一个新的MAGE-1表位为肝癌细胞表面HLA-B7分子递呈

目的 :肿瘤抗原的存在是机体识别肿瘤并激活免疫系统的物质基础 ,机体抗肿瘤免疫以细胞免疫为主 ,故寻找被T细胞识别的肝癌细胞抗原肽 ,为肝癌免疫治疗奠定基础。方法 :对于肝癌细胞系HHCC(HLA A2 ,A2 9,B7,B5 1) ,应用细胞膜酸洗技术使抗原肽从细胞膜表面脱落 ,经过凝胶层析 ,反相高效液相色谱层析得到不同组份多肽 ,高效液相色谱 质谱仪联用技术获得抗原肽的一级结构 ,通过氨基酸锚定位点分析 ,预测其HLA配体类型 ;互联网上氨基酸同源性分析确定其同源性序列 ;人工合成抗原肽 ,HLA同型树突状细胞递呈合成抗原肽刺激特异性CTL反应 ,51Cr杀伤实验检测CTL对肿瘤细胞系的杀伤作用。结果 :经过反相高效液相色谱层析后可以获得 10多个组份 ,其中一个组份经过液质联用鉴定和氨基酸同源性分析确定其序列为EPVTKAEML ,是黑色素瘤抗原 1,MAGE 1(12 1 12 9)表位 ,由HLA B7分子递呈 ,体外诱导实验表明其可以诱导出较强的CTL反应。结论 :液质联用技术是寻找抗原肽的有效方法 ,MAGE 1抗原肽EPVTKAEML对于HLA B7阳性及MAGE

冷冻影响肝癌细胞HLA和B7分子表达的实验研究

目的 探讨冷冻治疗后机体免疫功能提高的机制。方法 应用流式细胞仪检测人肝癌细胞经 0℃或 -2 0℃冷冻后 ,HLA和B7分子表达率和平均荧光强度的变化。结果 0℃组与对照组比较 ,HLA Ⅰ分子和B7 2分子的表达率和平均荧光强度均无明显变化 ;HLA Ⅱ分子和B7 1分子的表达率增高 ,平均荧光强度增强。 -2 0℃组与对照组比较 ,HLA Ⅰ、HLA Ⅱ、B7 1和B7 2分子的表达率均增高 ,平均荧光强度均增强。 -2 0℃组和 0℃组比较 ,HLA Ⅱ和B7 1分子的表达率和平均荧光强度均无显著性差异 ;HLA Ⅰ和B7 2分子表达率均增高 ,平均荧光强度均增强。结论 0℃和 -2 0℃冷冻可增强人肝癌细胞HLA和B7分子的表达 ,这可能是冷冻治疗提高机体免疫功能的机制之一。

人类HLA-B7可诱导启动子调控IRES连接的人TNFα和IFNβ基因的重组逆转录病毒载体的构建

目的:为增强肿瘤细胞表面MHCⅠ类分子表达,并调动免疫系统更有效地抑制和杀伤肿瘤细胞,构建在HLA-B7启动子调控下,IRES连接的人TNFα和IFNβ基因的重组逆转录病毒载体.方法与结果:将TNFαcDNA克隆人pBIuescript sk(+)中,改换酶切位点后定向克隆人含HLA-B7启动子的质粒中,构建成pGL3B7TNF.IFNβcDNA经定向插入pGEM-7Zf(+)改换酶切位点切下,定向克隆人含内部核糖体进入位点(IRES)的质粒中,构建成pIRE-SIFN.B7pro-TNFα和IRES-IFN β基因片段分别于各自载体酶切取出,再次插入中间载体,改换酶切位点后,先后定向插入pBlucscript sk(+)中,构建成pBLB7TNIRIF.用SacI+SalI+PvuI酶切回收B7pro-TNFα-IRES-IFNβDNA片段,补平后平端连入GINa逆转录病毒载体的BamH I补平位点,构建成重组逆转录病毒载体GINNaB7TNIRIF(+),结论:该载体的构建为调控各种肿瘤细胞MHCⅠ类分子增强表达,杀伤和抑制肿瘤研究奠定了基础.

