CDH17、CA24-2、CA72-4、CEA在胃癌中的灵敏度和特异度分别为87.5%和81.25%,与单项检测胃癌灵敏度和特异度相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论联合检测肿瘤标志物CDH17、CA24-2、CA72-4、CEA可提高胃癌诊断的灵敏度,有利于胃癌的早期诊断和治疗。

HIV抗原抗体化学发光免疫检测方法的建立及优化

目的:建立并优化HIV抗原抗体化学发光免疫检测方法(CLIA)。方法:采用化学发光免疫的方法,通过对包被条件、HIV酶用量、反应加入量、反应时间和温度等反应参数进行优化,建立HIV抗原抗体联合检测方法,使用HIV国家参考品评价所建立方法的准确性。结果:包被比例取HIV-1抗原1∶5 000、HIV-2抗原1∶1 0000、HIV P24单抗1∶2 000;检测酶比例取Biotin-P24多抗1∶2 000;HRP-HIV-1抗原1∶5 000、HRP-HIV-2抗原1∶20 000、SA-HRP 1∶4 000;待测样本75μL/孔;第一步反应温度和时间分别为37℃和60 min,第二步反应温度和时间分别为37℃和30 min,为检测方法的较佳反应条件。检测国家参考品结果表明,阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、灵敏度和精密性均符合国家参考品标准要求。结论:成功建立了特异、灵敏的HIV抗原抗体化学发光免疫检测方法,为在临床上推广应用提供了科学依据。