胃癌患者HLA-I、B7-1、β_2m的表达

目的 探讨HLA I、β2 m、B7 1分子在肿瘤发生、发展中的作用。方法 流式细胞技术检测胃肿瘤细胞和外周血淋巴细胞HLA I、β2 m、B7 1分子的表达 ;放射免疫技术 (RIA)检测血清中 β2 m的含量。结果 ①胃癌细胞表面HLA I分子表达明显降低。②胃癌细胞表面B7 1分子表达明显降低或缺如。③β2 m在肿瘤细胞上的表达明显增高 ;作相关分析发现 ,β2 m与HLA I的表达呈负相关关系 (r=- 0 4 70 ,P <0 0 5 )。④在外周血淋巴细胞上各指标的表达情况 ,HLA I表达丰富 ,胃癌患者与正常人之间无显著性差异 ;B7 1的表达微弱 ,胃癌患者的表达低于正常人 ;β2 m的表达丰富 ,胃癌患者的表达高于正常人 ;⑤血清中 β2 m的含量 ,胃癌患者高于正常人 ,血清中 β2 m的含量与外周血淋巴细胞β2 m表达有正相关关系 (r=0 5 4 6 ,P <0 0 5 )。结论 肿瘤细胞低表达HLA I和B7分子是肿瘤发生、发展的重要机制 ;β2 m在肿瘤的诊断、治疗和预后判断有一定价值。

HLA-I分子对B7.1共刺激作用的影响

目的 :研究HLA I分子表达与B7 1分子的共刺激作用的相互关系 ,以探讨在肿瘤细胞所诱发的免疫排斥反应中共刺激分子对抗原递呈机制的影响。方法 :通过流式细胞仪 (FCM)检测转染共刺激分子B7 1编码基因前后其表面HLA I分子的表达情况。利用单克隆抗体阻断细胞表面HLA I分子 ,以外周血混合淋巴细胞对阻断前后的细胞行杀伤实验。结果 :表达B7 1的肝癌细胞其表面HLA I分子表达明显增高 (P <0 0 1) ,而γ INF刺激对细胞表面HLA I分子的表达情况并无影响(P >0 0 5 )。T淋巴细胞对转染后细胞的杀伤作用远远大于未转染组 (P <0 0 1) ,当表面HLA I分子被阻断后 ,T淋巴细胞的杀伤效应几乎降至零点。结论 :转染B7 1后肝癌细胞高表达HLA I分子 ,增强抗原提呈作用的同时又表达第二信号—共刺激分子B7 1,从而可诱发更强的免疫排斥反应。

KBv_(200)细胞株耐药逆转前后HLA、B7抗原的表达

目的 探讨肿瘤多药抗性细胞的免疫逃避机制。方法 利用特异性切割mdr1的核酶为工具，以表达Mdr1的耐药细胞株KBv200为靶细胞，采用脂质体转染技术，将含核酶的质粒pHβApr-1neo/5mR3及空载体pHβApr-1neo导入KBv200及其亲本KB细胞内，运用Northern-blotting、免疫组化方法观察核酶对mdr1 mRNA及P-gp的影响，运用流式细胞仪技术检测各种不同细胞亚株HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ、B7-1、B7-2的表达。 结果 含核酶的质粒pHβApr-1neo/5mR3及空载体pHβApr-1neo可以在KB、KBv200细胞中稳定表达，核酶可以特异性地切割mdr1，导致KBv200/5mR3的mdr1 mRNA含量下降，P 糖蛋白（P-gp）表达减低，各种不同细胞亚株均表达较强的HLA-Ⅰ类抗原，而HLA-Ⅱ、B7-1、B7-2的表达较低。各亚株HLA-Ⅰ表达无明显差异，但HLA-Ⅱ、B7-1、B7-2的表达变化较大，KB的HLA-Ⅱ、B7-1、B7-2的表达较KBv200强，经化疗药物作用后KB的HLA-Ⅱ、B7-2进一步表达增强，核酶逆转后，KBv200/5mR3 HLA-Ⅱ、B7-1、B7-2的表达趋于接近KB水平。 结论 mdr1-核酶在细胞内具有一定的逆转肿瘤多药抗性的生物学效应；多药耐药细胞和敏感株细胞有着不同的免疫逃避特点，与敏感株相比，KBv200较易逃避机体的免疫反应。

急性非淋巴细胞性白血病骨髓白血病细胞B7分子和HLA-DR的检测

目的:检测急性非淋巴细胞性白血病患者骨髓白血病细胞表面MHC-Ⅱ分子和B7共刺激分子的表达情况。方法:采集分离34例初诊或复发的急性非淋巴细胞性白血病患者骨髓细胞,其骨髓中原始细胞比例>70%。应用结合有荧光PE或FITC的单克隆抗体标记骨髓细胞,用流式细胞仪进行HLA-DR、CD80(B7-1)和CD86(B7-2)免疫标记检测。结果:34例患者除M3型外,HLA-DR抗原的表达均较高,其中M2型最高,为(80.14±9.07)%;CD80阳性率均很低,最高为M1型,为(6.34±1.12)%,其余均在1%～4%之间;CD86的表达高于CD80,最高为M5型,为(32.60±4.18)%,最低为M6型,为(12.34±2.36)%。结论:急性非淋巴细胞性白血病细胞表面共刺激分子表达以CD80减低或缺乏为主。

Cloning and expression of HLA-B7 gene

ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮＩｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ，ｉｔｈａｓｂｅｅｎｆｏｕｎｄｔｈａｔＨＬＡＢ７ｐｌａｙｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｔｈｅａｎｔｉｇｅｎｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｈｕｍａｎｔｕｍｏｒｔｈｅｒａ...

组织工程中同种异体角膜移植治疗角膜盲与B7分子的作用

目的:同种异体角膜移植是治疗角膜盲最为有效的方法,而角膜移植排斥反应仍然是移植失败的主要原因。如何防治角膜移植术后排斥反应一直是角膜病研究领域的重点和难点。角膜移植排斥反应是一个T淋巴细胞主导参与的复杂的反应过程。B7分子作为主要的协同刺激分子,在角膜移植免疫排斥反应的发生及其治疗中起着重要作用。资料来源:应用计算机检索Pubmed1990-01/2004-10和Medline1990-01/2004-10的角膜移植与B7分子的相关文章,检索词为“keratoplasty,cornealallograft,cornealtransplant,B7,CD80,CD86”,并限定文章语言种类为English。资料选择:对资料进行初审,选取实验性文献,然后筛除个案报告及经验总结,对剩余的文献开始查找全文,进一步判断是否符合纳入标准。资料提炼:共收集到31篇关于角膜移植与B7分子实验性文献,21篇文章符合纳入标准。资料综合:21个试验包括724个实验样本,分别对应用B7抗体或CT-LA4-Ig等治疗方案进行实验并予以评价。实验结果表明均不同程度抑制或减轻角膜移植排斥反应。结论:B7分子作为T细胞主要的协同刺激分子已逐渐成为角膜盲治疗中移植免疫学研究的热点领域。研究表明:以B7分子等协同刺激分子为耙点阻断T细胞活化的第二信号,可以减轻角膜移植的排斥反应,从而为控制角膜移植治疗?

流式细胞法检测人类白细胞抗原B27/B7表达在诊断强直性脊柱炎中的价值

目的探讨流式法检测人类白细胞抗原B27/B7(HLA-B27/B7)在临床上对强直性脊柱炎(AS)的诊断价值。方法采用两色流式细胞术检测121例AS患者(AS组)、157例其他原因引起的腰腿痛患者(非AS组)和88例健康人(对照组)淋巴细胞HLA-B27及HLA-B7抗原的表达率及表达强度(MnX)。结果 AS组HLA-B27表达率、MnX和阳性率分别为(90.55±25.31)%、(16.87±9.13)%、90.9%,明显高于非AS组及对照组(P<0.05);非AS组上述各项指标与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。将流式细胞法检测HLA-B27表达率、MnX及2项指标联合分别用于临床AS的诊断,灵敏度依次为90.9%、94.2%、98.3%,特异度依次为89.8%、84.5%、83.7%,卡方检验显示,联合检测时灵敏度显著高于单独检测表达率(P<0.05),且特异度差异无统计学意义(P>0.05)。结论流式细胞法检测HLA-B27对AS的诊断和鉴别诊断准确、有效,是一种很有价值的实验诊断方法。

B7共刺激分子在恶性血液病细胞株中的表达特征

目的:探讨B7共刺激分子在人类恶性血液病细胞株中的表达和分布特征。方法:应用流式细胞术检测13种恶性血液病细胞株中B7.1、B7.2、HLA-Ⅰ类和HLA-Ⅱ类分子以及B7-H1、CD279、B7-H3和B7-H4分子的表达及亚细胞定位,另以12例健康志愿者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)作为对照。结果:多数恶性血液病细胞胞膜上低表达或不表达B7.1;表达或高表达B7.2;表达或高表达HLA-Ⅰ类和Ⅱ类分子;B7-H1、CD279、B7-H3和B7-H4等膜蛋白在细胞株中普遍低表达或不表达,其中B7-H3在U937、Maver和Z138细胞株中表达丰度较高。B7-H1、B7-H3和B7-H4胞质蛋白在细胞株中基本不表达,而相应胞核及胞质蛋白则在除CZ1外的细胞中异常表达或高表达。结论:B7共刺激分子在不同类型恶性血液病细胞及同一肿瘤来源细胞株中的表达存在差异,提示其可能参与血液肿瘤的免疫逃逸和发生发展。

人类白细胞抗原-1类抗原B7基因cDNA克隆

采用逆转录 PCR（聚合酶链反应）技术,从人类白细胞抗原-B7（HLA-B7）表型阳性的人外周血淋巴细胞总RNA中克隆了HLA-B7的cDNA（pUC-B7）。经过PCR扩增和酶切片段长度多态性分析,初步判断其序列与文献报道的一致。采用平端连接将 HLA-B7 cDNA片段插入至 pUC19的Sma 1位点上,保留了大部分的酶切位点。为进一步克隆到表达载体上提供了极大的方便。

角膜移植与B7分子

随着角膜移植手术技巧的改进,移植成功率明显提高,移植术后的免疫排斥反应越来越成为移植失败的主要原因。角膜移植免疫排斥反应是一个复杂的反应过程,受多种因素的调节。致敏T淋巴细胞在角膜移植排斥反应中起着重要的作用,是角膜排斥过程中的主要效应细胞。而T淋巴细胞的激活需要两个信号刺激,即除了通过APC递呈MHC处理过的抗原给抗原特异性T细胞提供第1信号外,还需协同刺激分子作为辅助信号的协同作用,才能使T细胞产生正常的免疫应答。如果缺少协同刺激分子的第2信号,将会导致调节性T细胞的无反应性或特异性免疫耐受。随着研究的深入,协同刺激信号已逐渐成为角膜移植免疫学研究的热点领域。B7分子作为重要的协同刺激分子,在角膜移植免疫排斥反应的发生及其治疗中起着重要作用。

B7在血液病细胞系中的表达及对T淋巴细胞的免疫反应

目的探讨B7共刺激分子在人类恶性血液病细胞系中的表达以及激活T淋巴细胞的免疫反应。方法用流式细胞术检测HL-60、NB4、Jurkat、U937、Raji、Daudi、K562等细胞HLA抗原和B7分子表达,同时检测经Ara-C刺激前后B7分子的表达,用RT-PCR方法检测经Ara-C刺激前后激活T淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ mRNA。结果HL-60、NB4、Jurkat、U937、Raji、Daudi、K562等恶性血液病细胞株均表达或高表达HLA抗原和B7-2分子,低表达或不表达B7-1分子,经Ara-C刺激后细胞株B7分子的表达明显增强,并能有效地激活T淋巴细胞表达高水平的IFN-γ mRNA。结论大多数人类恶性血液病细胞株均不表达或低表达B7分子,但是B7-1可能在肿瘤免疫中起重要作用。

HLA-B7可诱导启动子调控TNF-α和IFN-β基因协同增强抗肿瘤效应

目的 将TNF α和IFN β基因导入人肝癌细胞株Liu6和SMMC 772 1,以增强其免疫原性。方法 以腺病毒为载体 ,以IRES连接TNF和IFN基因 ,选择HLA B7可诱导启动子调控其表达。分别用Southern Northernblot和MTT法检测TNF α和IFN β基因的整合、转录与表达。流式细胞仪检测MHCⅠ类分子表达。CTL细胞毒性实验检测T细胞对转染细胞的杀伤作用。细胞增殖实验检测目的基因的表达对肿瘤细胞的抑制作用。结果 TNF α和IFN β基因可整合入转染细胞 ,并被有效转录。转染细胞MHCⅠ类分子的表达比对照组高 3～ 4倍。TNF活性 :Liu6细胞为 3 .778ng ml,SMMC 772 1为2 .0 17pg ml;2 4hIFN最高活性分别为 397.8U 10 6 个细胞和 345 .8U 10 6 个细胞。对照组与实验组在效靶比分别为 5∶1,10∶1,15∶1时 ,CTL细胞毒性实验结果差异均有显著性 (P <0 .0 5 ) ,表明T细胞杀伤作用明显增强。细胞增殖实验结果显示实验组与对照组差异有显著性 (P <0 .0 5 )。目的基因的表达对肿瘤细胞具有一定的抑制作用 ,抑制率分别为 5 .5 %(Liu6 ) ,3.7%(SMMC 772 1)。结论 人TNF α和IFN β基因导入人肝癌细胞株Liu6和SMMC 772 1可明显增加其对TNF、IFN和MHCⅠ类分子的表达 ,增强机体对转染瘤细胞的杀伤作用。

树突状细胞负载肝癌抗原肽疫苗体外诱导特异性免疫学反应的研究

目的 :研究树突状细胞 (dendriticcell,DC)负载肝癌抗原肽EPVTKAEML体外诱导特异性CTL的能力及其抑癌效果。方法 :用顺序特异引物聚合酶链反应技术 (PCR SSP)选择HLA B7表型供者 ,从脾组织中分离、培养DC EPVTKAEML特异性CTL。用51Cr释放法检测CTL的杀伤活性 ,并用抗HLA I分子单抗 (mAb)进行杀伤抑制实验。结果 :找到 4例HLA B7杂合子供者 ,用DC负载HLA B7限制的抗原肽EPVTKAEML可诱导特异性CTL反应 ,对肝癌细胞HHCC有较强的杀伤作用。结论

TNF,IFN,MHCⅠ类分子基因“正反馈”式放大表达的重组腺病毒载体

目的：为使外源性 Ｔ Ｎ Ｆ， Ｉ Ｆ Ｎ 基因和内源性主要组织相容性复合物Ⅰ类（ Ｍ Ｈ ＣⅠ）分子基因表达呈现“正反馈”式放大效 应，构建在 Ｈ Ｌ Ａ Ｂ７ 启动子调控、 Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ连接下协同表达 Ｔ Ｎ Ｆα和 Ｉ Ｆ Ｎβ基因的重组腺病毒载体。方法和结果：从ｐ Ｇ Ｌ３ Ｂ７ Ｔ Ｎ Ｆ及ｐ Ｉ Ｒ Ｉ Ｆ中切下 Ｂ７ｐｒｏ Ｔ Ｎ Ｆ和 Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ Ｉ Ｆ Ｎβ基因片段，先后插入ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｓｋ （＋ ）， 构建成ｐ Ｂ Ｌ Ｂ７ Ｔ Ｎ Ｉ Ｒ Ｉ Ｆ。回收 Ｔ Ｎ Ｆα Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ Ｉ Ｆ Ｎβ基因片段，连入 Ａｄ Ｃ Ｍ Ｖ Ｌｉｎｋ１ 中，构建成 Ｃ Ｍ Ｖ 启动子驱动表达的 Ａｄ Ｃ Ｍ Ｖ Ｔ Ｎ Ｉ Ｒ Ｉ Ｆ（＋ ）。回收 Ｂ７ｐｒｏ Ｔ Ｎ Ｆ Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ Ｉ Ｆ Ｎβ基因片段，连入缺失 Ｅ１ 和 Ｅ３ 区及启动子的 Ａｄ ＢｇｌⅡ中， 构建成 Ｈ Ｌ Ａ Ｂ７ 启动子驱动表达的 Ａｄ Ｂ７ Ｔ Ｎ Ｉ Ｒ Ｉ Ｆ（－ ）。结论：此两种载体为“正反馈”式放大肿瘤免疫原性提供一条新途径。

B7共刺激分子在八种人类恶性血液病细胞系中的表达及意义

目的 探讨B7共刺激分子在人类恶性血液病细胞系中的表达及意义。方法 用质粒DNA的扩增、脂质体介导法转基因 ,流式细胞术、RT PCR等方法检测U937、K5 6 2、CEM、DOUDI、GM、PEER、Jurkat、Raji等细胞转基因前后B7 1分子的表达。结果 U937、K5 6 2、CEM、DOUDI、GM、PEER、Jur kat、Raji等 8种恶性血液病细胞株均表达或高表达HLA抗原和B7 2分子 ,低表达或不表达B7 1分子 ,转基因后细胞株B7分子的表达明显增强 ,转B7 1基因后肿瘤细胞刺激T细胞表达高水平的IL 2mRNA。结论 大多数人类恶性血液病细胞株均不表达或低表达B7分子 ,提示B7 1可能在肿瘤免疫中起主要作用。